全世界有200多种蔷薇，其中有多种蔷薇的果实可供药食两用，其富含氨基酸、总多酚、总有机酸和糖类等成分[1-2]，具有抗氧化、免疫调节、降血脂、抗癌和抗菌等方面的药理活性[3]；在阿拉斯加、匈牙利和土耳其等地，一些口感独特、营养丰富的蔷薇果也被制成果酱，深受儿童喜爱[4]。新疆地处亚欧腹地，独特的气候和地理条件为蔷薇提供了适宜的生长环境[5]，新疆蔷薇果果型大、肉厚、味甘甜、营养丰富，在食品、药品开发方面具有巨大潜力[1-2]。植物多糖是植物体内具有多种生物学功能的生物大分子，主要由葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖以一定的比例聚合而成，相对分子质量从几万到几百万不等。现代药理研究表明，植物多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗氧化、抗辐射等多种药理作用[6-7]，目前，关于新疆蔷薇果中总多糖和单糖的研究鲜见报道。
多糖主要采用滴定法和紫外分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry，UV-Vis）[8-9]等方法检测。滴定法操作简单、成本低，但试验条件要求较高且滴定终点不易判别；UV-Vis法操作简单、准确、重复性好，目前被广泛应用。单糖目前最常用的检测方法是高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]，糖类物质经衍生化后可连接在紫外可见吸收检测器中（ultraviolet-visible detector，UVD）进行测定，但衍生化操作步骤繁琐且准确性较低；蒸发光检测器（evaporativelight scattering detector，ELSD）[11]可直接检测糖类物质，但灵敏度、重复性和精密度较差；示差折光检测器（differential refractive index detector，RID）[12]检测糖类物质具有灵敏度高、稳定性和重复性好的优点。因此本试验采用UV-Vis和HPLC-RID测定新疆8种蔷薇果中的总多糖和4种单糖的含量，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA）进行综合评价[13]，为后续研发品种的筛选及质量控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
8种不同品种的完全成熟的新疆蔷薇果（表皮为深红色、萼片干枯）于2020年9月采自新疆乌鲁木齐市雅玛里克山和阿勒泰地区海拔的山地或灌丛，经新疆医科大学徐海燕教授鉴定为蔷薇科蔷薇的果实，编号为 S1～S8，见表 1。
表1 样品编号及采集地点
Table 1 Sample number and collection location
编号 品名 拉丁名 采集地S1 喀什蔷薇 Rosa laxa Rtez.var.kaschgarica（Rupr.）Y.L.Han.阿勒泰S2 宽刺蔷薇 Rosa platyacantha Schrenk.阿勒泰S3 波斯单叶蔷薇 Rosa persica Mickx ex Juss.阿勒泰S4 毛叶蔷薇 Rosa laxa Rtez.var.mollis Yü et Ku.阿勒泰S5 密刺蔷薇 Rosa spinosissima L.阿勒泰S6 疏花蔷薇 Rosa laxa Rtez.乌鲁木齐S7 弯刺蔷薇 Rosa beggeriana Schrenk.阿勒泰S8 托木尔蔷薇 Rosa laxa Rtez.var.tomurensis S.H.Liou.阿勒泰
葡萄糖（纯度大于99.8%）、果糖（纯度大于99.9%）、蔗糖（纯度大于98.8%）：中国食品药品检定研究院；麦芽糖（纯度大于94.4%）：广州硕谱生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Honeywell公司；苯酚、硫酸（分析纯）：天津北联精细化学品开发有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20A岛津液相色谱仪、RID-10A检测器：日本岛津公司；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SL-200高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金厂；XS105电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ-5200DE数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；TDL-5A离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；Milli-Q纯水机：美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 总多糖含量的测定
