近年来，越来越多的研究证明咖啡因具有兴奋心脏、骨骼肌和中枢神经系统、抗氧化、舒张血管、松弛平滑肌等生理作用[1-4]，广泛存在于瓜拿纳、马黛茶、咖啡树、茶树、可乐树、代茶冬青树和可可树的叶片和果实中[5-6]。茶叶是咖啡因的主要来源之一，茶叶中咖啡因的含量占干物质的2%～5%，咖啡因是茶叶中重要的功能成分[7-8]。
咖啡因作为一种传统的中枢神经系统兴奋剂，是世界上应用较为广泛的精神类药物，日常生活中的茶叶、咖啡、可可饮料、巧克力以及一些软饮料等食品中均含有咖啡因[9-10]，其获取方法主要是从天然作物中进行提取或人工合成[11-14]。从茶叶中提取咖啡因的常用方法有醇提法、水提法、超临界二氧化碳流体提取法、微波辐射法、恒压滴液漏斗代替索氏提取器提取法等[15]，但这些提取方法的提取率和纯度普遍偏低。目前测定咖啡因提取物纯度的方法较多，有薄层色谱法[16-18]、紫外分光光度法[17]和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[19]等。薄层色谱法是一种微量分离方法，其分离速度较快，但存在无法定量和重现性不好等问题。紫外分光光度法利用了咖啡因结构中嘌呤环具有共轭双键体系并能产生独特吸收光谱的特点，但紫外分光光度法容易受到提取物中其他嘌呤碱的干扰，较纯咖啡因的测定才可用紫外分光光度法[20]。本研究讨论茶叶中咖啡因的5种提取方法[无水乙醇回流提取浓缩-升华法、丙酮水溶液提取-氯仿萃取法、无水乙醇回流提取浓缩-二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解-冻干法、超声提取-二氯甲烷萃取法、盐酸水溶液浸提-二氯甲烷萃取法]，再利用高效液相色谱法测定提取物中咖啡因的含量，根据测定结果比较和分析不同提取方法的优缺点，为茶叶产品开发和深加工过程中咖啡因的分析检测提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
散装茶叶（云南省凤庆县大叶种茶）：市售；咖啡因标准品（纯度＞98%）：中国食品药品检定研究院；无水乙醇、丙酮、氯仿、硫酸钠、二氯甲烷、盐酸、氢氧化钠、正己烷、活性炭粉（均为分析纯）：天津大茂化学试剂厂；氧化钙、DMSO、三氟乙酸（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：美国Sigma公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-WO-3L恒温水油浴锅：河南郑州巩义市予华仪器有限责任公司；N-1300V-W型旋转蒸发仪：日本Eyela/东京理化器械公司；FD-1A-50T型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；SK5200HP型超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司；ME204T型电子天平：上海梅特勒－托利多仪器有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）：安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 无水乙醇回流提取浓缩-升华法
称取5 g散装茶叶研细均匀，用滤纸包好放入索氏提取器中，然后向250 mL圆底烧瓶中加入70 mL无水乙醇和几粒沸石，95℃油浴加热、回流提取3 h，保持回流速度均衡。然后改装成蒸馏装置，蒸馏浓缩提取液至适量（1/10体积），将残液趁热倒入蒸发皿中，加入4 g氧化钙，在水浴锅上80℃蒸干，并不断搅拌、压碎块状物。然后用小火焙炒片刻至除去水分。冷却后，擦去蒸发皿上的粉末，用封闭电炉178℃加热升华，收集得到的咖啡因并称重（提取方法1）。
1.3.2 丙酮水溶液提取-氯仿萃取法
称取5 g散装茶叶研细均匀，加入30%丙酮水溶液70 mL提取2次，每次30 min，合并提取液，用旋转蒸发仪40℃减压浓缩至适量（2/3体积），在经正己烷萃取2次后的水相中加入4%硫酸钠溶液10 mL，用活性炭吸附10 min。氯仿萃取2次，合并有机相，旋转蒸发仪40℃减压浓缩回收氯仿，收集得到的咖啡因后干燥并称重（提取方法2）。
1.3.3 无水乙醇回流提取浓缩-DMSO溶解冻干法
称取5 g散装茶叶研细均匀，放入100 mL单口圆底烧瓶中，再加入75mL无水乙醇。在85℃恒温水浴锅中回流提取3 h，稍微冷却后抽滤，滤液用旋转蒸发仪55℃回收乙醇并浓缩至适量（1/10体积）。浓缩液用DMSO溶解，加入转子，放在油浴锅中85℃进行蒸馏，得到含有DMSO和咖啡因的混合液。将混合液置于-80℃超低温冰箱中预冻4 h以上，冻干机预冷至-48℃，冻干过程中真空度维持在（4±3）Pa，持续冻干72 h以上。经冷冻干燥处理后，收集咖啡因并称重（提取方法3）。
