谷胱甘肽（glutathione，GSH）即 γ-谷氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸，是由3种氨基酸（谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸）在谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合酶的连续作用下合成的非蛋白硫醇三肽[1]，具有保护细胞抵抗氧化性损害，维持胞内稳态的重要作用[2-4]。GSH广泛应用于食品[5-7]、化妆品[8]和医药[9-12]等工业领域，可作为抗氧化剂和调味剂，能够有效防止食品的褐变、保持食品独特风味[13-16]，也可以作为自由基清除剂，具有保护肾脏、增强肝脏解毒能力的功效[17-18]。
微生物发酵法是目前工业化生产GSH最普遍的方法[19-20]，然而GSH作为一种胞内产物，在发酵下游提取GSH的生产力和经济效益无法有效满足市场需求，在一定程度上制约其产业化发展，若发酵菌株胞内GSH能有效分泌至胞外，则可以在发酵液中直接制备纯化GSH，简化提取工艺，降低下游分离纯化GSH的难度，从而提高GSH的生产力。近年来，如何获得产胞外GSH的发酵菌株受到国内外学者的关注[21]。如利用基因工程技术来增强发酵菌株对GSH的胞外运输作用[22-24]，或是通过改善细胞膜通透性促进谷胱甘肽的外泌与积累。但构建胞外发酵谷胱甘肽工程菌的改造成本和技术要求较高，且细胞膜通透性的调节为有机试剂化学渗透法[25]，考虑到对菌株生长活性和环境的影响，此方法不宜应用在工业化生产。
利用传统紫外诱变育种技术，不仅能简便快速地筛选得到目的菌株，而且能确保突变株遗传稳定性[26]，然而目前研究报道中，通过紫外诱变只筛选出胞内高产谷胱甘肽的突变株，未得到产胞外谷胱甘肽的突变株[27-29]。因此，本研究以酿酒酵母（Saccharmyces Cerevisiae）GAQ4为出发菌株，采用紫外迭代诱变，选育出发酵产胞外谷胱甘肽且遗传稳定的突变株，并通过优化其发酵条件进一步提高胞外GSH产量，为GSH胞外发酵策略和实现GSH胞外发酵工业化生产提供新的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GAQ4：湖北工业大学教育部重点实验室工业发酵，湖北省协同创新中心A610实验室保藏菌株。
葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂粉、磷酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1-庚烷磺酸钠、谷胱甘肽（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；甲醇（色谱级）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1D型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；ZSD-12全自动生化培养箱：上海智城分析仪器有限公司；ZHWY系列双层恒温培养振荡器：中国科学院武汉科学仪器厂；LC-20AD型高效液相色谱仪：日本岛津公司；Sartorius普及型PH计（PB-10）：赛多利斯（上海）贸易有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 培养方法
种子液体培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH值自然。
种子固体培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，琼脂粉20 g/L，pH值自然。
发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸铵8 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，硫酸镁0.15 g/L，pH值自然。
种子培养：取甘油管保藏的菌悬液接入种子培养基中，于温度30℃、摇瓶转速180 r/min条件下进行培养。
发酵培养：取处于对数生长期的种子液，以体积分数为10%接种量接入发酵培养基，于温度30℃、摇瓶转速180 r/min条件下培养。
