益生菌、益生元和合生元是常见的微生态制剂，其中益生菌对肠道菌群进行调节[1]，益生元为益生菌提供营养底物[2]，合生元是有益宿主的益生菌和益生元的混合物[3]，具有益生功能和治疗多种疾病的作用[4]。植物乳杆菌是一种兼性异型乳酸发酵[5]的革兰氏阳性益生菌，其来源安全，拥有广泛的代谢多样性，被用作各种发酵食品的功能性发酵剂[6-7]。益生菌应在加工、储存和胃肠道消化过程中保持较高的活力，而植物乳杆菌对高酸环境敏感[8]，并且在这些过程中还面临着高温和胆汁的威胁。目前微胶囊技术可以很好地解决食品中生物活性物质不稳定的问题[9]，该技术可以在加工和储存期间保护植物乳杆菌免受外部压力，并保护植物乳杆菌到达作用部位时免受蛋白酶降解和pH值的影响[10]，从而提高植物乳杆菌的耐酸性能。根据包裹益生菌的类型，益生菌的食品级递送系统可分为蚕茧和“蜘蛛网”，前者采用外部保护层包围内部的益生菌，后者借助于网络结构保护益生菌，微胶囊则属于前者[11]。海藻酸钠微胶囊是在二价阳离子（通常是CaCl2溶液形式的钙离子）存在下通过离子凝胶形成[12]，每个钙离子均与4个α-L-古洛糖醛酸钠（G）单体的羧基和羟基配位，形成所谓的“蛋盒”模型[13]，然而，当磷酸盐和柠檬酸等螯合剂以及钠或镁离子等非胶凝阳离子存在时，海藻酸钠微胶囊在化学上是不稳定的[14]。壳聚糖可以进一步强化海藻酸钠微胶囊的凝胶结构，它是一种从天然聚合物甲壳素中提取的聚阳离子多糖，与海藻酸钠形成聚电解质复合物（聚阴离子聚合物），阳离子壳聚糖的加入，可以对海藻酸钠进行包覆从而形成微胶囊[15]。近年来，海藻酸钠微胶囊的生产已经达到了益生菌包封的关键要求[16]，包括生物相容性、生物降解性以及长期储存性等[17]。将特定的益生菌与高度选择性的益生元进行配对，使益生元作为益生菌的食物来源[18]，是稳定改变肠道微生物群最具前景的方法之一。
黄精多糖（Polygonatum polysaccharide，PP）是黄精主要的活性与功能成分之一，具有抗肿瘤、调节血糖血脂、调节免疫力[19]等作用，它在发挥多糖作用的同时可以影响肠道菌群的生长，因此可以作为益生元协同植物乳杆菌生长，与其构成合生元，促进益生作用。菊粉（inulin，IL）是一种天然的低聚果糖，由果糖基经β-糖苷键链接而成，每个分子通常含有一个末端葡萄糖基，这些糖苷键使菊粉能够抵抗动物或人类胃肠道酶的水解[20]。因此，菊粉被认为是一种常见的益生元，并且被证明其能够增加微生物数量和降低结肠内容物的pH值[21]。研究表明，益生菌与益生元组合成的合生元能促进肠道微生态平衡[22-23]，如嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌与菊粉组成的合生元能有效缓解小鼠结肠炎症并提高肠道有益菌属比例[24]，但不同微生态制剂治疗溃疡性结肠炎的效果有很大差异[25]。到目前为止，关于多种益生元复配与海藻酸钠结合成微胶囊用于益生菌封装的研究较少。
本试验将黄精多糖和菊粉进行复配并与植物乳杆菌合成合生元，采用挤压法将其微胶囊化，随后采用冷冻干燥技术进行干燥处理，再进行体外模拟胃肠液消化实验，研究不同质量比的益生元对植物乳杆菌的益生效果，同时评估合生元微胶囊对胃肠液的耐受性能以及植物乳杆菌在胃肠道中的释放效果，基于这些研究，得到最优的益生元质量比，从而提高植物乳杆菌对肠胃液的耐受能力和微胶囊的贮藏稳定性，为新型益生菌食品的研究与开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌HH-LP56：西安聚生源生物科技有限公司；MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司；海藻酸钠、甘油、乳果糖、胃蛋白酶（1∶3 000 NFU/g）、胰蛋白酶（1∶250 NFU/mg）：北京索莱宝科技有限公司；菊粉：河南晟发生物科技有限公司；黄精：取样于山东泰安徂徕山地区；磷酸二氢钾、无水CaCl2、冰乙酸、壳聚糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）：天津凯通化学试剂有限公司；海藻糖：上海麦克林生化科技有限公司；脱脂乳粉：新西兰乳品集团。
