食用酵素是指以动物、植物及菌类为原料，经微生物发酵而制得的具有特定生物活性成分的可食用产品[1]。食用酵素口感清爽酸甜，含有糖类、酶类（脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等）及有机酸类等对人体有益的活性物质，具有清除自由基、抗菌消炎、抗衰老、净化血液等功能[2]。发酵过程不仅可以改善产品风味、增加色泽、减少刺激性物质，还可以产生黄酮类、有机酸等新的活性成分。目前关于食用酵素体外抗氧化性能的研究较多，如Li等[3]采用酿酒酵母菌和植物乳杆菌发酵的苹果酵素总黄酮含量比原苹果汁增加了87.76%，维生素C含量增加至1.02 mg/100 mL，清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力、超氧阴离子自由基（·O2－）清除能力和铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）均增强；Kwaw等[4]发现植物乳杆菌发酵的桑葚酵素总酚含量明显增加，其抗氧化性能与总酚含量正相关；金哲宁等[5]研究发现沙棘酵素3个抗氧化活性指标（羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力）均随发酵时间的延长而增强，且与总游离氨基酸含量和总酸含量呈极显著正相关（P＜0.01）；高庆超等[6]发现黑果枸杞酵素含有13种有机酸，以琥珀酸、醋酸和乳酸为主，总有机酸含量比原黑果枸杞增加了110.39%，并认为黑果枸杞酵素体外抗氧化活性主要受有机酸、总黄酮、花青素、维生素和总酚的影响。
野生樱桃李（Prunus cerasifera）为蔷薇科李属落枝灌木或小乔木，是一种珍稀的野生果树种质资源，其野生种在我国仅分布于新疆伊犁霍城县婆罗科努山的大西沟和小西沟[7]，被列为国家Ⅱ级重点保护植物。野生樱桃李果实含有氨基酸、有机酸、黄酮、多糖、多酚及维生素等物质，可抗氧化、抗菌、治疗便秘和促进伤口愈合[8-10]，被当地居民称之为“雪域圣果”，具有天然的保健功能和较高的开发潜力。然而，由于野生樱桃李果实采收后不易贮存，目前主要加工为果酱、果汁、果酒等低附加值产品。随着我国酵素产业的快速发展，将野生樱桃李开发为酵素类功能性食品具有很高的经济价值。目前关于野生樱桃李酵素的研究鲜有报道，由于野生樱桃李有机酸含量高、糖酸比较低，需要外源添加糖类物质提升口感，而外源糖的添加对发酵过程有重要影响。此外，野生樱桃李果皮也含有花色苷、多酚等物质，表现出良好的抗氧化活性[11-12]，因此本研究以野生樱桃李果肉和果皮为主要原料，采用自然发酵法制备不同糖添加量的6种野生樱桃李果肉酵素和果皮酵素，测定6种酵素的功能成分及含量，并考察其体外抗氧化性能，以期为野生樱桃李酵素的研发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生樱桃李：2020年9月采摘于新疆伊犁霍城县大西沟，由伊犁师范大学生物与地理科学学院任艳利副教授鉴定为蔷薇科野生樱桃李果实，样本存于伊犁师范大学化学与环境科学学院天然产物研究室；冰糖（一级品）：市售；芦丁标准品（纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；没食子酸标准品（纯度≥98%）、蒽酮试剂、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，4，6-三（2-吡啶基） 三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：长沙市如吉生物科技有限公司；D-无水葡萄糖标准品（纯度≥98%）、福林酚试剂：上海士锋生物科技有限公司；水溶性维生素E（Trolox）：上海麦克林生化科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、浓硫酸、无水碳酸钠、氢氧化钠、三氯化铝、邻苯二甲酸氢钾、氯化钾、氯化铁、水杨酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢、无水乙醇、甲醇（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津分析仪器厂；DD-5M低速离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；FA2104电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；PHS-3F酸度计：上海精科仪器有限公司；WYA-2S阿贝折射仪：上海精密科学仪器厂；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SY-2000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DW-86W28超低温冰箱：浙江捷盛低温设备有限公司；HH-S1数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 野生樱桃李酵素的制备