1.3.2 紫外诱变
诱变过程：将15 W紫外灯预热20 min。取处于对数生长期的种子菌悬液，将菌悬液稀释至细胞数为107CFU/mL～108CFU/mL，取 200 μL 稀释液涂布至种子固体培养基后，立即将培养基平板放置距离紫外灯30cm处进行紫外照射，照射时间分别为10、20、30、40、50、60 s，每组设置3个平行，照射结束后立即将平板倒置于30℃培养箱避光培养，统计各平板生长的单菌落数。将未经紫外照射的稀释菌悬液涂布在固体培养基后避光培养，作为对照组。计算紫外诱变致死率，以紫外照射时间为横坐标，紫外诱变致死率为纵坐标，绘制紫外诱变致死曲线。诱变致死率计算公式如下。
紫外迭代诱变：以菌株胞外GSH含量为筛选指标，对出发菌株GAQ4进行紫外迭代诱变处理，即下一次诱变以上一次诱变后筛选得到符合筛选指标的突变株为出发菌株，再次进行诱变筛选。每次诱变的试验组设置3个平行，以获得足够突变株数量，提高正向突变率。每一次紫外诱变均需绘制紫外诱变致死曲线，以便选择各代诱变菌株最适诱变剂量。
遗传稳定性试验：为确认获得的目的菌株具有良好的遗传稳定性，将筛选得到的目的菌株连续传代8次，并对第1代、第4代和第8代进行发酵培养，以出发菌株GAQ4为对照，检测对比发酵产胞外谷胱甘肽含量。
1.3.3 发酵条件单因素试验
以胞外GSH含量为指标，采用单因素试验研究发酵周期、摇瓶装液量、初始pH值和发酵温度、摇瓶转速对突变株摇瓶发酵产胞外GSH含量的影响，试验水平分别为发酵周期 24、36、48、60、72 h；摇瓶装液量50、75、100、125、150 mL/300 mL；初始 pH 值 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；发酵温度 26、30、34、38、42 ℃；摇瓶转速 120、140、160、180、200 r/min。对突变株摇瓶发酵条件进行优化，各因素设置3个平行，取平均值，确定最优摇瓶发酵条件。
1.3.4 生物量的测定
取一定体积菌悬液于8 000 r/min离心5 min后收集湿菌体，用无菌水洗涤菌体3次后，置于65℃烘箱烘干至恒重，称量得到细胞干重，生物量计算公式如下。
生物量/（g/L）=细胞干重（g）/菌悬液体积（L）
1.3.5 谷胱甘肽的测定
利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定 GSH 含量[30]，色谱条件：色谱柱Inertsil ODS-SP C18，流动相为庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液（1-庚烷磺酸钠6.8 g，磷酸二氢钾2.2 g，用磷酸调节pH 3.0，超纯水定容至1 L）和甲醇（磷酸盐缓冲液与甲醇体积比为90∶10），流速为1.0 mL/min，进样量20 μL，紫外检测波长为210 nm。
称取谷胱甘肽标品10 mg，用超纯水定容至10 mL，分别稀释到浓度为 200、400、600、800、1 000 mg/L，用HPLC法检测出不同GSH溶液浓度对应的峰面积，以GSH浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制HPLC法检测标准曲线（如图1），得到标准曲线回归公式为y=18 045x+168 919，R2=0.999 3，以此进行 GSH 含量的计算。
图1 HPLC法检测谷胱甘肽的标准曲线
Fig.1 Standard curve of glutathione determined by HPLC
2 结果与分析
2.1 诱变育种结果
2.1.1 出发菌株GAQ4胞外GSH含量
对出发菌株GAQ4进行摇瓶发酵培养48 h后，检测得到其胞外谷胱甘肽含量为7.37 mg/L，以出发菌株胞外谷胱甘肽含量为指标，与诱变得到突变株产胞外谷胱甘肽含量进行对照。
2.1.2 紫外诱变筛选结果
以胞外GSH含量为筛选指标，根据1.3.2的方法对出发菌株GAQ4进行紫外迭代诱变处理。第1次紫外诱变筛选结果见图2。
图2 第1次紫外诱变结果
Fig.2 Results of first UV mutagenesis
A.第1次紫外诱变致死曲线；B.第1次诱变后突变株筛选结果。
