冀紫439黑小麦是由澳大利亚黑小麦与我国白粒小麦杂交的一种人工谷物，因其富含非淀粉多糖、花色苷、硒元素、铬元素、多酚类物质，蛋白质、氨基酸含量高，受到研究者及消费者的广泛关注[1]。济麦22小麦是由山东省农业科学院作物研究所研发的高产抗病的小麦品种，种植广泛，加工品质较好[2]。不同品种黑小麦粉稳定时间在2.8 min左右[3-5]，济麦22小麦粉稳定时间在2.7 min左右[2]，Fra
等[6]研究发现黑小麦虽然蛋白质含量高，但难以发酵和烘焙，制作的面包最大体积为439 cm3，仍低于普通小麦粉制作的面包的体积（473 cm3），仅通过黑小麦蛋白质含量无法预测黑小麦的加工品质和面包的制作质量，这大大限制了黑小麦食品的研发与生产。
蛋白质在小麦粉加工中发挥关键作用，根据Osborne分类系统，小麦粉中的蛋白质主要分为清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、醇溶蛋白（溶于70%乙醇）、谷蛋白（溶于稀碱溶液）。清蛋白与球蛋白为小麦可溶性蛋白，清蛋白中赖氨酸含量高、氨基酸组成平衡，对小麦粉营养品质有重要影响，面包体积与清蛋白含量呈负相关，与球蛋白含量呈正相关，可溶性蛋白对小麦粉加工品质也有一定影响[7-8]。醇溶蛋白与谷蛋白为小麦贮藏蛋白，是面筋蛋白的主要组成部分，小麦粉与水作用时，氢键、疏水相互作用、二硫键等分子间作用力促使面筋蛋白形成片状的网络结构来保留面团内部气体，醇溶蛋白主要与面团的黏性及延展性有关，谷蛋白与面团的弹性有关[7，9]。目前，关于黑小麦蛋白特性的研究主要集中在醇溶蛋白亚基及高分子量谷蛋白亚基上，关于蛋白组分及内部化学作用的研究较少[3，10-11]，所以更深层次了解黑小麦蛋白特性对优化黑小麦加工品质有重要作用。
本文选取与冀紫439黑小麦粉质参数相似的济麦22普通小麦作对照，提取面筋蛋白及Osborne分离蛋白组分，分析蛋白内部化学作用对面团结构、黏弹性及馒头的影响，以期为黑小麦后期加工品质提升提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
济麦22小麦：河北省现代农业产业技术体系衡水试验站；冀紫439黑小麦：馆陶县华野庄园；酵母：安琪酵母股份有限公司；电泳标准品：美国伯乐公司；2-β巯基乙醇、过硫酸铵：北京博奥拓达科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷[tris-（hydroxymethyl）-aminomethane，Tris]、甘氨酸（Gly）、5，5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、考马斯亮蓝R-250、G-250：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LMB实验磨粉机：布勒粮食检验仪器无锡有限公司；752N型分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；Mixer S 300N粉质仪、Extensograph-E拉伸仪：德国Brabender公司；JJJM54型面筋数量和质量测定仪：杭州汇尔仪器设备有限公司；DYCZ-28A型单板夹芯式垂直电泳仪：北京六一仪器厂；Nicolet IS10红外光谱仪：美国尼高力公司；SU8020型扫描电子显微镜：日立科学仪器有限公司；TMS-PRO质构仪：美国FTC公司。
1.3 方法
1.3.1 小麦粉的制备
小麦粉由磨粉机磨制而成，将小麦润麦至水分含量为14%左右，出粉率在60%左右。所得小麦粉的粗蛋白含量分别为13.54%（济麦22）和14.83%（冀紫439）。
1.3.2 小麦粉蛋白组分分析