1.2 仪器与设备
SCIENTZ-10N冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；303-00A全自动恒温培养箱：天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂；BCL-1360B型超净工作台：北京亚太科隆仪器技术有限公司；HJ-6多头加热磁力搅拌器：国华仪器制造有限公司；TGL-20bR高速离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ-500DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FCD-2000恒温鼓风干燥箱：上海琅轩实验设备有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器：常州智博瑞仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黄精多糖的制备
参照贾宇涵等[26]的超声波辅助提取法对黄精多糖进行提取优化，选择成熟度适宜、无损伤腐烂的熟黄精切片烘干，磨干成粉，过40目筛。准确称取5 g黄精粉末，按照料液比1∶13（g/mL）添加去离子水，在超声功率325 W的条件下超声27 min，8 000 r/min离心15 min后过滤，加入无水乙醇后置于冰箱冷藏（4℃、24 h）后转入烘箱干燥成粉末状备用。
1.3.2 植物乳杆菌生长曲线的测定
将植物乳杆菌活菌以无菌操作按照5%接种量将菌种分别接种到不含益生元和含1%益生元（IL与PP质量比为 0 ∶5、2 ∶3、1 ∶1、3 ∶2、5 ∶0）的 MRS 液体培养基中，置于37℃培养24 h，调整培养基初始pH值为5.9，每隔2 h取适量菌液，在600 nm下测定菌液的吸光度，以培养时间为横坐标，以OD值为纵坐标，根据所得数据绘制生长曲线。
1.3.3 植物乳杆菌微胶囊的制备
首先将活化2代～3代的植物乳杆菌8 000 r/min离心5 min，收集菌泥沉淀与一定浓度的海藻酸钠溶液混合，进行充分搅拌使其均匀。在含有一定质量的100 mL壳聚糖溶液中加入1%的冰乙酸使壳聚糖溶解，加入一定质量的无水CaCl2在磁力搅拌器上使其充分混合均匀至无颗粒状沉淀。将海藻酸钠混合液通过5 mL管状注射器（6号针头）匀速逐滴滴入到壳聚糖—CaCl2溶液中形成湿态微胶囊，磁力搅拌15 min使微胶囊与固化液充分接触，然后置于4℃冰箱静置固化备用。用0.9%灭菌生理盐水充分冲洗微胶囊表面，洗去表面浮菌，将其与冻干保护剂（脱脂乳6%、海藻糖8%、甘油4%、乳果糖8%）混合均匀后，在-20℃冰箱预冻24 h，压力1.0 MPa，冷冻干燥24 h得到植物乳杆菌微胶囊颗粒。
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 海藻酸钠浓度对微胶囊包埋率的影响
在壳聚糖浓度0.8%，CaCl2浓度0.3 mol/L，固化时间3 h，海藻酸钠浓度分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的条件下，按照1.3.3的方法制备植物乳杆菌微胶囊，以微胶囊包埋率为评定指标，考察海藻酸钠浓度对微胶囊包埋率的影响。
1.3.4.2 CaCl2浓度对微胶囊包埋率的影响