1.3.4 超声提取-二氯甲烷萃取法
称取5 g散装茶叶研细均匀，置于250 mL圆底烧瓶中，加入75 mL无水乙醇，搅拌使溶剂完全浸润茶叶，接冷凝回流装置，在恒温加热磁力搅拌器上100℃加热煮沸10 min，然后置于超声清洗器中，超声浸提30 min，冷却，经减压抽滤后分离残渣得到粗提取物。用旋转蒸发仪55℃回收乙醇并浓缩至适量（1/10体积），加10 mL水溶解后用活性炭吸附10 min，并加入NaOH调节溶液pH值至12左右。用二氯甲烷萃取2次，合并有机相，旋转蒸发仪37℃回收二氯甲烷，收集得到的咖啡因，干燥并称重（提取方法4）。
1.3.5 盐酸水溶液浸提-二氯甲烷萃取法
称取5 g散装茶叶研细均匀，置于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL 2%的盐酸水溶液浸湿，搅拌浸提20 min，静置分层，取上层清液，加入NaOH调节pH值至12左右，用二氯甲烷萃取2次，合并有机相，旋转蒸发仪37℃回收二氯甲烷，收集得到的咖啡因，干燥并称重（提取方法5）。
1.3.6 标准系列溶液的配制
准确称取咖啡因标准品5 mg（精确至0.01 mg），置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容并摇匀制得标准品储备液（1 mg/mL）。精密吸取对照品咖啡因标准品储备液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为10、20、40、60、80、100、120 μg/mL 的系列标准液。上述系列浓度标准液经0.45 μm微孔过滤膜过滤后，HPLC进样分析，以标准品系列浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.7 供试品的制备
精密称取5种不同提取方法得到的咖啡因各5mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容并摇匀，放置30 min制得1 mg/mL样品液，将方法1～5提取的咖啡因样品液编号为A～E。分别精密吸取A～E样品液（1 mg/mL）1 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得到0.1 mg/mL的各咖啡因供试品。
1.3.8 色谱条件
色谱柱：AgilentZORBAXSB-C18柱（5μm×4.6mm×250 mm）；流动相 A：甲醇（0 min：10%→10 min：50%→20 min：70%→25 min：90%），流动相 B：水（0 min：90%→10 min：50%→20 min：30%→25 min：10%）；流速：1 mL/min；柱温：25℃；进样量：5 μL；检测波长：280 nm。
1.4 数据统计与分析
色谱图采用Origin Pro 8.5制作，提取率、线性试验、回收率和精密度试验数据由Office Excel软件处理，数据为3次测定的平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 不同方法提取咖啡因的颜色、形状及提取率比较
5种提取方法从茶叶中提取咖啡因的结果见表1。
表1 不同方法提取的咖啡因颜色、形状及提取率比较
Table 1 The color and shape of caffeine extracted by different methods and the extraction rate were compared
提取方法 茶叶质量/g 颜色及形状 咖啡因质量/mg 提取率/%1 5.03±0.02 白色针状晶体 35.47±0.33 0.70±0.01 2 5.03±0.01 白色粉末状 68.37±0.37 1.36±0.02 3 5.04±0.02 白色丝状 55.40±0.24 1.10±0.02 4 5.04±0.02 白色粉末状 25.50±0.16 0.51±0.02 5 5.07±0.03 白色粉末状 36.10±0.33 0.71±0.01
由表1可知，5种提取方法得到的咖啡因颜色及形状均较好；同等质量的茶叶，由于提取方法不同，咖啡因的提取率不同，而且差别较大。就上述5种提取方法而言，方法2和方法3的提取率相对较高，方法1、方法4与方法5的提取率偏低，其原因是方法4与方法5提取时间较短，延长提取时间会提高咖啡因的提取率，但超声与盐酸溶液辅助提取会增加杂质含量，提取时间不宜过长；方法1在升华过程中由于温度较难控制，使部分咖啡因在升华过程中碳化损失，部分咖啡因晶体掉落在氧化钙粉末表面以及结晶在蒸发皿器壁上较难收取。
2.2 HPLC测定咖啡因纯度比较
2.2.1 线性试验、定量限和检出限