野生樱桃李紫色鲜果用无菌水洗涤后，晾干水分，去皮、去核，将果肉和果皮分别打浆、晒干、研磨后得到果肉干粉和果皮干粉，称取果肉干粉3份，每份均为180 g，置于发酵坛中，发酵坛预先于121℃条件下灭菌20 min，加入占总质量10%、20%、30%的冰糖，再分别加入无菌水1 000 mL，密封，编号分别为R10（10%糖添加量果肉酵素）、R20（20%糖添加量果肉酵素）、R30（30%糖添加量果肉酵素）。果皮酵素同果肉酵素的制备方法一致，编号分别为P10（10%糖添加量果皮酵素）、P20（20%糖添加量果皮酵素）、P30（30%糖添加量果皮酵素）。
以上所有操作在无菌工作台进行，发酵坛置于培养箱25℃避光发酵90 d。发酵结束后，分别取10.00 mL酵素液，每种酵素取3个平行样，过滤后，4 000 r/min离心7 min，取上清液置于-80℃超低温冰箱冷冻保存，使用时提前取出解冻至25℃待测。
1.3.2 未发酵野生樱桃李提取液的制备
参考文献[9]的方法并稍作修改，分别称取野生樱桃李果肉干粉和果皮干粉180 g，置于500 mL圆底烧瓶中，加入300 mL 60%乙醇，设置水浴锅温度70℃，回流90 min，提取3次后合并提取液过滤，滤液4 000 r/min离心7 min，经旋转蒸发仪浓缩至无醇味，浓缩得浸膏，定容于1 000 mL容量瓶中，摇匀，得未发酵果肉提取液（编号为CK1）和未发酵果皮提取液（编号为CK2），分别取10.00 mL未发酵果肉和果皮提取液，每种提取液取3个平行样，置于-80℃超低温冰箱冷冻保存，使用时提前取出解冻至25℃待测。
1.3.3 总黄酮含量的测定
采用NaNO2-Al（NO3）3法测定总黄酮含量[13]。准确移取0.50 mL样品溶液置于25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.50 mL，静置5 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.50 mL，摇匀静置5 min后加入4%NaOH溶液4.00 mL，摇匀后用60%乙醇定容，25℃条件下放置15 min后，测定在510 nm波长处的吸光度。配制芦丁标准溶液，加入试液测定吸光度得标准曲线方程：y=0.028 88x-0.000 79，R2=0.999 45。测得的样品吸光度代入回归方程计算样品中总黄酮含量。
1.3.4 总糖含量的测定
参考文献[10]中的方法，采用硫酸-蒽酮法测定。准确移取各样品溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，加入6.00 mL的硫酸-蒽酮溶液，摇匀后沸水浴15 min，随后于冰水浴冷却至25℃，测定在625 nm波长处的样品吸光度。配制葡萄糖标准溶液，加入试液测定吸光度得标准曲线方程：y=0.044 42x-0.006 05，R2=0.999 55。测得的样品吸光度代入回归方程计算样品中总糖含量。
1.3.5 总酚含量的测定
采用福林酚法测定总酚含量[14]。准确移取各样品溶液1.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入12.00 mL蒸馏水、1.00 mL福林酚溶液，摇匀后静置6 min，加入2.00 mL0.1%Na2CO3溶液，摇匀后用蒸馏水定容至刻度线，摇匀后静置30 min，在765 nm波长处测定吸光度。配制没食子酸标准溶液，加入试液测定吸光度得标准曲线方程：y=0.084 73x-0.017 62，R2=0.999 31。测得的样品吸光度代入回归方程计算样品中总酚含量。
1.3.6 总酸及可溶性固形物含量的测定
总酸的含量参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[15]进行测定；可溶性固形物的含量参考GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》[16]进行测定。
1.3.7 抗氧化性能的测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的测定
参考文献[17]中的方法并稍作修改，测定DPPH自由基清除能力。用甲醇作溶剂配制浓度为76 μmol/L的DPPH溶液，将野生樱桃李酵素样品配制成质量浓度为 1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mg/mL 的溶液，加入 9.00 mL DPPH溶液，摇匀后避光静置30 min，在517 nm波长处测定吸光度。称量相同质量浓度的未发酵野生樱桃李果皮、果肉提取液和对照L-抗坏血酸溶液，用相同方法测定3种样品的DPPH自由基清除率。计算公式如下。
DPPH自由基清除率/%=[（A空白-A样品）/A空白]×100
式中：A空白为1 mL甲醇和9 mL DPPH溶液混合后的吸光度；A样品为样品测定管的吸光度。
1.3.7.2 ·OH清除能力的测定
参考文献[18]中的方法并稍作修改，测定·OH清除能力。向试管中依次加入0.50 mL样品、1.00 mL H2O2溶液、0.60 mL水杨酸钠溶液和1.00 mL硫酸亚铁溶液，37℃条件下恒温水浴1 h，以蒸馏水为空白，在562 nm波长下测定样品吸光度。用相同方法测定对照L-抗坏血酸溶液对·OH的清除率。计算公式如下。
·OH 清除率/%={[A空白-（A样品2-A样品1）]/A空白}×100