1.3.2.1 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的提取
称取一定量的小麦粉，按照料液比1∶5（g/mL）加入石油醚，磁力搅拌脱脂4 h，将脱脂好的小麦粉抽滤，室温下放置至石油醚完全挥发。利用Osborne法分离提取4种蛋白质[12]，称取50 g小麦粉依次用10倍的去离子水、2 g/100 mL NaCl溶液、70%乙醇、0.01 mol/L NaOH溶液50℃下磁力搅拌1.5 h，4 000 r/min下离心20min，上清液分别为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白溶液，利用考马斯亮蓝法准确测定溶液内蛋白质含量。
1.3.2.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）
电泳采用分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%的凝胶[13]，使用2倍样品稀释液[10%0.5 mol/L Tris-HCl pH6.8，10%甘油，20 g/100 mL SDS，0.1 g/100 mL 溴酚蓝，5%2-β-巯基乙醇]溶解样品，泳道进样量约为10 μg，初始电压为80 V，待样品进入分离胶后，电压改为160 V，电泳完毕后取下凝胶置于固定液（50%乙醇，10%冰乙酸）中，2 h后取出凝胶置于0.25 g/100 mL考马斯亮蓝R-250染色液染色2 h后脱色，直到蛋白质条带清晰，采用Quantity One 4.6.2软件对亚基分子量进行分析。
1.3.3 面筋蛋白的提取及分析
面筋蛋白的提取采用手洗法，根据马福敏[14]的方法并稍加修改，取50 g小麦粉，加26 mL 2 g/100 mL NaCl溶液揉成面团，用蒸馏水不断揉洗直至用碘试剂检测不变蓝，揉洗后，将乳状液过100目筛，面片及小面团冲洗后加入面筋中。将洗好的面筋蛋白冻干，磨制成粉末备用。
1.3.3.1 面筋蛋白二级结构的测定
称取一定量的蛋白质样品与溴化钾混合（质量比1∶100），用研钵磨制成均匀粉末，压制成薄片，然后于红外光谱仪中进行全波长（400 cm-1～4 000 cm-1）扫描，光谱仪分辨率4 cm-1，信噪比50 000∶1，扫描64次。利用OMNIC截取酰胺Ⅰ带区域（1 600 cm-1～1 700 cm-1）图谱，利用PeakFit v4.12软件对此区域先基线校正，Gaussian去卷积，再由二阶导数拟合，确定各个子峰与各二级结构的对应关系，然后根据各子峰所占面积计算出各部分二级结构所占的比例[15]。
1.3.3.2 面筋蛋白分子间作用力的测定
参照Wang等[16]的方法并稍作修改，称取4组0.09g面筋蛋白样品，分别加入1.5 mL 0.05 mol/L NaCl溶液（SA）、0.6 mol/L NaCl溶液（SB）、0.6 mol/L NaCl溶液+1.5 mol/L尿素溶液（SC）、0.6 mol/L NaCl溶液+8 mol/L尿素溶液（SD），混合并振荡5 min，室温下振荡1 h，在12 000 r/min下离心20 min，取上清液用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白质含量，SB与SA中蛋白质含量之差为离子键的贡献，SC与SB中蛋白质含量之差为氢键的贡献，SD与SC中蛋白质含量之差为疏水相互作用的贡献。
1.3.3.3 巯基和二硫键的测定
1）游离巯基的测定
称取100mg面筋蛋白，加入10mLTris-Gly-8mol/L尿素溶液和50μLDTNB溶液，迅速混合后在25℃下避光保温30 min，样品取出在4 000 r/min下离心10 min，取上清液，利用分光光度计测定其在412 nm下的吸光度，同时测定空白值[17]。