如图2A所示，根据第1次紫外诱变致死曲线，随着紫外照射时间的延长，诱变致死率逐渐升高。在紫外照射时间为30 s时，出发菌株致死率达到74.5%，处于高概率正向突变的致死率范围内，选择紫外照射30 s作为第1次紫外诱变的剂量。
第1次紫外照射处理后共挑取出200个单菌落，以发酵后具有较高胞外谷胱甘肽含量为指标，从初筛菌株中挑选出15株突变株（图2B），其中突变株UV1-6胞外谷胱甘肽含量为13.87 mg/L，相比出发菌株胞外谷胱甘肽含量提高了88.20%，选择突变株UV1-6继续进行紫外诱变筛选。
以突变株UV1-6为第2次紫外诱变的出发菌株，第2次紫外诱变筛选结果见图3。
图3 第2次紫外诱变结果
Fig.3 Results of second UV mutagenesis
A.第2次紫外诱变致死曲线；B.第2次紫外诱变后突变株筛选结果。
由图3A可知，突变株在紫外照射30 s时菌体致死率为78.6%，在相同诱变剂量下与前一次诱变效果相比，致死率提高，仍选取紫外照射30 s诱变剂量进行第二次诱变处理。
由图3B可知，经第2次紫外诱变筛选，从中挑选出胞外谷胱甘肽含量相对较高的14株突变株，其中筛选得到的突变株UV2-2胞外谷胱甘肽含量为16.10 mg/L，比出发菌株GAQ4和突变株UV1-6胞外谷胱甘肽含量分别提高了118.45%、16.08%。
继续对突变株UV2-2进行第3次紫外诱变处理，结果见图4。
图4 第3次紫外诱变结果
Fig.4 Results of third UV mutagenesis
A.第3次紫外诱变致死曲线；B.第3次紫外诱变后突变株筛选结果。
由图4A可知，相同诱变剂量作用后，第3次紫外诱变的致死率明显提高，当紫外照射10 s时致死率达到69.5%，紫外照射20s时致死率为81.9%，因此选取照射15 s作为第3次诱变处理时间。经过筛选得到11株胞外GSH含量较高突变株。由图4B可知，第3次诱变筛选得到的突变株UV3-10胞外GSH含量为19.08 mg/L，相比出发菌株、突变株UV1-6和突变株UV2-2胞外GSH含量分别提高了158.89%、37.56%和18.51%。
通过以上分析，第3次诱变的正向突变效果不如前两次明显，筛选出的突变株中仅有少量突变株的胞外谷胱甘肽含量提高，部分突变株含量甚至低于第3次诱变前，且在相同诱变剂量作用下的紫外诱变致死率逐渐提升，超出处于高概率正向突变的致死率范围内，因此不再进行第4次诱变筛选，选取3次紫外诱变筛选得到的突变株UV1-6、UV2-2、UV3-10进行下一步试验。
2.1.3 遗传稳定性结果
将3次紫外诱变筛选获得的突变株UV 1-6、UV 2-2、UV 3-10连续传代8次，分别测定第1代、第4代和第8代发酵培养后胞外谷胱甘肽含量，结果见表1。
表1 突变株遗传稳定性检测结果
Table 1 Genetic stability determination of mutants
菌株胞外GSH含量/（mg/L）第1代 第4代 第8代GAQ4 7.37±0.18 7.21±0.23 7.26±0.19 UV1-6 13.87±0.19 12.51±0.63 13.63±0.37 UV2-2 16.10±0.88 15.76±0.23 15.98±0.46 UV3-10 19.08±0.08 18.54±0.34 18.56±0.43
在突变株传至第8代时，突变株UV 3-10胞外谷胱甘肽含量最高，为18.56 mg/L，且突变株UV 3-10发酵产胞外谷胱甘肽的性能具有一定的遗传稳定性，因此选择突变株UV 3-10作为目的菌株。
2.2 发酵条件优化
突变株UV3-10在原始摇瓶发酵条件，即摇瓶装液量100 mL/300 mL、发酵初始pH值为自然、发酵温度30℃、转速180 r/min的发酵条件下，突变株胞外GSH含量为18.56 mg/L，生物量为5.64 g/L。分别对突变株发酵条件的发酵周期、摇瓶装液量、初始pH值、发酵温度、摇瓶转速进行单因素优化试验。发酵周期对目的菌株UV3-10产胞外谷胱甘肽的影响见图5。
图5 发酵周期对目的菌株UV3-10产胞外谷胱甘肽的影响
Fig.5 Effect of fermentation cycle on extracellular GSH production by UV3-10
由图5可知，突变株胞外谷胱甘肽含量随着发酵时间的延长呈先上升后下降的趋势。在发酵时间为48 h时，胞外谷胱甘肽含量为18.97 mg/L，随着发酵时间继续延长，胞外谷胱甘肽含量开始下降，因此选取48h为发酵时间，在此基础上进一步优化其他发酵条件。