式中：A空白为空白试样的吸光度；A样品1为不加H2O2显色剂的样品溶液本底吸光度；A样品2为加H2O2显色剂的样品吸光度。
1.3.7.3 总抗氧化能力的测定
参考文献[19]中的方法并稍作修改，采用铁离子抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）法测定总抗氧化能力。分别配制10 mmol/L TPTZ盐酸溶液、pH3.6的0.1 mol/L醋酸盐缓冲溶液和20 mmol/L氯化铁溶液，将3种溶液按照体积比1∶10∶1混匀后即得溶液为FRAP工作液。准确移取0.20 mL样品溶液置于比色管中，加入5.00 mL FRAP工作液，摇匀后，避光条件下放置90 min，于593 nm波长处测定样品吸光度。用不同浓度Trolox标准溶液重复以上操作，以不同浓度Trolox标准溶液吸光度为纵坐标，Trolox标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程：y=6.509 5x+0.021 41，R2=0.999 01。将各样品的吸光度代入回归方程，样品FRAP清除能力用每克干样品的Trolox当量评价。
1.4 数据处理
每个试验重复3次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 21.0软件进行数据处理分析，通过Duncan法和单因素方差分析法检验数据间的差异显著性，采用Pearson法进行总黄酮、总糖、总酚和总酸等功能性成分含量与抗氧化活性的相关性分析。采用Origin 8.5和Excel绘制图表。
2 结果与分析
2.1 野生樱桃李酵素的主要成分测定结果
野生樱桃李果肉和果皮酵素的主要成分及含量测定结果见表1。
表1 野生樱桃李酵素主要成分测定结果
Table 1 Measurement results of main components in Prunus cerasifera Jiaosu
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
（mg/g） 总酸/% 可溶性固形物/%CK1 1.79±0.04b1.59±0.07g1.47±0.04f3.18±0.05g7.67±0.29f R10 0.68±0.02e1.78±0.06f4.44±0.05b5.87±0.07d9.17±0.29d R20 0.47±0.03f6.34±0.09d3.66±0.10c5.60±0.06e14.33±0.29c R30 0.67±0.02e10.65±0.09a4.66±0.06a7.45±0.07a21.67±0.29a CK2 2.03±0.11a1.73±0.06fg1.73±0.04e3.61±0.05f6.67±0.29g P10 1.49±0.03c2.62±0.07e3.38±0.07d5.62±0.05e8.33±0.29e P20 1.57±0.03c7.84±0.12c3.29±0.05d6.37±0.08c14.50±0.50c P30 1.05±0.07d10.43±0.04b4.71±0.09a7.19±0.04b20.17±0.29b项目 总黄酮/（mg/g） 总糖/% 总酚/
由表1可以看出，与未发酵野生樱桃李果肉相比，野生樱桃李果肉酵素的总黄酮含量均显著降低（P＜0.05），R10、R20和 R30分别降低了 62.01%、73.74%和62.57%，R20酵素中总黄酮的含量最低，而R10和R30酵素中总黄酮含量差异不显著（P＞0.05），可能是由于随糖添加量增加会使发酵时间延长[20]，野生樱桃李果肉酵素中有部分黄酮类化合物氧化或转化为其他化合物，从而使总黄酮含量降低[21]；3个野生樱桃李果皮酵素的总黄酮含量均低于未发酵野生樱桃李果皮总黄酮含量，P10、P20和P30分别降低了26.60%、22.66%和48.28%；3个果皮酵素总黄酮含量均高于3个果肉酵素，这与野生樱桃李果皮中初始总黄酮含量高于果肉有关，Wang等[22]报道野生樱桃李紫果果皮中含有4种花青素，总花青素含量为11.18 g/kg·FW～19.86 g/kg·FW，而紫果果肉中未检测到花青素。
外源糖的加入可以为微生物的生长繁殖提供稳定的碳源，从而延长发酵时间，另一方面还可以抑制杂菌的生长。经过90 d的自然发酵后，野生樱桃李果肉和果皮酵素的总糖含量均显著高于未发酵果肉和果皮（P＜0.05），且随糖添加量的增加而逐渐增加，R10、R20和R30的总糖含量分别增加了11.95%、298.74%和 569.81%，P10、P20和P30的总糖含量分别增加了51.45%、353.18%和502.89%，所有果肉和果皮酵素总糖含量均低于实际糖添加量，这是微生物生长繁殖过程大量消耗糖类物质所致[23]。
野生樱桃李果肉和果皮酵素的总酚含量均显著高于未发酵果肉和果皮（P＜0.05），R10、R20和 R30的总酚含量分别增加了202.04%、148.98%和217.01%，P10、P20和P30的总酚含量分别增加了95.38%、90.17%和172.25%，这是由于在微生物酶和酸类物质的作用下，野生樱桃李果肉和果皮中与纤维素结合的不溶多酚类物质转化为可溶的游离态多酚[24]，Chu等[25]研究发现微生物可以合成单体多酚类物质；糖添加量的变化与果肉和果皮酵素总酚含量变化趋势不一致，这可能是由于果肉和果皮化学成分种类及含量的差异影响微生物的发酵，从而导致发酵液总酚等活性成分的差异[7]。