1.3.1.1 供试品提取方法筛选
精密称量S3号干燥样品粉末（80目）2.000 0 g，平行9份，平均分3组，均加入500 mL蒸馏水，分别采用浸渍24 h、超声45 min、煎煮45 min三种方法提取总多糖，采用UV-Vis法测定总多糖含量。
1.3.1.2 供试品溶液的制备
分别精密称取8种新疆蔷薇果粉末（80目）2.0000g，按照1.3.1.1所得最佳方法进行提取，抽滤，滤液作为供试品溶液，备用。
1.3.1.3 总多糖显色条件考察
以蔷薇果中的总多糖作为考察指标，单因素考察5%苯酚用量 0.6、0.8、1.0、1.2 mL，其它条件为浓硫酸3 mL、50 ℃ 加热 20 min；浓硫酸用量 3、5、7 mL，其它条件为5%苯酚用量1.0 mL、50℃加热20 min；加热温度 40、50、60、80℃，其它条件为 5%苯酚用量 1.0 mL、浓硫酸 5 mL、加热 20 min；加热时间 10、20、30、40 min，其它条件为5%苯酚用量1.0 mL、浓硫酸5 mL、加热温度50℃。
1.3.1.4 总多糖线性关系考察
精密称取葡萄糖对照品适量，制备浓度为5.138μg/mL的葡萄糖对照品溶液。精密移取 0、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80、3.20、3.60 mL，加入 2 mL 蒸馏水，按照最佳显色条件在490 nm处测定吸光度[14]。以葡萄糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.1.5 精密度、重复性和稳定性考察
将方法“1.3.1.4”的葡萄糖对照品溶液的吸光度重复测定6次，记录并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，考察仪器精密度。
取S3样品粉末按照“1.3.1.2”方法，平行制备6份供试品溶液，按“1.3.1.3”方法，测定吸光度，计算RSD值，考察重复性。
取方法“1.3.1.4”中对照品溶液，25℃放置，在0、2、4、8、12、24 h 分别测定吸光度，计算 RSD 值，考察样品的稳定性。
1.3.1.6 加样回收率试验
精密称量已知总多糖含量的S3样品粉末2.0000g，平行9份，按照样品含量的80%、100%和120%加入葡萄糖对照品，每组平行3份，按照“1.3.1.2”方法制备供试品溶液，根据方法“1.3.1.4”中的条件测定，计算回收率，考察该方法的准确度。
1.3.1.7 新疆蔷薇果样品中总多糖含量测定
精密移取“1.3.1.2”方法中的供试品液各0.1 mL，按照方法“1.3.1.4”的条件测定样品中总多糖含量。
1.3.2 新疆蔷薇果单糖组分分析
1.3.2.1 对照品储备液制备
精密称取适量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对照品，分别置于10 mL容量瓶，用40%乙腈溶解配制质量浓度分别为 50.28、40.12、20.45、20.98 mg/mL 的对照品储备液。
1.3.2.2 供试品溶液制备
取方法“1.3.1.2”中的供试品溶液125 mL，水浴蒸干，用5 mL 40%乙腈复溶，0.45 μm滤膜过滤，滤液为单糖组分供试品溶液。
1.3.2.3 色谱条件
色谱柱CAPCELLPKANH2（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-水，在此基础上考察流动相的比例；流速：1.0 mL/min，柱温：40℃，检测池温度 40℃，进样15 μL。
1.3.2.4 线性关系考察
分别精密量取“1.3.2.1”方法中的单一对照品储备液，梯度稀释制备系列浓度各单一对照品溶液，按方法“1.3.2.3”的条件进行测定，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2.5 精密度、重复性和稳定性考察
取“1.3.2.4”方法中的对照品溶液，按“1.3.2.3”色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值，考察仪器的精密度。
取S3样品粉末按照方法“1.3.2.2”制备供试品溶液，平行6份，然后按“1.3.2.3”方法测定，记录峰面积，计算RSD值，考察重复性。
取方法“1.3.2.4”中的对照品溶液，25℃放置 0、4、8、12、24、48 h，再按照方法“1.3.2.3”条件进行测定，记录峰面积，计算RSD值，考察4种单糖的稳定性。