在壳聚糖浓度0.8%，海藻酸钠浓度2%，固化时间3 h，CaCl2浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的条件下，按照1.3.3的方法制备植物乳杆菌微胶囊，以微胶囊包埋率为评定指标，考察CaCl2浓度对微胶囊包埋率的影响。
1.3.4.3 壳聚糖浓度对微胶囊包埋率的影响
在海藻酸钠浓度2%，CaCl2浓为0.3 mol/L，固化时间3 h，壳聚糖浓度为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的条件下，按照1.3.3的方法制备植物乳杆菌微胶囊，以微胶囊包埋率为评定指标，考察壳聚糖浓度对微胶囊包埋率的影响。
1.3.4.4 固化时间对微胶囊包埋率的影响
在壳聚糖浓度0.8%，海藻酸钠浓度2%，CaCl2浓度 0.3 mol/L，固化时间为 1、2、3、4、5 h 的条件下，按照1.3.3的方法制备植物乳杆菌微胶囊，以微胶囊包埋率为评定指标，考察固化时间对微胶囊包埋率的影响。
1.3.5 正交试验
在单因素试验的基础上，以海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、壳聚糖浓度及固化时间4个因子为自变量，以包埋率为评价指标，正交试验优化制备微胶囊因素水平见表1。
表1 正交试验优化制备微胶囊因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal design for optimizing the preparation conditions of microcapsules
水平 A海藻酸钠浓度/%D固化时间/h 1 B CaCl2浓度/（mol/L）C壳聚糖浓度/%1.5 0.2 0.6 2 2 2.0 0.3 0.8 3 3 2.5 0.4 1.0 4
1.3.6 合生元微胶囊的制备
参照1.3.3的方法制备微胶囊，将菌泥沉淀分别与不同质量比的益生元（IL与PP质量比分别为0∶5、2∶3、1∶1、3∶2、5∶0）混合均匀，再与 2%海藻酸钠溶液混合搅拌均匀。将海藻酸钠混合液匀速滴入100 mL含有壳聚糖（0.8%）-CaCl2（0.3 mol/L）溶液中形成湿态微胶囊，搅拌后置于4℃冰箱静置固化3 h。用0.9%灭菌生理盐水充分冲洗微胶囊表面，洗去表面浮菌，将其与冻干保护剂混合均匀后，在-20℃冰箱预冻24 h，压力1.0 MPa，冷冻干燥24 h得到植物乳杆菌微胶囊颗粒。
1.3.7 微胶囊粒径的测定
用游标卡尺随机取不同质量比益生元的合生元微胶囊若干，取平均值得到合生元微胶囊的粒径分布情况。
1.3.8 微胶囊包埋率以及存活率的测定
以海藻酸钠为壁材的微胶囊可以于柠檬酸钠溶液中轻微振荡实现崩解[27]。取1 g不同质量比益生元的合生元微胶囊置于9 mL 3%柠檬酸钠溶液中进行裂解，溶液置于37℃水浴恒温振荡器，在180 r/min条件下摇匀60 min。裂解后进行活菌计数，计算公式如下。
式中：N为微胶囊包埋的活菌数，cfu/mL；N1为包埋前添加的活菌数，cfu/mL。
不同质量比益生元的冻干合生元微胶囊，用柠檬酸钠溶液进行裂解处理，利用活菌计数计算微胶囊中植物乳杆菌的存活率和活菌率。存活率的计算公式如下。
式中：S为冻干后合生元微胶囊的活菌数，cfu/mL；S0为冻干前的微胶囊的植物乳杆菌活菌数，cfu/mL。
活菌率的计算公式如下。
式中：N2为冻干后微胶囊中的活菌数，cfu/mL；V为裂解液的体积，mL；M为微胶囊的质量，g。
1.3.9 体外模拟肠胃液消化
1.3.9.1 模拟胃液的配制
胃液按照Amakiri等[28]的方法进行优化制备。准确移取1 mol/L稀盐酸1.64 mL加入至90 mL无菌水中，搅拌均匀后再向其中加入1.00 g胃蛋白酶，充分搅拌均匀，最后用无菌水定容至100 mL，放入4℃冰箱备用。
1.3.9.2 模拟肠液的配制