在微生物发酵作用下，所有野生樱桃李果肉和果皮酵素样品的总酸含量显著高于未发酵果肉和果皮（P＜0.05），R10、R20 和 R30 的总酸含量分别增加了84.59%、76.10%和134.28%，P10、P20和 P30的总酸含量分别增加了55.68%、76.45%和99.17%，这是因为有机酸是微生物生长繁殖产生的主要代谢产物。高庆超等[6]发现黑果枸杞酵素的可滴定酸含量比原黑果枸杞增加了109.73%～166.67%，与本研究结果类似；范昊安等[26]的研究表明，发酵过程中，苹果梨酵素中的草酸和醋酸等次级代谢产物的生成导致可滴定酸增加；野生樱桃李果肉酵素中的总酸含量随糖添加量的增加呈先降低后明显增加的趋势，果皮酵素中的总酸含量则随糖添加量的增加而逐渐升高，这是由于糖类物质为微生物提供了足够的发酵底物，有机酸大量代谢生成，在酵母菌和细菌的作用下，可使还原型和氧化型糖降解代谢为丙酮酸、琥珀酸和富马酸等有机酸[27]。
食品中的可溶性固形物主要包括维生素、糖、酸、矿物质等所有可溶于水的化合物，是评价食品及果蔬汁饮料营养价值的重要指标，同时也是发酵底物的关键营养因子。野生樱桃李果肉和果皮酵素的可溶性固形物含量均高于未发酵果肉和果皮，并且果肉和果皮酵素的可溶性固形物含量呈现出随糖添加量的增加而增加的趋势，R10、R20和R30的可溶性固形物含量分别增加了19.56%、86.83%和182.53%，P10、P20和P30的可溶性固形物含量分别增加了24.89%、117.39%和202.40%。此外，由表1可知，野生樱桃李果肉和果皮酵素中总糖和总酸对可溶性固形物的贡献最大，是可溶性固形物的主要成分。
2.2 野生樱桃李酵素的抗氧化性能测定结果
2.2.1 野生樱桃李酵素的DPPH自由基清除能力
野生樱桃李果肉酵素和果皮酵素对DPPH自由基的清除能力如图1所示。
图1 野生樱桃李果肉酵素和果皮酵素的DPPH自由基清除能力
Fig.1 DPPH radical scavenging ability of Prunus cerasifera pulps and rinds Jiaosu
由图1可以看出，在1.5 mg/mL～7.5 mg/mL浓度范围内，CK1、R10、R20和R30对DPPH自由基的清除能力随样品质量浓度的增加而增强，呈现出剂量依赖效应，各果肉酵素样品清除DPPH自由基的能力顺序为VC＞R30＞R10＞R20＞CK1。经 SPSS 21.0 软件计算，CK1、R10、R20和 R30清除 DPPH自由基的 IC50分别为（5.55±0.04）、（3.25±0.08）、（5.26±0.14）mg/mL 和（2.60±0.09）mg/mL；其中R30的IC50最低，可见在一定浓度范围内，糖添加量为30%的果肉酵素表现出最强的DPPH自由基清除能力。对于果皮酵素，在1.5 mg/mL～7.5 mg/mL 浓度范围内，CK2、P10、P20和 P30对 DPPH自由基的清除能力同样呈现出剂量依赖效应，各果皮酵素样品清除DPPH自由基的能力顺序为VC＞P30＞P20＞CK2＞P10。经 SPSS 21.0 软件计算，CK2、P10、R20和P30清除DPPH自由基的IC50分别为（9.00±0.15）、（16.90±1.27）、（5.69±0.29）mg/mL 和（3.04±0.05）mg/mL；其中P30的IC50最低，可见在一定浓度范围内，糖添加量为30%的果皮酵素同样表现出最强的DPPH自由基清除能力，但低于糖添加量为30%的果肉酵素。
2.2.2 野生樱桃李酵素的羟基自由基清除能力
野生樱桃李果肉酵素和果皮酵素对·OH的清除能力如图2所示。
图2 野生樱桃李果肉酵素和果皮酵素的·OH清除能力
Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of Prunus cerasifera pulps and rinds Jiaosu
由图2可知，在1.5 mg/mL～7.5 mg/mL浓度范围内，CK1、R10、R20和 R30对·OH 的清除能力总体呈现剂量依赖效应，各果肉酵素样品清除·OH能力与清除 DPPH 自由基能力顺序一致，为 VC＞R30＞R10＞R20＞CK1。经 SPSS 21.0软件计算，CK1、R10、R20和 R30清除·OH 的 IC50分别为（3.53±0.07）、（2.17±0.04）、（2.69±0.05）mg/mL 和（2.02±0.09）mg/mL；其中，R30 的 IC50最低，可见在一定浓度范围内，糖添加量为30%的果肉酵素同样表现出最强的清除·OH能力。各果皮酵素样品清除·OH的能力与清除DPPH自由基能力顺序一致，同样为 VC＞P30＞P20＞CK2＞P10。经 SPSS 21.0 软件计算，CK2、P10、R20和 P30清除·OH 的 IC50分别为（4.80±0.07）、（5.40±0.10）、（3.98±0.11）mg/mL 和（2.62±0.05）mg/mL；其中，P30 的 IC50最低，这表明糖添加量为30%的果皮酵素同样对·OH的清除能力最强，但与果肉酵素相比，R30对·OH的清除能力强于P30。
2.2.3 野生樱桃李酵素的总抗氧化能力
