青钱柳（Cyclocarya paliurus），因其果实长得如同一串串的铜钱，所以又称为金钱柳。青钱柳含有植物多糖、黄酮、多酚、萜类、皂苷等多种活性物质，因此青钱柳能明显降低机体胆固醇、甘油三酯，可用于糖尿病、高血压、高血脂等疾病的预防和治疗[1-3]。青钱柳多糖具抗癌[4]和抗氧化[5]的作用。巴拉吉红米为主要生长于贵州黔东南高山梯田上的一种红米，其含花色苷，故其颜色红如玛瑙。巴拉吉红米营养价值极高，含有多酚、维生素、黄酮、γ-氨基丁酸等活性物质[6-7]，且富含硒、锌、铁等微量元素[8]，所以具有抗氧化[9]、改善脑血流通[10]、预防癌症[11]等功效。由此可见，青钱柳和巴拉吉红米均具有较高的应用价值。
目前，对于青钱柳的研究主要为多糖[12-13]和黄酮[14-15]的提取与功效[16-17]，还有少量以青钱柳为原辅料进行发酵食品的研究，如赵立春等[18-19]研制的青钱柳无糖茶冻和青钱柳杂粮代餐粉；鲁青等[20]研究的青钱柳-葛根复合发酵型饮料；黄元河等[21]研究的青钱柳速溶茶等。然而，以青钱柳为原辅料酿酒，以及青钱柳经发酵成为发酵食品后对其进行成分分析的报道较少。本研究以巴拉吉红米为主料，配以青钱柳为辅料，经过浸渍、蒸煮，再添加微生物复合菌种发酵得到青钱柳红米复合酒，并初步探讨发酵生产工艺，分析复合酒的成分，从而证明利用青钱柳复合红米可以制备富含营养成分的发酵型复合酒，以期为青钱柳的开发利用及青钱柳发酵食品的成分分析提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
巴拉吉红米、青钱柳样品：贵州雷山县瑞康生态农业投资有限公司；微生物复合菌种：广西大学生命科学与技术学院实验室自主研发，主要由根霉、米曲霉和酵母组成。
γ-氨基丁酸（分析纯）：美国SIGMA公司；葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；芦丁（分析纯）：生物工程上海有限公司；氢氧化钠、亚硝酸钠（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；苯酚、硫酸、硝酸铝、无水乙醇、四硼酸钠、次氯酸钠（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
电热恒温鼓风干燥箱（101-2-BS-Ⅱ）：上海跃进医疗器械有限公司；酒精计：广州市铭睿电子科技有限公司；分析天平（PL303）：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；雷磁pH计（PSH-3C）：上海仪电科学仪器股份有限公司；生化培养箱（LRH-250A）：上海精宏实验设备有限公司；恒温水浴锅（TW-12）：重庆雅马拓科技有限公司；分光光度计（uv1800）：日本株式会社岛津制作所。
1.3 试验方法
1.3.1 青钱柳红米复合酒生产工艺流程
青钱柳加水煮沸→制备青钱柳浸提液→浸提液浸泡红米→米饭蒸煮→冷却→接种→发酵→过滤→青钱柳红米复合酒
1.3.2 青钱柳红米复合酒生产工艺操作要点
青钱柳浸提液的制备：青钱柳叶与水料液比1∶1.5（g/mL），100℃下加热 20 min，过滤，制成青钱柳浸提液备用。
浸泡红米：利用制备的青钱柳浸提液浸泡红米12 h。
米饭蒸煮：浸泡的红米隔水蒸30 min，要求米粒完整、熟而不糊、透而不烂、疏松均匀。
冷却：蒸煮成熟的红米饭，摊开冷却，摊凉至30℃左右。
接种：按试验要求的接种量，称取微生物复合菌种，均匀撒于摊凉的米饭上，搅拌，使饭粒和菌种完全混匀。
发酵：将拌好的红米饭移入三角瓶中，压实不留缝隙，保鲜膜封口，橡皮筋包扎，置于生化培养箱中，28℃发酵至酒精度稳定。
过滤：用小型空压过滤机进行膜过滤，制得青钱柳红米复合酒。
1.3.3 单因素试验
以酒精度为指标，考察青钱柳红米复合酒发酵工艺中的红米与青钱柳浸渍液料液比[1 ∶0、1 ∶0.5、1 ∶1.0、1∶1.5、1 ∶2.0（g/mL）]、微生物复合菌种接种量（0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、发酵温度（26、28、30、32、34 ℃）和发酵时间（4、6、8、10、12 d）对酒精度的影响。
1.3.4 正交试验
在单因素试验的基础上，以微生物复合菌种接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、红米与青钱柳浸渍液的料液比（D）进行L16（44）的正交试验，分别测定酒精度确定青钱柳红米复合酒的最佳发酵条件。正交试验设计见表1。
表1 正交试验设计
Table 1 Design of orthogonal test