1.3.2.6 加样回收率
精密称量已知含量的S3样品粉末2.000 0 g，平行6份，按已知含量100%加入果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对照品，按照方法“1.3.2.2”制备供试品溶液，再按方法“1.3.2.3”的条件测定，记录峰面积，计算各成分的加样回收率，考察该方法的准确度。
1.3.2.7 蔷薇果中单糖组分的含量测定
将方法“1.3.2.2”中的样品溶液按照方法“1.3.2.3”进行测定，计算各样品中单糖组分的含量。
1.3.3 数据处理与分析
以蔷薇果中总多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量为变量，利用Origin 2018软件对样品中的5种成分进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及聚类分析（cluster analysis，CA）。
2 结果与分析
2.1 总多糖提取方法的确定
总多糖含量结果：煎煮法总多糖含量为263.48mg/g、超声法总多糖含量为187.52 mg/g、浸渍法总多糖含量为126.79 mg/g。因此，确定煎煮法为供试品提取方法。
2.2 总多糖测定方法的确定
表2为总多糖测定方法的单因素考察结果。
表2 单因素考察结果（n=3）
Table 2 Results of the single factor examination（n=3）
5%苯酚/mL 总多糖含量/mg 浓硫酸/mL 总多糖含量/mg 温度/℃ 总多糖含量/mg 时间/min 总多糖含量/mg 0.6 187.54±0.58 3 194.27±0.23 40 196.45±0.47 10 221.32±0.46 0.8 187.24±0.24 5 224.65±0.36 50 221.03±0.57 20 245.77±0.55 1.0 200.15±0.74 7 208.74±0.42 60 207.14±0.28 30 263.48±0.36 1.2 180.24±0.54 8 190.14±0.78 80 197.67±0.87 40 250.57±0.82
由表2可知，以1.0 mL 5%苯酚溶液，5 mL浓硫酸，50℃加热30min为显色条件，放至25℃后进行测定，此时S3样品最为稳定且总多糖含量最高，为263.48mg/g，因此，以此条件为最佳。
2.3 总多糖含量测定方法学考察
葡萄糖的线性方程为A=26.152C+0.013 4（r=0.999 2），表明葡萄糖含量在 7.65 μg/mL～22.67 μg/mL范围线性关系良好。精密度考察的RSD值为0.96%。表明该仪器精密度良好。重复性考察的RSD值为0.67%，表明该方法重复性良好。稳定性考察的RSD值为0.91%，表明总多糖在24 h内稳定。对样品进行加样回收率测定试验，结果见表3。
表3 加样回收率结果（n=9）
Table 3 Results of sample adding recovery（n=9）
成分 样品含量/（mg/g）加入量/mg检测量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%总多糖 263.47 212.00 482.60 101.50 99.87 1.20 263.49 470.35 98.92 263.53 469.02 98.63 264.43 263.50 538.01 101.91 262.86 527.99 100.31 263.04 521.59 99.06 262.73 316.00 580.35 100.28 264.21 575.51 99.19 264.11 574.31 99.00
如表3所示，平均加样回收率为99.87%，RSD值为1.20%，表明本法测定总多糖含量准确。
2.4 单糖组分含量测定方法学考察
2.4.1 专属性与线性考察
依据《中国药典》[15]，考察流动相的比例对蔷薇果中4种单糖成分色谱行为的影响，HPLC-RID色谱分析图如图1所示。
图1 对照品和样品溶液的HPLC-RID色谱分析图
Fig.1 HPLC-RID chromatograms of standard and sample solution
1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.麦芽糖。A 为乙腈 ∶水=80 ∶20（体积比）时的混合对照品；B为乙腈∶水=70∶30（体积比）时的混合对照品；C为乙腈∶水=75∶25（体积比）时的混合对照品；D为乙腈∶水=75∶25（体积比）时的蔷薇果样品。