2）总巯基的测定
称取10 mg面筋蛋白，加入1 mL Tris-Gly-10 mol/L尿素溶液和0.02 mL β-巯基乙醇迅速混合后在25℃下保温1 h，再加10 mL 12%的三氯乙酸，继续保温1 h，样品取出在4 000 r/min下离心10 min，沉淀用10 mL 12%三氯乙酸洗涤并离心，重复2次。弃去上清液，在沉淀中加入3 mL Tris-Gly-8 mol/L尿素溶液和0.03 mL DTNB溶液，迅速混合后在25℃下避光保温30 min，取上清液测其在412 nm下吸光度，同时测定空白值[17]。
式中：SHfree为游离巯基含量，μmol/g；SHT为总巯基含量，μmol/g；S-S 为二硫键含量，μmol/g；73.53=106/（1.36×104），1.36×104是 Ellman 试剂的摩尔消光系数；A412为λ=412 nm下的吸光度；D为稀释倍数；C为样品的蛋白质最终浓度，mg/mL。
1.3.4 面筋及流变学指标的测定
湿面筋含量及面筋指数根据GB/T 5506.2—2008《小麦和小麦粉面筋含量第2部分：仪器法测定湿面筋》、LS/T 6102—1995《小麦粉湿面筋质量测定法——面筋指数法》测定，粉质特性参照GB/T 14614—2019《粮油检验小麦粉面团流变学特性测试粉质仪法》的方法测定，拉伸特性参照GB/T 14615—2019《粮油检验小麦粉面团流变学特性测试拉伸仪法》的方法测定。
1.3.5 面团微结构的观测
将样品固定于样品台，采用戊二醛将样品固定，离子溅射仪真空干燥、铂金喷镀，电镜的工作电压设置为5 kV，最后置于扫描电子显微镜上拍摄图片，设置不同拍摄倍数，多角度拍摄。
1.3.6 馒头质量评估
参照GB/T 35991—2018《粮油检验小麦粉馒头加工品质评价》制作馒头，制作好的馒头盖上纱布放置1 h后，测定其径高比、比容及质构特性。
参照Sun等[18]的方法进行质构特性的测定，馒头切成20 mm的薄片，形变量为50%，检测速度为60 mm/min，启始力为5N，重复测试，选取5组取平均值。
1.4 数据处理与统计分析
数据统计采用Excel 2010软件，采用SPSS 25.0软件进行ANOVA差异性分析，用Origin 9.0软件作图。
2 结果与讨论
2.1 蛋白组分含量分析
济麦22和冀紫439小麦粉各蛋白组分含量分析结果见图1。
图1 各蛋白组分含量分析
Fig.1 Content of various proteins
不同字母表示同一指标不同品种间差异显著，P＜0.05。
由图1可知，两种小麦粉中水不溶性蛋白（醇溶蛋白及谷蛋白）的总量要比水溶性蛋白总量多。由4种蛋白含量排序可知，小麦粉中谷蛋白含量最高，与Dupont等[19]的研究结果一致。冀紫439小麦粉与济麦22小麦粉相比，冀紫439小麦粉在清蛋白、谷蛋白含量上显著高于济麦22，醇溶蛋白含量无显著差别，球蛋白含量显著降低。冀紫439中谷蛋白∶醇溶蛋白比例为2.33∶1，济麦22中谷蛋白∶醇溶蛋白比例为1.98∶1，谷蛋白含量增多导致冀紫439谷蛋白与醇溶蛋白比例显著高于济麦22。水溶性蛋白中，清蛋白含量增高易对成品品质产生不利影响[8]。面筋蛋白中，谷蛋白对面团强度及面团组分影响作用强，谷蛋白含量增多在一定程度上对面团弹性及流变学特性产生有利的影响。Zhang等[20]研究发现，醇溶蛋白含量与普通小麦所制北方馒头评分呈负相关，谷蛋白含量馒头评分呈正相关，谷蛋白与醇溶蛋白比例与馒头的感官评分显著相关。但徐小青[21]研究发现，谷蛋白与醇溶蛋白比例过大也会对小麦粉加工品质产生不利的影响。由此看来，黑小麦蛋白组分是影响黑小麦加工品质的一个重要因素。
2.2 蛋白亚基分析
小麦粉及其蛋白组分SDS-PAGE图见图2。