水平D红米与青钱柳浸渍液料液比/（g/mL）1 0.6 26 9 1∶0 2 0.8 28 10 1∶0.5 3 1.0 30 11 1∶1.0 4 1.2 32 12 1∶1.5因素A微生物复合菌种接种量/%B发酵温度/℃C发酵时间/d
1.3.5 理化指标测定
酒精度参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的第二法测定，再换算成20℃时样品的酒精度；还原糖采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid method，DNS）法[22]测定；总酸参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的方法进行测定；总酯采用酸碱滴定法[23]测定。
1.3.6 成分测定
植物多糖采用苯酚-硫酸法[24]测定；黄酮采用紫外分光光度法[25]测定；总酚采用福林-酚法[26]测定；γ-氨基丁酸参照文献[27]测定；氨基酸参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》，采用氨基酸分析仪测定；微量元素参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》，采用电感耦合等离子体质谱（inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS）法测定。
1.3.7 安全性指标检测
菌落总数的测定参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠杆菌数参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定；铅、无机砷、镉、锡参照NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》中要求的GB 5009系列方法，采用ICP-MS法测定。黄曲霉毒素B1参照GB 5009.22—2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中的酶联免疫法测定。
1.4 数据处理
试验结果采用平均值±标准差表示，应用Microsoft Office Excel 2019和origin 8.5软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 红米与青钱柳浸渍液料液比对酒精度的影响
红米与青钱柳浸渍液料液比对酒精度的影响见图1。
图1 红米与青钱柳浸渍液料液比对酒精度的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio of red rice to C.paliurus extract on alcohol content
由图1可知，随着红米与青钱柳浸渍液料液比的增加，青钱柳红米复合酒酒精度先增加后减少，当红米与青钱柳浸渍液的料液比为1∶1.0时，酒精度最高，为16.3%vol。当红米与青钱柳浸渍液料液比低于1∶1.0时，随着青钱柳浸提液添加量的增加，浸泡和蒸煮时红米的含水量增大，红米中的淀粉水解和糖化增强，并且该作用在红米与青钱柳浸渍液料液比为1∶1.0时达到最大；但当红米与青钱柳浸渍液料液比超过1∶1.0时，酒精度又明显下降，这可能是高浓度青钱柳中的黄酮对混合微生物菌株中某种菌株生长具有抑制作用，与相关报道[28]一致，青钱柳黄酮含量达到一定浓度时可以抑制霉菌或细菌的生长。
2.1.2 微生物复合菌种接种量对酒精度的影响
不同微生物复合菌种接种量对酒精度的影响见图2。
图2 微生物复合菌种接种量对酒精度的影响
Fig.2 Effect of inoculation amount of microbial strains on alcohol content
由图2可知，青钱柳红米复合酒的酒精度随着微生物复合菌种接种量的增加，呈先上升后趋于平稳的趋势，当微生物复合菌种接种量（体积分数）为1.2%时，酒精度最高，达到15.8%vol。随着微生物复合菌种接种量的增加，混合菌株中相应的霉菌和酵母菌数量均有所增加，微生物对淀粉的水解和糖化作用增强，从而有更多的底物被酵母菌发酵转化为酒精，使酒精度增加。但是微生物复合菌种接种量超过1.2%时，发酵液中的微生物浓度过高，需要消耗更多的底物用于维持菌种生长，造成可用于酒精发酵的底物反而减少，从而导致酒精的生成量减少。
2.1.3 发酵温度对酒精度的影响
不同发酵温度对酒精度的影响见图3。
图3 发酵温度对酒精度的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content