由图1A可知，当乙腈与水体积比为80∶20时，4种单糖成分的出峰时间在15 min以内，果糖和葡萄糖的分离度小于1.5；由图1B可知，当乙腈与水的体积比为70∶30时，待测物质对称因子为1.45且麦芽糖无检测峰；乙腈与水的体积比为75∶25时，4种单糖成分的分离度大于1.5，对称因子为1.02，理论塔板为3 320，适用于4中单糖类成分检测。
2.4.2 线性考察
4种单糖成分的线性考察结果见表4。
表4 4种单糖回归方程、线性范围及相关系数
Table 4 Regression equations，linear ranges and correlation coefficients of four monosaccharides
成分线性回归方程r浓度范围/（mg/mL）果糖 y=124 797x-25 486 0.999 6 5.01～35.09葡萄糖 y=103 856x-1 5518 0.999 9 4.04～28.28蔗糖 y=128 416.0x-1 779.1 0.999 8 0.25～8.06麦芽糖 y=98 986.000x-22.028 0.999 7 0.24～7.73
如表4所示，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖分别在质量浓度 5.01 mg/mL～35.09 mg/mL、4.04 mg/mL～28.28 mg/mL、0.25 mg/mL～8.06 mg/mL、0.24 mg/mL～7.73 mg/mL的范围内线性关系良好，相关系数r≥0.999 6。
2.4.3 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验
果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的精密度考察RSD分别为0.27%、0.25%、0.69%、0.94%，表明仪器精密度良好；重复性考察的RSD分别为2.17%、2.38%、1.95%、2.72%，表明方法的重复性良好；稳定性考察的RSD分别为2.36%、1.51%、2.41%、2.55%，表明4种单糖在48 h内稳定；4种单糖成分的加样回收率试验结果见表5。
表5 4种单糖成分的加样回收率试验结果（n=6）
Table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides（n=6）
RSD/%果糖 75.85 75.80 151.86 100.14 99.51 1.25 151.65 100.00 151.23 99.72 152.07 100.28 151.65 100.00 151.27 99.75葡萄糖 57.72 57.50 115.24 100.02 99.24 0.66 114.08 99.01 113.63 98.62 115.06 99.86 113.41 98.43 114.63 99.49蔗糖 20.83 20.50 41.99 101.60 100.46 1.21 41.35 100.04成分 样品含量/mg加入量/mg实测量/mg回收率/%平均回收率/%
续表5 4种单糖成分的加样回收率试验结果（n=6）
Continue table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides（n=6）
RSD/%蔗糖 20.83 20.50 41.38 100.13 40.92 99.00 42.26 102.25 41.23 99.77麦芽糖 2.67 2.65 5.52 103.85 102.32 2.43成分 样品含量/mg加入量/mg实测量/mg回收率/%平均回收率/%5.25 98.63 5.42 101.89 5.54 104.15 5.58 104.87 5.33 100.13
由表5可知，平均加样回收率分别为99.51%、99.24%、100.46%和 102.32%，RSD值分别为1.25%、0.66%、1.21%和2.43%，表明本法测定4种单糖含量准确。
2.5 含量测定
新疆8种蔷薇果中总多糖含量及4种单糖组分含量结果见表6。
表6 新疆8种蔷薇果样品中总多糖和4种单糖组分的含量
Table 6 Content of total polysaccharides and four sugars in 8 Xinjiang Rosa fruits samples
样品编号 总多糖/（mg/g）麦芽糖/（mg/g）S1 245.46 7.17 5.97 0.00 0.99 S2 313.64 27.68 11.56 0.00 2.55 S3 263.48 75.85 57.72 20.84 2.67 S4 317.66 17.69 8.81 0.57 0.94 S5 172.36 35.43 32.16 3.79 2.06 S6 253.43 6.92 4.84 0.00 2.42 S7 138.18 7.43 6.51 1.13 1.29 S8 141.89 7.55 5.39 0.00 1.24果糖/（mg/g）葡萄糖/（mg/g）蔗糖/（mg/g）