野生樱桃李果肉和果皮酵素的总抗氧化能力测定结果如图3所示。
图3 野生樱桃李果肉和果皮酵素的总抗氧化能力
Fig.3 Total antioxidant capacity of Prunus cerasifera pulps and rinds Jiaosu
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
采用FRAP法考察野生樱桃李酵素的总抗氧化能力。由图3可知，R30的总抗氧化能力最强，FRAP为（102.43±0.99）mg Trolox/g，R10和 R20的 FRAP 分别为（98.38±1.08）mg Trolox/g 和（98.27±0.38）mg Trolox/g，R10和R20的总抗氧化能力无显著差异（P＞0.05），CK1的总抗氧化能力最弱，FRAP值为（85.19±0.69）mg Trolox/g。对于果皮酵素，CK2、P10、P20 和P30 的FRAP值分别为（90.99±0.46）、（92.89±0.64）、（96.60±0.50）mg Trolox/g和（99.56±1.31）mg Trolox/g，总抗氧化能力顺序为P30＞P20＞P10＞CK2。果肉酵素和果皮酵素的总抗氧化能力顺序与清除DPPH自由基和·OH的能力顺序均不一致，糖添加量为30%的果肉酵素的总抗氧化能力强于同样糖添加量的果皮酵素。
2.3 野生樱桃李酵素主要成分与抗氧化活性的相关性分析
表2为野生樱桃李果肉酵素主要成分及其与抗氧化活性的相关性分析结果。
表2 野生樱桃李果肉酵素各参数相关性分析
Table 2 Correlation analysis of various parameters in Prunus cerasifera pulps Jiaosu
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
项目 总黄酮 总糖 总酚 总酸 可溶性固形物 DPPH自由基清除能力 ·OH清除能力 总抗氧化能力总黄酮 1总糖 -0.542 1总酚 -0.896** 0.566 1总酸 -0.830** 0.784* 0.950** 1可溶性固形物 -0.568 0.993** 0.632* 0.835** 1 DPPH自由基清除能力-0.404 0.641* 0.738** 0.833** 0.716** 1·OH清除能力 -0.890** 0.625* 0.972** 0.953** 0.681* 0.737** 1总抗氧化能力 -0.926** 0.703* 0.970** 0.969** 0.751** 0.701* 0.959** 1
由表2可知，野生樱桃李果肉酵素DPPH自由基清除能力与总酚、总酸及可溶性固形物含量均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为 0.738、0.833 和0.716；果肉酵素·OH清除能力则与总酚和总酸含量均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.972和0.953；果肉酵素总抗氧化能力则与总酚、总酸和可溶性固形物含量呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.970、0.969和0.751；总糖含量与DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和总抗氧化能力均呈显著正相关（P＜0.05），相关系数分别为 0.641、0.625 和 0.703；总黄酮含量与DPPH自由基清除能力无显著相关关系（P＞0.05），而与·OH清除能力和总抗氧化能力均呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数分别为-0.890和-0.926。可以看出，果肉酵素中的总酚、总酸和可溶性固形物含量对DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力有一定影响，·OH清除能力则主要受总酚和总酸含量的影响，由于果肉酵素中总黄酮含量总体上远低于总酚、总酸和可溶性固形物含量，因此，并不能简单的认为黄酮类物质会抑制抗氧化活性，而文献表明野生樱桃李果肉中黄酮类物质会起到一定的抗氧化作用[9]。
表3为野生樱桃李果皮酵素各参数相关性分析。
表3 野生樱桃李果皮酵素各参数相关性分析
Table 3 Correlation analysis of various parameters in Prunus cerasifera rinds Jiaosu
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
项目 总黄酮 总糖 总酚 总酸 可溶性固形物 DPPH自由基清除能力 ·OH清除能力 总抗氧化能力总黄酮 1总糖 -0.795** 1总酚 -0.984** 0.826** 1总酸 -0.923** 0.887** 0.956** 1可溶性固形物 -0.841** 0.990** 0.866** 0.890** 1 DPPH自由基清除能力-0.608* 0.904** 0.620* 0.628* 0.911** 1·OH清除能力 -0.671* 0.970** 0.704** 0.757** 0.960** 0.964** 1总抗氧化能力 -0.862** 0.972** 0.874** 0.914** 0.978** 0.848** 0.915** 1