肠液按照Amakiri等[28]的方法进行优化制备。准确称取磷酸二氢钾0.68 g于50 mL的无菌水中，搅拌至充分溶解，用1 mol/L NaOH溶液调pH值至6.8；另准确称取胰蛋白酶1.00 g于30 mL无菌水中，搅拌至充分溶解；将上述两种液体混合后加无菌水定容至100 mL，放入4℃冰箱备用。
1.3.9.3 连续胃肠液消化实验
对照组：取1 mL植物乳杆菌菌液加入9 mL胃液中，180 r/min振荡处理2 h后，吸取混合液100 μL，适当稀释后涂板计数。将模拟胃液处理后的混合液4 000 r/min离心15 min，收集菌体。将菌体加入9 mL肠液中，180 r/min振荡处理2h后，吸取混合液100 μL，适当稀释后涂板计数。
实验组：分别取1 g各质量比微胶囊颗粒加入到9 mL胃液中，充分摇匀混合后置于37℃摇床（180 r/min），充分摇匀2 h。将混合均匀的菌液进行梯度稀释，然后取最佳梯度稀释浓度100 μL的菌液进行涂布计数。将胃液处理后收集的微胶囊加入9 mL肠液中，180 r/min振荡处理2 h，摇匀后涂板计数。
1.3.9.4 肠胃液分别释放实验
取1mL植物乳杆菌菌液、1g未添加益生元的植物乳杆菌微胶囊和5种不同质量比益生元的合生元微胶囊颗粒分别加入至9 mL胃液和9 mL肠液中，充分摇匀混合后置于37℃摇床（180 r/min），充分摇匀2 h。将混合均匀的菌液先进行梯度稀释，然后在合适浓度梯度下进行涂布计数。
肠胃液消化实验前对微胶囊进行裂解处理计数，调整菌液浓度，保证菌液和微胶囊的初始菌浓度在同一数量级。
1.3.10 储存稳定性
将冷冻干燥后不同质量比益生元的合生元微胶囊放置于若干玻璃小瓶中，将其分别置于-20、4、25℃保藏63 d。每隔7 d取出1 g冻干微胶囊颗粒进行活菌数测定，检测不同质量比益生元的微胶囊贮存稳定性。
1.4 数据分析
所有数据均为3次独立重复试验的结果，均采用平均值±标准差表示，利用Excel和SPSS 22.0对试验数据进行分析，P＜0.05时有显著统计学意义。
2 结果与分析
2.1 植物乳杆菌生长曲线结果与分析
测定植物乳杆菌的生长曲线对植物乳杆菌的培养研究具有重要的意义。一方面，它可以反映出试验中所采用的菌种在液体培养基中的生长和繁殖能力；另一方面，根据生长曲线可以判断出达到最多活菌数的时间，以实现效益最大化，还可以指导试验进度，对整个工艺进行优化[29]。添加不同质量比益生元（IL∶PP）的植物乳杆菌的生长曲线见图1。
图1 添加不同质量比益生元（IL∶PP）的植物乳杆菌生长曲线
Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum with prebiotics of different mass ratios（IL ∶PP）
由图1可知，植物乳杆菌在MRS培养基中，随着培养时间的延长，OD值不断增加。OD值反映了发酵液中的菌群数量，变化率反映了菌群的生长速度[30]。培养18 h后进入稳定期，此时OD值最高，代表着最大生物量。配养16 h时生物量最大，为最佳发酵点，因此选择16 h～20 h内的发酵液进行后续试验。并且通过对比发现，IL与PP质量比为2∶3的OD值最大可达到1.175 2，高于不添加益生元的最大值1.140 1，且添加不同质量比益生元的植物乳杆菌OD值整体高于未添加益生元的OD值，即添加益生元对植物乳杆菌有协同生长的作用，其中IL与PP质量比为2∶3时OD值和变化率最大，即增殖效果最佳。
2.2 单因素试验结果
各因素对微胶囊包埋率的影响见图2。
图2 单因素对微胶囊包埋率的影响
Fig.2 Influences of single factors on microcapsule embedding rate
a.海藻酸钠浓度；b.CaCl2浓度；c.壳聚糖浓度；d.固化时间。