图2 小麦粉及其蛋白组分SDS-PAGE图
Fig.2 SDS-PAGE of wheat flour and the protein constituents
泳道1为marker；泳道2、3分别为济麦22小麦粉、冀紫439小麦粉；泳道4、5为济麦22、冀紫439的清蛋白；泳道6、7为济麦22、冀紫439的球蛋白；泳道8、9为济麦22、冀紫439的醇溶蛋白；泳道10、11为济麦22、冀紫439的谷蛋白。
由图2可知，由于基因型的差别，冀紫439与济麦22蛋白条带差别较大，具体分子量的差异表现：在75 kDa～100 kDa，济麦 22 第三条亚基为 81 kDa，冀紫439缺少这一条带；在50 kDa～75 kDa，冀紫439比济麦22多1条亚基，为69 kDa；为更深入对比研究黑小麦与白粒小麦蛋白组分，对两种小麦4种蛋白组分同时进行SDS-PAGE分析。结果表明，济麦22与冀紫439清蛋白亚基分布有很大差异，具体表现为济麦22的45、31 kDa两条亚基，冀紫439的35 kDa亚基。球蛋白亚基分布类似。醇溶蛋白亚基主要分为α/β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白，α/β 醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白亚基分布于28 kDa～35 kDa，ω醇溶蛋白亚基分布于40 kDa～75 kDa[22]。冀紫439检测到高分子量黑小麦醇溶蛋白，黑小麦醇溶蛋白包括高分子量黑小麦醇溶蛋白、γ-75k黑小麦醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白、γ-40k黑小麦醇溶蛋白，高分子量黑小麦醇溶蛋白对面团的黏弹性产生负面的影响[10]，黑小麦中高分子量黑小麦醇溶蛋白遗传自黑麦基因，与其谷蛋白有相同的迁移率[3]。谷蛋白分为高分子量谷蛋白亚基及低分子量谷蛋白亚基，高分子量亚基谷蛋白分布于65kDa～90kDa，低分子量亚基谷蛋白分布于30kDa～45kDa[22]。由图2可看出，谷蛋白分子量较高，二硫键还原后，主要亚基为低分子量谷蛋白亚基，高分子量谷蛋白亚基属于次要亚基。济麦22小麦粉与冀紫439小麦粉相比，冀紫439缺少89 kDa高分子量谷蛋白亚基和28 kDa低分子量谷蛋白亚基条带。部分低分子量谷蛋白亚基和高分子量谷蛋白亚基通过链间二硫键连接，高分子量谷蛋白亚基形成一个弹性网络，作为与其它蛋白相互作用的骨架[23]，黑小麦与普通小麦亚基的差异，尤其是高分子量谷蛋白亚基的差异或可造成两种小麦粉加工品质的差异。
2.3 面筋蛋白分析
2.3.1 化学相互作用分析
面筋蛋白间化学相互作用分析结果见图3。
图3 面筋蛋白间化学相互作用分析
Fig.3 Chemical interaction of gluten proteins
不同字母表示同一指标不同品种间差异显著，P＜0.05。
影响蛋白质结构和性质的主要有离子键、氢键、疏水相互作用及二硫键。通过盐离子将2种小麦粉的离子键打破，分析得济麦22与冀紫439相比，冀紫439中离子键含量显著增高，氢键含量显著降低，疏水相互作用差异不显著。离子键含量均小于1 mg/mL，在面团中作用微弱，氢键是蛋白质链内或链间的作用力之一，与水与其他物质之间的作用有关，面团中糖类及极性脂均能影响氢键含量，疏水相互作用主要影响蛋白质分子中的亚基的连接，使蛋白质在极性强的水中聚集折叠到一起，使蛋白质内部更加稳定[24-25]，氢键的减少不利于冀紫439面筋蛋白网络结构的稳定。
二硫键属于共价键的一种，在肽链内可以起到连接氨基酸的作用，同时在链间也起着连接不同肽链的作用，二硫键的存在对稳定面筋网络起着重要作用[26]。对两种小麦粉进行比较，济麦22的总巯基含量及二硫键含量均高于冀麦439黑小麦，二硫键的增加在一定程度上能赋予济麦22面团更好的网络结构。