表6结果显示，总多糖和4种单糖组分的含量差异较大，含量分布范围较广。其中S4号样品总多糖含量最高，S3号样品果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量最高。
2.6 主成分分析
主成分分析（PCA）运用降维的思维，通过提取对应特征值大于1的成分，排除重叠信息，减少变量，并对数据进行相似性分类[16-17]。本文以新疆8种蔷薇果中总多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖5种成分为变量进行PCA分析，结果如表7所示。
表7 主成分分析方差贡献率
Table 7 Principal component analysis variance contribution rate
成分初始特征值 提取载荷平方和总计 方差百分比 累积/% 总计 方差百分比 累积/%1 3.38 67.51 67.51 3.376 67.511 67.511 2 1.02 20.33 87.85 1.017 20.334 87.845 3 0.53 10.65 98.49 4 0.07 1.30 99.79 5 0.01 0.21 100.00
表7结果表明，提取获得的主成分为总多糖和果糖，累计的方差贡献率为87.85%，前2个主成分因子的特征值分别为3.38和1.02，表明这2个主成分可以代表8种药材中5个成分87.85%的信息。
旋转后的因子载荷矩阵可以表示主成分与其对应变量的相关系数[18-19]，结果见表8。
表8 旋转后的因子载荷矩阵
Table 8 Rotated component matrixa
编号 总多糖 果糖 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖主成分1 -0.128 0.292 0.325 0.316 0.155主成分2 0.911 0.033 -0.140 -0.135 0.283
采用得到的2个主成分对8种不同蔷薇果进行评分，计算2个主成分的单独得分，表达式如下。
Y1=-0.070X1+0.159X2+0.177X3+0.172X4+0.084X5
Y2=0.903X1+0.033X2-0.139X3-0.134X4+0.281X5
以2个主成分所对应的方差贡献率为权重，获得综合评价函数为Y=67.511%Y1+20.334%Y2，计算样品的综合得分并进行排序，结果见表9，样品S3质量最好。
表9 8种蔷薇果样品的主成分因子得分、综合得分和排序
Table 9 Factor scores，comprehensive scores and sorting of principal components of 8 Rosa of fruits kinds of samples
样品编号 主成分1 主成分2 综合评分 排序S1 -0.389 0.002 -0.262 6 S2 -0.087 1.447 0.235 2 S3 1.226 0.202 0.869 1 S4 -0.355 0.874 -0.062 5 S5 0.329 -0.729 0.074 3 S6 -0.245 0.661 -0.031 4 S7 -0.216 -1.256 -0.401 7 S8 -0.262 -1.200 -0.421 8
2.7 聚类分析
聚类分析（CA）是一个“物以类聚”的分类过程，通过计算样品间的欧氏距离，根据样品间的相似性进行分组[20]。本研究以新疆8种蔷薇果中5种成分的含量为变量，以样品间的欧式距离为区间分析样品之间的异同[21]。聚类分析树状图如图2所示。
图2 蔷薇果的聚类分析树状图
Fig.2 Dendrogram for clustering analysis of the Rosa of fruits
由图2可知，在树状图的距离75处为标准进行归类，可将样品分成 3 类，S5、S7 和 S8 归为一类，S1、S2、S4、S6归为一类，S3归为一类。此分析结果与主成分分析结果一致。
3 结论
本试验采用UV-Vis和HPLC-RID分析测定新疆地区8种蔷薇果中总多糖和4种单糖成分的含量，考察不同提取方法以及总多糖和4种单糖组分测定方法的提取效率，所建立的方法经过严格的方法学考察，操作简单、精密度好、灵敏度高，适用于果实类中糖的检测。8种蔷薇果中波斯单叶蔷薇（S3）的综合评分最高，其次为宽刺蔷薇（S2）、密刺蔷薇（S5）和疏花蔷薇（S6），研究结果可为新疆蔷薇果的开发及综合利用提供试验依据。
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