摇瓶装液量对目的菌株产胞外谷胱甘肽的影响见图6。
图6 摇瓶装液量对目的菌株产胞外谷胱甘肽的影响
Fig.6 Effect of shake flask volume on extracellular GSH production by UV3-10
由图6可知，当摇瓶装液量为75 mL/300 mL时，目的菌株胞外谷胱甘肽含量最高，随着摇瓶装液量逐渐增加，胞外谷胱甘肽含量开始下降，摇瓶装液量过高，影响摇瓶中的溶氧量从而影响目的菌株的发酵性能，故选择最佳摇瓶装液量为75 mL/300 mL。
突变株摇瓶初始pH值优化结果见图7。
图7 初始pH值对目的菌株产胞外谷胱甘肽的影响
Fig.7 Effect of initial pH on extracellular GSH production by UV3-10
当发酵初始pH值从5.0升至6.0时，胞外谷胱甘肽含量变化不大，而pH值增至6.5时胞外谷胱甘肽含量迅速增高到36.42 mg/L，随着pH值上升胞外谷胱甘肽含量又开始下降，在pH 6.5时胞外谷胱甘肽含量达到最大值，因此选择最佳初始pH值为6.5。
发酵温度对目的菌株产胞外谷胱甘肽的影响见图8。
图8 发酵温度对目的菌株产胞外谷胱甘肽的影响
Fig.8 Effect of fermentation temperature on extracellular GSH production by UV3-10
由图8可知，发酵温度对目的菌株胞外谷胱甘肽含量的影响高于其他因素，发酵温度适当升高对突变株分泌胞外谷胱甘肽有促进作用[31]。随着发酵温度的升高，胞外谷胱甘肽含量也在不断增加，当发酵温度升至34℃时，胞外谷胱甘肽含量达到40.63 mg/L，是发酵温度30℃时胞外谷胱甘肽含量的1.68倍。若发酵温度继续升高，胞外谷胱甘肽含量不再增加，温度升至42℃时突变株胞外谷胱甘肽含量仅为17.15 mg/L，此时生物量降至最低，仅有3.16 g/L。因此，选择发酵温度34℃为最优发酵温度。
摇瓶转速对目的菌株产胞外谷胱甘肽的影响见图9。
图9 摇瓶转速对目的菌株产胞外谷胱甘肽的影响
Fig.9 Effect of shaking speed on extracellular GSH production by UV3-10
摇瓶溶氧量受到摇瓶装液量和转速的影响，摇瓶转速产生的剪切力、传质速度以及装液量的大小对菌株的接种量、生长状态和发酵产物的合成与积累均有影响，由图9可知，当摇瓶转速为140 r/min时，胞外谷胱甘肽含量最高，目的菌株产胞外谷胱甘肽含量为52.05 mg/L，是优化前胞外谷胱甘肽含量的2.80倍。
经上述摇瓶发酵条件优化后，突变株在摇瓶装液量75 mL/300 mL、发酵初始pH值6.5、发酵温度34℃、转速140 r/min时，发酵48 h后，胞外GSH含量达到52.05 mg/L，是优化前胞外GSH含量的2.80倍。
3 讨论与结论
本研究利用紫外迭代诱变法，筛选出能产胞外GSH的突变株UV3-10，其胞外GSH含量为18.56 mg/L，通过单因素试验得到其最优摇瓶发酵条件为发酵周期48 h、装液量75 mL/300 mL、发酵初始pH值6.5、发酵温度34℃、转速140 r/min，经过摇瓶发酵条件优化后突变株胞外GSH含量为52.05 mg/L，是优化前胞外GSH含量的2.80倍。
关于突变株UV3-10的胞外分泌机制提出以下猜想：诱变处理后的突变株细胞通透性发生改变，即诱变后使某种GSH输出蛋白的活性得到加强，或者抑制了某种GSH降解蛋白的活性，使酵母细胞胞内物质向胞外特异性溢出，在正常发酵条件下产生了GSH胞外积累的现象。后续研究可探究突变株的谷胱甘肽运输蛋白及GSH合成酶系的活性与其胞外分泌机制的关联性，另外，在发酵下游如何维持胞外GSH稳定性也是有待研究的问题。
突变株UV3-10能将胞内合成的GSH分泌至胞外，实现了胞外GSH的有效积累，使在发酵液中进行GSH工业化制备的可能性大大提升，相较于胞内GSH的提取，其纯化分离难度降低，节省生产成本和能源消耗。另外，酿酒酵母又是食品安全生产菌株，备受食品研发者们的青睐，酿酒酵母发酵生产胞外GSH的研究结果为其在食品加工、贮藏保鲜以及功能性调味品等方面的应用提供了新前景和经济效益。
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