由图2a可知，当海藻酸钠浓度小于2.0%时，植物乳杆菌微胶囊的包埋率随着海藻酸钠浓度的升高而升高；当海藻酸钠浓度为2.0%时，微胶囊的包埋率达到最大，为80.3%；海藻酸钠浓度继续增大时，包埋率降低，可能是海藻酸钠菌液混合液黏度增大使植物乳杆菌混合不均所致[31]。
由图2b可知，当CaCl2浓度小于0.3 mol/L时，植物乳杆菌合生元微胶囊的包埋率随着CaCl2浓度的增加而增大；当CaCl2浓度为0.3 mol/L时，合生元微胶囊的包埋率达到最大；随着CaCl2浓度继续增大时，包埋率反而降低。这可能是由于CaCl2浓度增大，使Ca2+浓度增大，无法提供给Ca2+更多的结合位点[32]，难以继续包埋植物乳杆菌，导致包埋率下降。
由图2c可知，当壳聚糖浓度达到0.8%时，植物乳杆菌微胶囊的包埋率最大；当壳聚糖浓度小于0.8%时，随着壳聚糖浓度的增加，壳聚糖与海藻酸钠结合愈加紧密，减少了植物乳杆菌的扩散，降低菌体损失，使得包埋率增加；当壳聚糖浓度大于0.8%时，植物乳杆菌微胶囊的包埋率略微降低，但降低不明显，原因可能是壳聚糖浓度的增加减少了包埋过程中的菌体损失。
由图2d可知，植物乳杆菌微胶囊的包埋率整体随着固化时间的延长，包埋率增加。当达到3 h时，微胶囊的包埋率最大，此后随着时间的延长，包埋率有所下降，可能是因为固化时间较长导致植物乳杆菌微胶囊出现菌液渗透的情况，致使微胶囊内活菌数下降，包埋率有所降低。因此，综合时间以及节约成本，选择海藻酸钠浓度2%、CaCl2浓度0.3 mol/L、壳聚糖浓度0.8%、固化时间3 h作为后续试验条件。
2.3 正交试验结果
以单因素试验中获得的微胶囊最佳制备条件进行正交试验，采用四因素三水平正交分析法探究海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、CaCl2浓度、固化时间对植物乳杆菌微胶囊包埋效果的影响，以确定最终微胶囊制备条件，结果如表2所示。
表2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment
试验号 A B C D 包埋率/%1 1 1 1 1 73.87 2 1 2 2 2 75.61 3 1 3 3 3 74.01 4 2 1 2 3 79.57 5 2 2 3 1 80.03 6 2 3 1 2 78.87 7 3 1 3 2 79.96 8 3 2 1 3 78.23 9 3 3 2 1 78.91 K1 223.49 233.40 230.97 232.81 K2 238.47 233.87 234.09 234.44 K3 237.10 231.79 234.00 231.81 k1 74.50 77.80 76.99 77.60 k2 79.49 77.96 78.03 78.15 k3 79.03 77.26 78.00 77.27 R 4.99 0.69 1.04 0.88较优水平 A2 B2 C2 D2
由表2可知，极差R的大小顺序为A＞C＞D＞B，即海藻酸钠浓度对微胶囊包埋率的影响最大，K1、K2、K3中数值最大的为相应水平的最优解，因此A2B2C2D2组合为最佳制备条件，经验证该条件下包埋率达到（80.44±0.10）%，明显高于其他组合。因此，选择A2B2C2D2组合进行后续试验，以包埋率为评价指标，最佳的工艺参数为海藻酸钠浓度2%、CaCl2浓度0.3 mol/L、壳聚糖浓度0.8%、固化时间3 h。
2.4 合生元微胶囊的粒径分布
合生元微胶囊的粒径分布情况见图3。
图3 不同质量比益生元的微胶囊粒径分布
Fig.3 Size distribution of microcapsules of prebiotics with different mass ratios