由图3可知，随着发酵温度的升高，青钱柳红米复合酒中酒精度呈先上升后下降的趋势。发酵温度为30℃时酒精度最高，为16.5%vol。当发酵温度较低时，微生物复合菌种中的霉菌和酵母菌不仅生长受到抑制，而且用于淀粉水解、糖化和酒精发酵的酶的活性也减弱，使得底物转化效率不高，导致糖化作用和酒精发酵进行得缓慢，酒精得率低；当发酵温度适宜时，微生物生长、发酵旺盛，酒精度高。当发酵温度过高，微生物菌株的生长受到抑制甚至死亡，从而导致酒精产量下降。
2.1.4 发酵时间对发酵的影响
不同发酵时间对酒精度的影响见图4。
图4 发酵时间对酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content
由图4可知，随着发酵时间的延长，青钱柳红米复合酒的酒精度呈先上升后趋于平稳的趋势。发酵到第10天时，酒精度最高，为15.6%vol。发酵时间过短，混合微生物菌株浓度不高，有很多底物未被转化完全，致使底物转化率低，从而酒精得率低；当发酵时间超过10 d后，随着发酵时间的继续延长，酒精度不再增加而趋于平稳，结果说明随着发酵时间的延长，培养基中用于酒精发酵的原料物质耗尽而影响酒精的增加。
2.2 正交试验结果
在单因素试验的基础上，采用L16（44）正交试验确定青钱柳红米复合酒发酵的最佳工艺参数，结果如表2所示。对表2中数据进行方差分析，结果如表3所示。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results
因素试验号A微生物复合菌种接种量B发酵温度C发酵时间D红米与青钱柳浸渍液料液比空白酒精度/%vol 1 1 1 1 1 1 13.8 2 1 2 2 2 2 15.5 3 1 3 3 3 3 15.4 4 1 4 4 4 4 16.0 5 2 1 2 3 4 16.4 6 2 2 1 4 3 15.4 7 2 3 4 1 2 15.8 8 2 4 3 2 1 15.1 9 3 1 3 4 2 13.9 10 3 2 4 3 1 14.9 11 3 3 1 2 4 15.2 12 3 4 2 1 3 15.8 13 4 1 4 2 3 14.1 14 4 2 3 1 4 15.2 15 4 3 2 4 1 16.3 16 4 4 1 3 2 15.7 K1 15.500 14.575 14.950 15.150 15.075 K2 15.625 15.300 15.950 14.975 15.225 K3 14.925 15.600 14.900 15.600 15.250 K4 15.400 15.475 15.150 15.225 15.400 Ri 0.700 1.025 1.050 0.625 0.325
表3 正交试验方差分析
Table 3 Orthogonal test analysis of variance
注：*表示差异显著（P＜0.05）。
因素 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性A微生物复合菌种接种量1.323 3 0.441 6.211 0.083 B发酵温度 2.523 3 0.841 11.845 0.036 *C发酵时间 0.833 3 0.278 13.366 0.031 *D红米与青钱柳浸液料液比0.213 3 0.071 3.911 0.146误差 0.21 3
由表2和3可知，影响青钱柳红米复合酒发酵的主次因素为C（发酵时间）＞B（发酵温度）＞A（微生物复合菌种接种量）＞D（红米与青钱柳浸渍液料液比），其中发酵时间和发酵温度对青钱柳红米复合酒酒精度有显著影响（P＜0.05）；最佳的工艺组合为 A2B3C2D3，即微生物复合菌种接种量0.8%、发酵温度30℃、发酵时间10 d、红米与青钱柳浸渍液料液比为1∶1.0（g/mL）。为了验证正交试验结果的可靠性，按照最优组合，进行3次平行验证试验，得到的青钱柳红米复合酒的平均酒精度为16.3%vol，与正交试验中最高的第5组结果相近（相对偏差0.613%），说明正交试验的可靠性。
2.3 青钱柳红米复合酒成分分析
2.3.1 理化指标与微量元素分析
对青钱柳红米复合酒理化指标和微量元素进行分析可知，青钱柳红米复合酒的酒精度为16.3%vol、还原糖为9.1 g/L、总酸为6.1 g/L、总酯为0.71 g/L。此外，青钱柳红米复合酒中含有铁、铜、锌、锰和硒微量元素，尤其是青钱柳红米复合酒还含有0.039 mg/kg的硒元素，可认为该复合酒为含硒食品。
2.3.2 安全性指标
复合酒安全性指标见表4。
表4 复合酒安全性指标
Table 4 Security indexes of compound wine