由表3可知，野生樱桃李果皮酵素DPPH自由基清除能力与总糖和可溶性固形物含量均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.904和0.911；果皮酵素·OH清除能力则与总糖、总酚、总酸和可溶性固形物含量均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.970、0.704、0.757 和 0.960；果皮酵素总抗氧化能力也与总糖、总酚、总酸和可溶性固形物含量均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为 0.972、0.874、0.914和0.978。由此可知，果皮酵素中的总糖、总酚、总酸和可溶性固形物含量对·OH清除能力和总抗氧化能力有一定影响，DPPH自由基清除能力则主要受总糖和可溶性固形物含量的影响。
3 讨论
通过比较不同糖添加量的果肉和果皮酵素主要成分的含量差异，可以看出不同糖添加量明显影响了微生物发酵过程，从而使各酵素的活性物质含量产生较大差异。外源糖的加入为微生物发酵提供了碳源，糖添加量较低会使发酵不完全，导致代谢产物减少及抗氧化活性降低。从表3可以看出总糖与总酚、总酸和可溶性固形物均呈极显著正相关（P＜0.01），这是由于在微生物的作用下，糖类物质代谢为有机酸，并促进微生物合成多酚类物质，从而增加了总酸及总酚的含量。果肉和果皮酵素在一定的浓度条件下均表现出良好的体外抗氧化性能，并呈现出剂量依赖效应，R30和P30的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和总抗氧化能力均最强，而且R30的抗氧化性能强于P30，结合表2、表3的相关性结果分析，原因主要是R30和P30中的总糖、总酚、总酸和可溶性固形物的含量均高于其他酵素，尤其是果肉酵素中的总酚和总酸与3种抗氧化指标均具有极显著的正相关性（P＜0.01），与陈小伟等[28]的研究结果一致。刘晓等[11]、刘伟等[29]研究发现，野生樱桃李果皮提取物及枝、叶提取物的抗氧化活性的变化趋势均与多酚含量一致，陈小伟等[30]发现咖啡果皮酵素中的总酚含量与2，2’-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基和DPPH自由基的清除能力极显著正相关。总酸中的一些有机酸是抗氧化作用的物质基础，方晟等[31]研究发现，金佛手酵素中的乳酸和乙酸含量与·OH清除率呈极显著正相关，而琥珀酸与DPPH自由基清除能力呈极显著正相关，草莓酵素中的柠檬酸和L-苹果酸与4种抗氧化评价指标均呈极显著正相关[28]。
4 结论
本文通过DPPH自由基、羟基自由基和FRAP 3种抗氧化模型，评价了不同糖添加量的野生樱桃李果肉和果皮酵素的体外抗氧化性能，并采用Pearson法分析了野生樱桃李酵素的主要成分与抗氧化活性的相关性。结果发现，不同糖添加量使微生物发酵代谢产物产生了差异，6种果肉和果皮酵素总体表现出良好的抗氧化活性，30%糖添加量的果肉和果皮酵素DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和总抗氧化能力最强，多酚类物质和有机酸是野生樱桃李酵素抗氧化作用的物质基础。在今后的工作中，可以对野生樱桃李发酵过程中多酚类物质和有机酸的种类、含量及体外抗氧化活性进行研究，为野生樱桃李酵素产品的开发提供参考。
[1] 索婧怡,朱雨婕,陈磊,等.食用酵素的研究及发展前景分析[J].食品与发酵工业,2020,46(19):271-283.SUO Jingyi,ZHU Yujie,CHEN Lei,et al.The research and development prospect of edible Jiaosu[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(19):271-283.
[2] DAI J,SHA R Y,WANG Z Z,et al.Edible plant Jiaosu:Manufacturing,bioactive compounds,potential health benefits,and safety aspects[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2020,100(15):5313-5323.
[3]LI HC,HUANG J T,WANG Y Q,et al.Study on the nutritional characteristics and antioxidant activity of dealcoholized sequentially fermented apple juice with Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus plantarum fermentation[J].Food Chemistry,2021,363:130351.