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，不同质量比益生元对微胶囊的粒径分布也有一定影响，IL与PP质量比为5∶0时，微胶囊粒径均值1.583 3 mm；IL与PP质量比为3∶2时，微胶囊粒径均值1.613 3 mm；IL与PP质量比为1∶1时，微胶囊粒径均值1.723 3 mm；IL与PP质量比为2∶3时，微胶囊粒径均值1.893 3 mm；IL与PP质量比为0∶5时，微胶囊粒径均值2.163 3 mm。可以看出，微胶囊粒径随着黄精多糖含量的增加而增加，IL与PP质量比为0∶5时，微胶囊粒径最大，可能是由于黄精多糖含量增加，其微粒直径相较于菊粉较大，导致微胶囊粒径有所增加。
2.5 合生元微胶囊包埋率的测定
包埋率是评价微胶囊非常重要的一个试验指标，它反映了制备过程中壁材对芯材的包埋情况。包埋率越高，说明益生菌与外界环境接触越少，对益生菌的保护作用越强[33]。本试验中，IL和PP的加入有益于植物乳杆菌的包埋。在添加不同质量比益生元的微胶囊中，其植物乳杆菌活菌率如图4所示。
图4 不同质量比益生元（IL∶PP）对植物乳杆菌合生元微胶囊包埋率的影响
Fig.4 Effect of prebiotics with different mass ratios（IL∶PP）on the encapsulation rate of Lactobacillus plantarum synbiotics microcapsules
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，微胶囊包埋率分别为80.44%（未添加）、81.37%（5 ∶0）、86.83%（3 ∶2）、86.18%（1 ∶1）、92.61%（2∶3）、89.39%（0∶5），可见微胶囊对合生元具有很好的包埋效果，且在IL与PP质量比为2∶3时，包埋率最高，为92.61%，微胶囊颜色呈浅黄棕色。
2.6 冻干微胶囊的活菌率以及植物乳杆菌的存活率
冷冻干燥是一种用来延长益生菌制品保质期的方法，作为传统干燥方法的一种有效替代，其涉及不加热的脱水过程，使收缩范围变小，有助于降低敏感性和保存生物活性材料[34]。益生菌在冻干过程中存活率会下降。冰晶的形成、膜的破坏、细胞内溶质的高渗透性、细胞内大分子的变性和水的去除是冻干过程中益生菌生存能力丧失的重要原因[35]。不同质量比益生元对微胶囊活菌率的影响见表3。
表3 不同质量比益生元（IL∶PP）对微胶囊活菌率的影响
Table 3 Effect of prebiotics（IL ∶PP）with different mass ratios on the viability of microcapsules
注：-表示原菌不计算其活菌率。
组别原菌菌落数/（1010cfu/mL）活菌率/（108cfu/g）浓缩原菌液 1.76±0.03 -未添加 1.43±0.04 1.67±0.21 5∶0 1.40±0.02 1.71±0.04 3∶2 1.54±0.01 1.71±0.02 1∶1 1.51±0.03 1.83±0.03 2∶3 1.64±0.01 2.02±0.05 0∶5 1.56±0.02 1.86±0.06
由表3可知，经浓缩后的原菌液活菌数为1.76×1010cfu/mL，添加益生元的微胶囊的活菌率均高于未添加，可能是益生元的益生作用提高了植物乳杆菌的存活率。植物乳杆菌可以利用IL和PP，先将其分解为果糖，然后在细胞内对其进行利用。同时，IL酶与植物乳杆菌发酵产生的水解酶，专门作用于IL的β-2，1键，产生果糖或低聚果糖，由于其化学结构更容易代谢从而促进了植物乳杆菌的生长；提取PP时，所得的较多单糖成分也为植物乳杆菌的生长代谢提供了原料，因此含有益生元的微胶囊活菌率较高。
不同质量比益生元的合生元微胶囊对植物乳杆菌存活率的影响见图5。