对1.3.6配制的标准系列溶液进行HPLC检测，线性试验结果如表2所示，以咖啡因标准溶液质量浓度为横坐标（C，μg/mL），信号响度峰面积为纵坐标（A），建立标准曲线，该方法线性回归方程为A=12.59C+172.84，相关系数r为0.999 9，测定咖啡因的含量在浓度10 μg/mL～120 μg/mL呈现良好的线性关系。以3倍信噪比（S/N）计算检出限，10倍信噪比（S/N）计算定量限。方法的检出限为2.51 μg/g，定量限为7.87 μg/g。
表2 线性试验结果
Table 2 Results of linear experiment
项目浓度C/（μg/mL）峰面积A 1 10 298.68±2.20 2 20 420.00±2.53 3 40 680.04±4.11 4 60 932.72±2.66 5 80 1 180.87±1.53 6 100 1 426.36±0.12 7 120 1 685.18±1.62
2.2.2 检测结果与纯度比较
各咖啡因样品供试品进行HPLC检测，检测结果与咖啡因标准品图谱对照结果见图1。
图1 5种方法提取的咖啡因与咖啡因标准品高效液相色谱对照
Fig.1 The five methods were compared with the caffeine standard by HPLC
由图1可知，A～E的高效液相色谱中的保留时间与咖啡因标准品的保留时间几乎一致，且杂质出峰数较少。保留时间、峰面积和纯度比较见表3。
表3 高效液相色谱保留时间与峰面积比较
Table 3 The retention time and peak area of HPLC were compared
注：A为方法1咖啡因提取物；B为方法2咖啡因提取物；C为方法3咖啡因提取物；D为方法4咖啡因提取物；E为方法5咖啡因提取物。
样品编号 保留时间/min 峰面积A 纯度/%咖啡因标准品（1 mg/mL）10.950 A（0.1 mg/mL） 10.932±0.018 1 312.88±4.16 90.54±0.33 B（0.1 mg/mL） 10.933±0.011 1 400.06±3.03 97.47±0.24 C（0.1 mg/mL） 11.002±0.010 1 373.34±2.24 95.35±0.18 D（0.1 mg/mL） 10.964±0.012 1 345.52±2.84 93.14±0.23 E（0.1 mg/mL） 10.998±0.011 1 473.37±2.54 103.29±0.20
由表3可知，样品A～E咖啡因纯度均＞90%。由于采用外标法测定样品纯度，存在方法误差与系统误差，其中样品E的纯度最高达103.29%，在一定的误差范围内，样品E接近咖啡因标准品纯度；样品A纯度最低，为90.54%，分析其原因为方法1无水乙醇回流提取浓缩-升华法在咖啡因升华结束后的收取过程中容易掺杂其他杂质，从而略微影响咖啡因的纯度。经过HPLC检测确认了5种不同提取方法的提取效果良好，均能从茶叶中获得纯度良好的咖啡因，HPLC方法准确性较高，能准确分析不同提取方法提取的茶叶咖啡因之间的纯度差异。
2.2.3 精密度试验
分别取 1.3.6 配制的 40、80、120 μg/mL 咖啡因标准溶液按照1.3.8的色谱条件测定峰面积，分别重复测定6次，峰面积的RSD分别为0.31%、0.54%、0.61%，均小于1%，表明HPLC仪器精密度良好。
2.2.4 回收率试验
精密吸取已知含量的A～E样品液（1 mg/mL）各1 mL并置于10 mL容量瓶中，每个样品各3份，分别加入 10 μg/mL 咖啡因标准液 0.5、1、2 mL（即加入 5、10、20 μg咖啡因标准品）并用甲醇定容至10 mL。每个加标量设置3个平行试验，HPLC测定并记录峰面积，计算平均回收率，结果见表4。
表4 回收率试验结果
Table 4 Results of recovery experiment
注：A为方法1咖啡因提取物；B为方法2咖啡因提取物；C为方法3咖啡因提取物；D为方法4咖啡因提取物；E为方法5咖啡因提取物。
序号 本底值/（μg/100 μg）加标量/（μg/100 μg）测得平均值/（μg/100 μg）平均回收率/%RSD/%A 90.5 5 95.30 96.07 0.97 10 100.42 99.23 0.96 20 111.62 105.60 1.31 B 97.5 5 102.34 96.73 1.53 10 108.00 104.97 1.59 20 116.44 94.70 0.42 C 95.3 5 99.92 92.47 0.74 10 105.74 104.37 0.58 20 116.87 107.87 0.38 D 93.1 5 97.88 95.60 1.20 10 102.44 93.43 1.14 20 113.47 101.85 0.67 E 103.3 5 108.42 102.33 2.77 10 114.21 109.07 0.11 20 122.59 96.47 0.78