检测项目 检验结果 相关标准要求铅（以Pb计，mg/kg） 0.027 ≤0.3无机砷（以As计，mg/kg） 0.006 ≤0.15镉（以Cd计，mg/kg） 0.010 ≤0.2锡（以Sn计，mg/kg） 未检出 ≤100黄曲霉毒素B1/（μg/L）未检出＜5菌落总数/（CFU/g）未检出≤50大肠杆菌数/（MPN/g）未检出＜3.0
由表4可知，青钱柳红米复合酒菌落总数和大肠杆菌数均未检出，微生物符合NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》标准的要求；有毒有害物质中，锡未检出，黄曲霉毒素B1未检出，铅≤0.3 mg/kg，无机砷≤0.15 mg/kg，镉≤0.2 mg/kg，有毒有害物质未超标。以上结果说明，青钱柳红米复合酒是一种安全的发酵食品。
2.3.3 活性成分分析
活性成分分别以植物多糖、黄酮、总酚和γ-氨基丁酸作为测定指标，利用单纯红米发酵酒和青钱柳红米复合酒进行比对试验，结果见表5。
表5 复合酒活性成分分析
Table 5 Functional component analysis of compound wine mg/100 g
含量 黄酮含量 总酚含量 γ-氨基丁酸含量红米酒 80.0±0.3 71.9±0.3 120.3±0.1 21.6±0.2青钱柳红米复合酒 573.2±0.2 196.3±0.3 201.2±0.2 24.2±0.4项目 植物多糖
由表5可知，添加青钱柳可以使红米酒中4种活性成分的含量均增加，其中植物多糖含量达到573.2 mg/100g，比红米酒增加6倍多；黄酮含量为196.3mg/100 g，增幅达到1.7倍；总酚含量为201.2 mg/100 g，比未添加青钱柳的红米酒增加近1倍；相对于红米酒，青钱柳红米复合酒中γ-氨基丁酸略有增加。通过试验证明利用青钱柳红米复合发酵可以生产富含活性成分的复合酒。
2.3.4 氨基酸成分分析
复合酒氨基酸成分分析见表6。
表6 复合酒氨基酸成分分析
Table 6 Amino acid composition analysis of compound wine
注：*表示必需氨基酸。
氨基酸种类含量/（mg/L）红米酒 青钱柳红米复合酒天门冬氨酸Asp 457 943苏氨酸*Thr 214 408丝氨酸*Ser 267 536谷氨酸Glu 634 1 450甘氨酸Gly 222 472丙氨酸Ala 319 602胱氨酸Cys 2.7 84.2缬氨酸*Val 242 470蛋氨酸Met 17.9 32.2异亮氨酸*lle 161 307酪氨酸Tyr 120 255苯丙氨酸*Phe 204 418赖氨酸Lys 313 529组氨酸His 171 214精氨酸Arg 275 739脯氨酸Pro 252 517
由表6可知，红米酒和青钱柳红米复合酒中均含16种氨基酸，其中必需氨基酸均为5种，氨基酸总含量分别为3 871.6 mg/L、7 976.4 mg/L，由此可见添加青钱柳后，青钱柳红米复合酒中的总氨基酸得到了成倍增加，提高了青钱柳红米复合酒的营养价值。根据蒋滢等[29]的报道，不同的氨基酸呈现不同的味觉，可将氨基酸分为甜味、苦味、酸味、鲜味氨基酸，本研究中添加青钱柳后，青钱柳红米复合酒中的每种氨基酸含量均高于红米酒，因此添加青钱柳会使青钱柳红米复合酒的甜味、苦味、酸味、鲜味得到提升，使青钱柳红米复合酒的口感更加丰富。
3 结论
本研究通过制备青钱柳浸提液，巴拉吉红米浸泡、蒸煮，再添加微生物复合菌种进行发酵，以微生物复合菌种接种量、发酵温度、发酵时间、红米与青钱柳浸渍液料液比为考察对象进行单因素和正交试验，测定发酵液酒精度，确定了青钱柳红米复合酒发酵的最佳工艺为红米与青钱柳浸渍液料液比为1∶1.0（g/mL）、微生物复合菌种接种量0.8%、发酵温度30℃、发酵时间10 d。在最优条件下，得到的青钱柳红米复合酒的酒精度为16.3%vol、还原糖为9.1 g/L、总酸为6.1 g/L、总酯为0.71 g/L，含有铁、铜、锌、锰和硒等微量元素。经过安全性指标分析表明，该青钱柳红米复合酒中的微生物符合要求，有毒有害物质未超标。成分分析表明，青钱柳红米复合酒含植物多糖573.2 mg/100 g、黄酮196.3mg/100g、总酚 201.2mg/100g、γ-氨基丁酸 24.2mg/100 g；含有16种氨基酸，其中5种为必需氨基酸，氨基酸总含量为7 976.4 mg/L；此外还含有0.039 mg/kg的硒元素。通过试验证明，青钱柳复合红米发酵生产的青钱柳红米复合酒是一种富含营养成分的发酵食品。此外，本研究发现青钱柳红米复合酒含有黄酮、多酚，今后可对其抗氧化功能进行研究。
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