[4]KWAW E,MA Y K,TCHABO W,et al.Effect of Lactobacillus strains on phenolic profile,color attributes and antioxidant activities of lactic-acid-fermented mulberry juice[J].Food Chemistry,2018,250:148-154.
[5] 金哲宁,方晟,沙如意,等.沙棘酵素功能成分及其体外抗氧化性能研究[J].食品研究与开发,2020,41(17):20-28.JIN Zhening,FANG Sheng,SHA Ruyi,et al.Study on the functional components and in vitro antioxidant activity of sea-buckthorn jiaosu[J].Food Research and Development,2020,41(17):20-28.
[6] 高庆超,常应九,马蓉,等.黑果枸杞酵素发酵前后主要成分分析及其体外抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业,2020,46(5):275-283.GAO Qingchao,CHANG Yingjiu,MA Rong,et al.Analysis of main components and antioxidant activity in vitro for Lycium ruthenicum Murr.Jiaosu before and after fermentation[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(5):275-283.
[7] 王春梅,苏普,谢天成,等.野生樱桃李营养成分及抗氧化功能研究进展[J].药物生物技术,2013,20(6):582-585.WANG Chunmei,SU Pu,XIE Tiancheng,et al.Research progress on nutrients and antioxidant function of myrobalan plum(Peunus cerasifera ehrh.)[J].Pharmaceutical Biotechnology,2013,20(6):582-585.
[8] 刘伟,姚思辰,黄贤敏,等.樱桃李中功能成分研究进展[J].食品研究与开发,2021,42(6):211-218.LIU Wei,YAO Sichen,HUANG Xianmin,et al.Advances on functional components in Prunus cerasifera[J].Food Research and Development,2021,42(6):211-218.
[9] 沈静,李东雨,阿力亚·阿不来提,等.新疆野生樱桃李与栽培品种果肉中总黄酮含量的测定及抗氧化活性的研究[J].食品科技,2015,40(9):320-323.SHEN Jing,LI Dongyu,ALIYA Abulaiti,et al.Determination of the content of total flavonoids and the activity of antioxidant in the flesh of Prunus cerasifera and its cultivars[J].Food Science and Technology,2015,40(9):320-323.
[10]沈静,李洋,李亚杰,等.新疆野生樱桃李中多糖提取物提取工艺及其抗氧化活性研究[J].中国现代应用药学,2019,36(24):3040-3045.SHEN Jing,LI Yang,LI Yajie,et al.Study on extraction technology and antioxidant activity of polysaccharide extract from wild Prunus cerasifera[J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy,2019,36(24):3040-3045.
[11]刘晓,刘伟,葛豫炜,等.野生樱桃李果皮多酚含量测定及抗氧化活性研究[J].伊犁师范学院学报(自然科学版),2019,13(1):48-53.LIU Xiao,LIU Wei,GE Yuwei,et al.Determination of polyphenol content and antioxidant activity in Prunus cerasifera peel[J].Journal of Yili Normal University(Natural Science Edition),2019,13(1):48-53.
[12]王玮,沈静,姚军.新疆野生樱桃李果皮中花色苷纯化工艺及体外抗氧化活性[J].食品科技,2018,43(2):247-252.WANG Wei,SHEN Jing,YAO Jun.Purification process and antioxidant activity of anthocyanins from Prunus cerasifera peel[J].Food Science and Technology,2018,43(2):247-252.
[13]刘伟,高红艳,李紫薇,等.野生樱桃李叶总黄酮含量测定方法比较研究[J].江西农业大学学报,2016,38(1):192-197.LIU Wei,GAO Hongyan,LI Ziwei,et al.Comparison of the determination methods for total flavonoids in Prunus divaricata Ldb leaves[J].Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis,2016,38(1):192-197.
[14]NAVAJAS-PORRAS B,PÉREZ-BURILLO S,MORALES-PÉREZ J,et al.Relationship of quality parameters,antioxidant capacity and total phenolic content of EVOO with ripening state and olive variety[J].Food Chemistry,2020,325:126926.
[15]国家卫生健康委员会,国家市场监督管理总局.食品安全国家标准食品中总酸的测定:GB 12456—2021[S].北京:中国标准出版社,2021.National Health Commission of the People’s Republic of China,State Administration for Market Regulation.National food safety standard Determination of total acid in foods:GB 12456—2021[S].Beijing:Standards Press of China,2021.
[16]国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.饮料通用分析方法:GB/T 12143—2008[S].北京:中国标准出版社,2009.General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People's Republic of China,Standardization Administration of the People's Republic of China.General analytical methods for beverage:GB/T 12143—2008[S].Beijing:Standards Press of China,2009.