从表4可知，5种咖啡因样品的平均回收率为92.47%～109.07%，RSD为0.11%～2.77%，表明方法的准确度和精密度较高，适用于咖啡因提取物的检测分析。
3 讨论与结论
提取方法1为从茶叶中提取咖啡因的传统方法，耗费时间过长，无水乙醇易挥发且索氏提取器易破碎，成本较高。本文用此方法所得咖啡因的纯度和提取率都不高，原因在于此方法的关键是升华温度的控制，这直接影响到了咖啡因的提取率和咖啡因纯度。提取方法2采用丙酮水溶液作为咖啡因提取剂，丙酮水溶液提取增大了咖啡因的溶出率，氯仿萃取能除去大部分极性低的化合物，咖啡因纯度较高。提取方法3采用在水浴锅中直接冷凝回流提取咖啡因，比起提取方法1的索氏提取器方法，操作要简单方便，但用此方法提取的咖啡因纯度不太高，仅为95.3%。提取方法4采用超声辅助的方法从茶叶中提取咖啡因，简化了提取操作且咖啡因纯度较好，但是超声辅助提取咖啡因一方面缩短提取时间，而另一方面又限制提取时间不能过长，原因是超声时间过长会增大茶叶中杂质的溶出率，咖啡因与杂质较难分离，影响咖啡因纯度。提取方法5在5种试验方法中操作较为简便、耗时短，但是与方法4相似，酸溶液辅助提取过程中需要严格控制提取时间，不然会影响咖啡因的提取率和纯度，因此，通常需要探索酸溶液提取时间对咖啡因得率和纯度的影响。
利用建立的高效液相色谱法分析5种提取方法从茶叶中提取的咖啡因提取物，能准确分析出不同提取物之间的差异，每种方法都各有优缺点，方法不同导致咖啡因的提取率和纯度也有一定差异，但5种提取方法总体上都能达到一般实验室提取咖啡因的要求。5种提取方法相比较而言，萃取法较为简便易行，耗时较短，升华法和DMSO溶解-冻干法对仪器和操作要求较高，评价3种萃取法的经济适用性及结合绿色化学的发展理念，提取方法2的丙酮水溶液提取-氯仿萃取法提取咖啡因效果最佳，咖啡因提取率为1.36%，咖啡因纯度能达到97.47%。
本研究建立的咖啡因高效液相色谱分析法具有准确性好和精密度高等优点，可用于咖啡因提取物中咖啡因含量的检测。
[1] 郑吉文,马会杰,谢瑾,等.茶树品种铁观音和金萱引种云南茶叶品质成分的比较研究[J].云南农业大学学报(自然科学),2018,33(1):106-112.ZHENG Jiwen,MA Huijie,XIE Jin,et al.Comparative study on the tea quality components between tieguanyin and Jinxuan of oolong tea plant varieties introduced into Yunnan[J].Journal of Yunnan A-gricultural University(Natural Science),2018,33(1):106-112.
[2] AWWAD S,ISSA R,ALNSOUR L,et al.Quantification of caffeine and chlorogenic acid in green and roasted coffee samples using HPLC-DAD and evaluation of the effect of degree of roasting on their levels[J].Molecules(Basel,Switzerland),2021,26(24):7502.
[3]LIMA-SILVA A E,CRISTINA-SOUZA G,SILVA-CAVALCANTE M D,et al.Caffeine during high-intensity whole-body exercise:An integrative approach beyond the central nervous system[J].Nutrients,2021,13(8):2503.
[4]RYAN É B,YAN J H,MILLER N,et al.Early death of ALS-linked CHCHD10-R15L transgenic mice with central nervous system,skeletal muscle,and cardiac pathology[J].iScience,2021,24(2):102061.
[5] 李海霞,陈榕,周丹,等.咖啡因的合成及其药理作用的研究进展[J].华西药学杂志,2011,26(2):182-187.LI Haixia,CHEN Rong,ZHOU Dan,et al.Research progress on synthesis and pharmacological action of caffeine[J].West China Journal of Pharmaceutical Sciences,2011,26(2):182-187.