图5 不同质量比益生元（IL∶PP）合生元微胶囊对植物乳杆菌存活率的影响
Fig.5 Effect of prebiotic（IL ∶PP）synbiotic microcapsules with different mass ratios on the survival rate of Lactobacillus plantarum
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5可以看出，不同质量比益生元在冷冻干燥过程中具有保护效果。添加益生元的微胶囊相较于未添加的微胶囊，植物乳杆菌的存活率显著提高（P＜0.05），其中IL与PP质量比为2∶3时，存活率最高，达到81.44%，仅使用挤压法制备的未添加益生元的微胶囊存活率相对较低。Jouki等[36]研究发现，添加益生元的微胶囊可以提高植物乳杆菌在微胶囊中的存活率，使微胶囊的耐受冻干能力增强，与本试验结果一致。
2.7 合生元微胶囊体外消化性质
2.7.1 合生元微胶囊在肠胃液中的稳定性
植物乳杆菌作为益生菌，必须在胃环境中存活下来，并以足够多的数量（需在106cfu/mL以上）到达结肠以促进定植[37]。植物乳杆菌合生元微胶囊肠胃液连续作用释放结果见表4。
表4 植物乳杆菌合生元微胶囊肠胃液连续作用释放结果
Table 4 Release of Lactobacillus plantarum in synbiotic microcapsules in simulated gastrointestinal fluid lg（cfu/mL）
组别 植物乳杆菌原始数 模拟胃液释放数 模拟肠液释放数未添加 8.67±0.20 2.13±0.02 1.31±0.01 0∶5 8.68±0.03 7.30±0.01 7.01±0.02 2∶3 8.66±0.01 7.57±0.05 7.10±0.02 1∶1 8.68±0.05 7.23±0.01 6.87±0.03 3∶2 8.71±0.02 7.38±0.01 7.02±0.06 5∶0 8.65±0.01 7.25±0.02 6.91±0.01
由表4可知，当植物乳杆菌进入胃液后，由于胃液的强酸特性，使植物乳杆菌数目大幅度下降，从8.67 lg（cfu/mL）下降至 2.13 lg（cfu/mL），下降了 6.54 lg（cfu/mL），而微胶囊通过胃液处理2 h后，活菌数仍能达到 7 lg（cfu/mL）以上，仅仅下降了 1 lg（cfu/mL），可以看出微胶囊对植物乳杆菌的保护作用大幅提升，耐胃液能力加强，达到肠液后活菌数仍均保持在6 lg（cfu/mL）以上，即可以在肠道内发挥良好的益生作用。并且通过连续模拟人工肠胃液实验，可以发现，IL与PP质量比为2∶3时，微胶囊的耐酸性最强，在肠液中的释放数目最多，植物乳杆菌的存活率也最高。
2.7.2 合生元微胶囊在人工胃液中的释放
植物乳杆菌菌液/微胶囊在人工胃液中的比较见图6。
图6 植物乳杆菌菌液/微胶囊在人工胃液中的比较
Fig.6 Comparison on the survival rate of Lactobacillus plantarum liquid/microcapsule in simulated gastric fluid
如图6所示，未经包埋的植物乳杆菌被胃液侵蚀，存活率急剧下降，120 min后菌体消耗殆尽，存活率仅24.57%，远低于包埋后的微胶囊的存活率，说明微胶囊化植物乳杆菌可以明显提高植物乳杆菌对胃酸的耐受能力。并且，120 min后合生元微胶囊胃液的存活率均高于未添加益生元的微胶囊，可以看出复配益生元对植物乳杆菌有一定益生作用，可以提高微胶囊对酸性条件的抵抗能力；当IL与PP质量比为2∶3时，微胶囊中植物乳杆菌的存活率最高，活菌数能达到7.43 lg（cfu/mL），存活率高达 85.8%，耐酸性更强，有利于减少胃酸的破坏，使足够数量的植物乳杆菌能够到达肠道发挥作用。