[17]CHEN X Q,ZHANG Y,ZU Y G,et al.Composition and biological activities of the essential oil from Schisandra chinensis obtained by solvent-free microwave extraction[J].LWT-Food Science and Technology,2011,44(10):2047-2052.
[18]LIU W,XU J,JING P,et al.Preparation of a hydroxypropyl Ganoderma lucidum polysaccharide and its physicochemical properties[J].Food Chemistry,2010,122(4):965-971.
[19]KULAPICHITR F,BOROMPICHAICHARTKUL C,FANG M,et al.Effect of post-harvest drying process on chlorogenic acids,antioxidant activities and CIE-Lab color of Thai Arabica green coffee beans[J].Food Chemistry,2022,366:130504.
[20]肖梦月,曹新志,张楷正,等.拐枣果蔬酵素发酵条件的优化[J].中国酿造,2019,38(10):188-192.XIAO Mengyue,CAO Xinzhi,ZHANG Kaizheng,et al.Optimization of fermentation conditions for Hovenia acerba fruit and vegetable enzyme[J].China Brewing,2019,38(10):188-192.
[21]周偏,蔡坤,梁丛颖,等.诺丽酵素在自然发酵过程中体外抗氧化活性变化及品质研究[J].中国酿造,2018,37(1):92-96.ZHOU Pian,CAI Kun,LIANG Congying,et al.Changes of in vitro antioxidant activity of Morinda citrifolia ferment during natural fermentation process and quality analysis[J].China Brewing,2018,37(1):92-96.
[22]WANG Y,CHEN X L,ZHANG Y M,et al.Antioxidant activities and major anthocyanins of myrobalan plum(Prunus cerasifera ehrh.)[J].Journal of Food Science,2012,77(4):C388-C393.
[23]杨小幸,周家春,陈启明,等.苹果酵素天然发酵过程中代谢产物的变化规律[J].食品科学,2017,38(24):15-19.YANG Xiaoxing,ZHOU Jiachun,CHEN Qiming,et al.Changes in metabolites during natural fermentation of apple into enzyme drink[J].Food Science,2017,38(24):15-19.
[24]GHOSH K,RAY M,ADAK A,et al.Role of probiotic Lactobacillus fermentum KKL1 in the preparation of a rice based fermented beverage[J].Bioresource Technology,2015,188:161-168.
[25]CHU S C,CHEN C.Effects of origins and fermentation time on the antioxidant activities of kombucha[J].Food Chemistry,2006,98(3):502-507.
[26]范昊安,沙如意,方晟,等.苹果梨酵素发酵过程中的褐变与抗氧化活性[J].食品科学,2020,41(14):116-123.FAN Haoan,SHA Ruyi,FANG Sheng,et al.Browning and antioxidant activity of apple-pear jiaosu during fermentation[J].Food Science,2020,41(14):116-123.
[27]TSUJI A,OKADA S,HOLS P,et al.Metabolic engineering of Lactobacillus plantarum for succinic acid production through activation of the reductive branch of the tricarboxylic acid cycle[J].Enzyme and Microbial Technology,2013,53(2):97-103.
[28]陈小伟,程勇杰,蒋立新,等.草莓酵素发酵过程中代谢产物及抗氧化性的变化研究[J].中国食品学报,2020,20(5):157-165.CHEN Xiaowei,CHENG Yongjie,JIANG Lixin,et al.Studies on the changes of metabolites and antioxidant activity during the fermentation process of strawberry jiaosu[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2020,20(5):157-165.
[29]刘伟,李紫薇,陈文强,等.新疆野生樱桃李枝、叶不同萃取部位抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2016,37(3):119-122.LIU Wei,LI Ziwei,CHEN Wenqiang,et al.Study on antioxidant activity of different parts partitioned from Prunus divaricata Ldb branches and leaves in Xinjiang[J].Science and Technology of Food Industry,2016,37(3):119-122.
[30]陈小伟,范昊安,张婷,等.咖啡果皮酵素发酵过程中代谢产物与抗氧化功能评价[J].食品研究与开发,2019,40(9):18-25,50.CHEN Xiaowei,FAN Haoan,ZHANG Ting,et al.Study on the evaluations of metabolites and antioxidant activity during the fermentation process of coffee peel jiaosu[J].Food Research and Development,2019,40(9):18-25,50.
[31]方晟,陈俊沲,周瑾,等.金佛手酵素发酵过程中有机酸及其体外抗氧化性能分析[J].食品工业科技,2020,41(10):68-74.FANG Sheng,CHEN Juntuo,ZHOU Jin,et al.Analysis of organic acids and antioxidant activity in vitro of Citrus medica jiaosu during fermentation process[J].Science and Technology of Food Industry,2020,41(10):68-74.