[6]ZAPATA F J,REBOLLO-HERNANZ M,NOVAKOFSKI J E,et al.Caffeine,but not other phytochemicals,in mate tea(Ilex paraguariensis St.Hilaire)attenuates high-fat-high-sucrose-diet-driven lipogenesis and body fat accumulation[J].Journal of Functional Foods,2020,64:103646.
[7] 黄业伟,徐欢欢,王素敏,等.不同茶叶中所含结合咖啡因比例的分析[J].云南农业大学学报(自然科学),2015,30(2):228-233.HUANG Yewei,XU Huanhuan,WANG Sumin,et al.Analysis of combined caffeine proportion in different tea[J].Journal of Yunnan Agricultural University(Natural Science),2015,30(2):228-233.
[8] 刘念,李摇摇,李霜.茶叶脱咖啡因技术的研究进展[J].食品研究与开发,2021,42(24):218-224.LIU Nian,LI Yaoyao,LI Shuang.Research progress of decaffeination technology in tea[J].Food Research and Development,2021,42(24):218-224.
[9]YOUNGBERG M R,KARPOV I O,BEGLEY A,et al.Clinical and physiological correlates of caffeine and caffeine metabolites in primary insomnia[J].Journal of Clinical Sleep Medicine,2011,7(2):196-203.
[10]ALVI S N,HAMMAMI M M.Validated HPLC method for determination of caffeine level in human plasma using synthetic plasma:Application to bioavailability studies[J].Journal of Chromatographic Science,2011,49(4):292-296.
[11]查玉琴,付映林,王杰,等.茶叶中咖啡因的提取方法[J].广东化工,2020,47(3):97,107.ZHA Yuqin,FU Yinglin,WANG Jie,et al.Extraction of caffeine from tea leaves[J].Guangdong Chemical Industry,2020,47(3):97,107.
[12]王文权,胥鑫萌,张雨佳.茶叶中咖啡因的提取工艺研究进展[J].四川化工,2020,23(6):17-19,22.WANG Wenquan,XU Xinmeng,ZHANG Yujia.Research progress on extraction technology of caffeine from tea leaves[J].Sichuan Chemical Industry,2020,23(6):17-19,22.
[13]黄艳,陈浩,莫建光.天然咖啡因与人工合成咖啡因的鉴别[J].安徽农业科学,2015,43(7):316-317.HUANG Yan,CHEN Hao,MO Jianguang.Identification of natural and synthetic caffeine caffeine[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2015,43(7):316-317.
[14]DIUKOVA A,WARE J,SMITH J E,et al.Separating neural and vascular effects of caffeine using simultaneous EEG-FMRI:Differential effects of caffeine on cognitive and sensorimotor brain responses[J].NeuroImage,2012,62(1):239-249.
[15]王船英.茶叶中咖啡因提取技术研究[J].生物化工,2020,6(4):160-162.WANG Chuanying.Research progress of caffeine extraction from tea[J].Biological Chemical Engineering,2020,6(4):160-162.
[16]黄丹.薄层色谱法在药品分析中的应用研究[J].化学工程与装备,2009(8):139-140.HUANG Dan.The application of thin layer chromatography in pharmaceutical analysis[J].Chemical Engineering＆Equipment,2009(8):139-140.
[17]孙延春,张英.紫外光谱法测定饮料中的咖啡因含量[J].化学研究,2011,22(1):77-79.SUN Yanchun,ZHANG Ying.Determination of caffeine in beverages by ultraviolet spectrophotometry[J].Chemical Research,2011,22(1):77-79.
[18]丁明珍,邹建凯.离心萃取-紫外光谱法测定可乐饮料中咖啡因的含量[J].分析化学,2008,36(3):381-384.DING Mingzhen,ZOU Jiankai.Centrifugal extraction procedure for the ultraviolet spectrophotometric determination of caffeine in beverages[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2008,36(3):381-384.
[19]董树国,陆钊.高效液相色谱法测定绿茶饮料中的咖啡因含量[J].广东化工,2011,38(12):136-137.DONG Shuguo,LU Zhao.Determination of caffeine concentration of green tea beverage by high performance liquid chromatography[J].Guangdong Chemical Industry,2011,38(12):136-137.
[20]高海荣,陈秀丽,杨玉珍,等.超声萃取-紫外分光法快速测定茶叶中咖啡因[J].食品研究与开发,2015,36(8):73-76.GAO Hairong,CHEN Xiuli,YANG Yuzhen,et al.The rapid detection of caffeine in tea by ultrasonic extraction and UV spectrophotometry[J].Food Research and Development,2015,36(8):73-76.