2.7.3 合生元微胶囊在人工肠液中的释放
植物乳杆菌微胶囊在人工肠液中的释放见图7。
图7 植物乳杆菌微胶囊在人工肠液中的释放
Fig.7 Release of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated intestinal fluid
由图7可以看出，植物乳杆菌微胶囊在肠液中前20 min释放速度最快，60 min后释放曲线趋于平缓，释放速度开始减慢，120 min时肠液中的微胶囊基本裂解完全。植物乳杆菌微胶囊与合生元微胶囊释放率相比，合生元微胶囊的释放率更高，肠溶性较好。在IL与PP质量比为2∶3时，合生元微胶囊肠液释放率最高，同时肠液中的植物乳杆菌也具有最高的存活率。综上，复配益生元的微胶囊拥有更好的肠胃液耐受能力，IL与PP质量比为2∶3时，合生元微胶囊的耐酸性和肠溶性最好。
2.8 储存稳定性分析
为了评估合生元微胶囊的储存稳定性，将不同质量比益生元的微胶囊分别在-20、4、25℃条件下储存63 d，每7 d进行1次活菌数测定，得到的存活率结果见图 8～图 10。
图8 合生元微胶囊在-20℃下的保藏性
Fig.8 Storage stability of symbiotic microcapsules at-20℃
图9 合生元微胶囊在4℃下的保藏性
Fig.9 Storage stability of symbiotic microcapsules at 4℃
图10 合生元微胶囊在25℃下的保藏性
Fig.10 Storage stability of symbiotic microcapsules at 25℃
由图8～图10可知，合生元微胶囊在-20℃时表现出最佳的储存稳定性。随着储存时间的延长，微胶囊的活菌数均有所下降，可能是由于营养底物的消耗和代谢过程中产生的化合物（酸、细菌素）的存在。在-20℃和4℃时，微胶囊存活率下降相较于25℃明显减少，可以看出低温有利于活菌微胶囊的保藏。合生元微胶囊在室温（25℃）下储存21 d后植物乳杆菌存活率明显下降，这可能是由于胶囊壁材的水活性，导致微胶囊内植物乳杆菌代谢增加，周围储存环境变差，储存稳定性降低。同时可以看出，益生元的益生作用使添加益生元的微胶囊存活率明显高于未添加，在IL与PP质量比为2∶3时，微胶囊的存活率最高，并且可以在低温下保持相对稳定。因此选择-20℃对IL与PP质量比为2∶3的合生元微胶囊进行保藏。
3 结论
植物乳杆菌对酸性条件敏感，在肠胃液中生存能力低。本试验以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，使用挤压法对不同质量比益生元（IL∶PP）和植物乳杆菌一同进行包埋，制备了合生元植物乳杆菌微胶囊，来提高植物乳杆菌的肠胃液耐受能力，并通过正交试验确定了制备微胶囊的最佳工艺，最终选取质量比2∶3（IL∶PP）作为制备合生元微胶囊的最优益生元质量比。试验结果表明，益生元对植物乳杆菌具有益生作用，OD值增加，其生物量和基质消耗量明显增加；在连续性肠胃液实验和肠胃液分别释放实验中可以看出，微胶囊明显降低了胃酸对植物乳杆菌的侵害作用，包埋后的微胶囊在胃酸中60 min内几乎可以崩解完全，并且在肠液仍能保持较高的存活率；合生元微胶囊在肠胃液中呈现出良好的耐酸性和肠溶性，有利于植物乳杆菌在肠道中的定植；低温有利于微胶囊的储存，其贮藏稳定性明显高于常温贮藏，结果表明-20℃贮藏效果最佳。
本文探讨了合生元微胶囊制备工艺及最优益生元质量比，所制备的合生元微胶囊具备良好的释放性能和存活率，在新型益生菌功能食品的开发研究中有良好的应用前景，有望为促进肠道益生菌的靶向释放提供一种新的参考。
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