2.3.2 二级结构分析
面筋蛋白二级结构占比分析结果见图4。
图4 面筋蛋白二级结构占比分析
Fig.4 Proportions of secondary structure elements of gluten proteins
不同字母表示同一指标不同品种间差异显著，P＜0.05。
红外光谱中酰胺Ⅰ带（1 600 cm-1～1 700 cm-1）主要与蛋白质的二级结构有关。每个子峰与二级结构的对应关系：1 648 cm-1～1 664 cm-1为 α-螺旋，1 615 cm-1～1 637cm-1和 1682cm-1～1700cm-1为 β-折叠，1664cm-1～1 681 cm-1为 β-转角，1 637 cm-1～1 648 cm-1为无规卷曲[15]。冀紫439与济麦22相比，α-螺旋、β-转角增加，β-折叠减少。β-折叠结构对面筋蛋白网络结构的稳定性有重要的影响，面筋蛋白聚合物通过分子间二硫键和β-折叠保持稳定[27]。Li等[28]研究发现β-折叠结构向α-螺旋、β-转角结构转化很可能是因为氢键的变化导致蛋白质水合作用增大，蛋白质-蛋白质间的相互作用减弱，不利于面筋蛋白网络结构的稳定。因此，黑小麦面筋蛋白的理化特性与其二级结构和氢键等化学相互作用密切相关。
2.4 小麦粉面筋指标与流变学指标分析
小麦粉面筋指标与流变学指标分析结果见表1和表2。
表1 面筋及粉质特性分析
Table 1 Gluten and farinograph properties
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
品种 湿面筋含量/% 面筋指数/% 粉质指标形成时间/min 稳定时间/min 吸水率/% 弱化度/BU济麦 22 33.67±2.48b 35.76±4.32b 2.37±0.07b 2.86±0.05a 65.40±0.14a 68.00±0.00a冀紫 439 37.30±0.02a 43.15±0.86a 2.65±0.04a 2.90±0.07a 65.60±0.14a 66.00±1.41a
表2 拉伸特性
Table 2 Extensograph properties
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
品种拉伸面积/cm2拉伸阻力/BU延伸度/mm拉伸比例/（BU/mm）45 min 90 min 45 min 90 min 45 min 90 min 45 min 90 min 135 min济麦 22 30.00±1.41b33.50±2.12b 104.00±5.65b114.00±4.24b 178.50±2.12a185.50±4.95a 0.60±0.00b0.60±0.00b0.65±0.07a冀紫 439 40.00±0.00a41.50±3.53a 131.00±0.00a136.50±3.53a 175.50±0.70a177.50±2.12a 0.70±0.00a0.80±0.00a0.85±0.07a 135 min 37.00±2.82b 40.50±3.53a 135 min 116.00±11.31b 141.50±0.70a 135 min 187.00±2.82a 165.50±9.19a
由表1可知，冀紫439与济麦22相比，面筋指数与湿面筋含量显著升高，面筋指数与谷蛋白含量呈正相关[29]，根据GB/T 17320—2013《小麦品种品质分类》对小麦粉根据稳定时间分类，济麦22和冀紫439小麦粉稳定时间均＜3 min，同属于弱筋小麦粉，与Pattison等[3]测定的黑小麦的稳定时间（＜2.7 min）相似。虽然粉质指标差异不大，但蛋白质含量相差1.29%，冀紫439小麦粉蛋白质含量较高，湿面筋含量、面筋指数较高。由表2可知，醒发时间为45 min和90 min时，冀紫439拉伸面积、拉伸阻力、拉伸比例显著高于济麦22，但延伸度略低于济麦22，徐小青[21]研究指出麦谷蛋白∶麦醇溶蛋白比例增加会造成面团强度及耐搅拌特性增大，但延伸度降低，Zhu等[30]研究得出蛋白质含量增加在一定程度上会造成延伸度减小，馒头比容减小，这与黑小麦谷蛋白∶醇溶蛋白比例高，蛋白质含量高研究结果一致。
2.5 面团微结构
面团微结构见图5。
图5 面团扫描电子显微镜图
Fig.5 Scanning electron micrograph of dough
a为济麦22小麦粉面团；b为冀紫439小麦粉面团。拍摄倍数为1 000倍。
由图5可知，济麦22与冀紫439小麦粉相比，冀紫439小麦粉结构更加致密，可延展的面筋蛋白覆盖了所有的淀粉颗粒，无明显的孔洞。济麦22小麦粉制成的面团结构疏松，大量淀粉暴露在面筋蛋白表面，两者面团结构有较大差异，这可能是对其面制品品质造成影响的重要原因，还需进一步分析。
2.6 馒头品质
馒头感官品质及质构特性见表3。
表3 馒头感官品质及质构特性
Table 3 Sensory quality and texture properties of steamed bread
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
品种宽高比比容/（mL/g）硬度/N回复性内聚性弹性/mm咀嚼性/mJ济麦 22 小麦粉 1.27±0.09a 2.76±0.04a 22.24±1.23b 1.37±0.02b 0.46±0.01a 2.55±0.35b 26.42±4.26b冀紫 439 小麦粉 1.15±0.06a 2.66±0.06a 34.42±2.44a 0.36±0.01a 0.47±0.02a 3.58±0.37a 58.41±8.04a
从表3中可以看出，冀紫439黑小麦所制馒头宽高比为满分，比容接近满分，适合加工成馒头。从质构特性分析，黑小麦馒头的硬度、咀嚼性、弹性更大，济麦22的馒头回复性大。在对黑小麦发酵制品研究中，刘瑞等[31]将运黑161黑小麦和运旱618白粒小麦馒头进行对比发现，运黑161黑小麦的馒头硬度是运旱618普通小麦的2倍，咀嚼性是其4.6倍。黑小麦馒头普遍存在嚼劲大的特点。这可能是因为在发酵过程中，随时间的延长，黑小麦面团的延展性降低，最终导致面团气孔较小且紧密，馒头的内部结构相较于普通小麦也更加紧实。同时，较高的谷蛋白含量也会赋予面团更高的咀嚼性及抗撕裂性[32]，造成黑小麦馒头咀嚼性显著高于普通小麦馒头。
3 结论
本试验通过比较冀紫439黑小麦与济麦22普通小麦的蛋白组分及亚基、面筋蛋白的二级结构及分子间作用力来探讨粉质参数相似下黑小麦与普通小麦面筋质量及馒头的差异。从结果分析黑小麦蛋白特性对加工品质的影响主要体现为谷蛋白∶醇溶蛋白比例过高，会造成发酵过程中面团的延展性变差，馒头硬度提升、咀嚼性增大；从亚基组成及分布来看，冀紫439中高分子量谷蛋白亚基条带数量少且存在高分子量黑小麦醇溶蛋白，均不利于面团的黏弹性；面筋蛋白的二级结构中，冀紫439的β-折叠含量显著低于济麦22，不利于面筋蛋白的稳定性；冀紫439小麦粉氢键、二硫键作用较济麦22低，而二者主要促进面筋蛋白聚合和维持面筋网络稳定。因此，基于冀紫439与济麦22蛋白组分、亚基组成、二级结构、分子间作用力的差异所带来的面团紧实、馒头嚼劲大的结果，确定下一步的研究方向为通过物理改性或酶法修饰来改善黑小麦发酵面制品的适口性。
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