啤酒是以麦芽、水、啤酒花为主要原料，经酵母发酵含有二氧化碳，起泡的，低酒精度的发酵酒[1]。随着经济的不断发展，添加辅料的新兴保健啤酒出现在大众眼前，如姜汁保健啤酒[2]、中药保健啤酒[3]、菊花保健啤酒[4]等。目前，保健啤酒的研究成果虽然很多，但少数能实现规模化生产。因此，增加啤酒品种，大力发展保健啤酒，将会是未来啤酒工业的一个新的发展方向[5]。
口蘑[6]又名白蘑、白蘑菇、蒙古口蘑等，富含多种生物活性物质，包括多糖[7]、多肽[8]、总酚酸[9]、漆酶[10]等。口蘑多糖[11]是由糖苷键结合在一起的单糖单元组成的碳水化合物聚合物，具有抗氧化[12-13]、抗肿瘤[14-15]、增强免疫力[16]等多种活性作用，在医药、食品、保健食品等领域得到广泛的应用。
目前鲜见以口蘑为原料制作的啤酒，本研究以口蘑多糖提取液和大麦芽为原料，酿造口蘑啤酒。以酒精度和感官评分为指标，通过单因素试验确定口蘑多糖啤酒的适宜条件，采用响应面优化发酵工艺，为口蘑多糖啤酒的工业化提供技术支持和理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
口蘑、澳麦芽、萨兹啤酒花：市售；CN36安琪啤酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；邻苯二胺：上海罗恩化学技术有限公司；3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；对二甲氨基苯甲醛：西陇科学股份有限公司；硫酸：天津市鑫桥化工贸易有限公司；苯酚：天津市江天化工技术有限公司；二甲氨基苯甲醛：天津市光复精细化工研究所；异戊醇、异丁醇：天津市光复科技有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
WZS 32 Brix 0-32%型手持式折射仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；XFH-30CA型高压蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；6202型高速粉碎机：欣镇精密企业有限公司；酒精计：武强县恒翔仪器仪表有限公司；LR10-2.4A高速冷冻离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；TU-1810型紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；101-1ASB电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；6202高速粉碎机：欣镇精密企业有限公司；PHS-2F PH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 口蘑多糖提取
挑选新鲜口蘑洗净置于55℃烘箱烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎，将粉碎好的口蘑粗粉装在保鲜袋室温25℃保存。口蘑多糖采用热水浸提法提取[17]。取4 g口蘑粗粉，加入蒸馏水，料液比1∶30（g/mL），提取温度90℃，提取时间3 h，3 000 r/min离心10 min，过滤取上清液，4℃冰箱保存备用。
1.3.2 口蘑提取液多糖含量测定
口蘑提取液总糖含量测定参照文献[18]的方法稍加改动，适当稀释口蘑多糖提取液，取1 mL稀释液，加入1 mL蒸馏水，1 mL 6%苯酚溶液以及5 mL浓硫酸，摇匀，室温25℃静置30 min后于490 nm波长测定吸光度，用2.0 mL蒸馏水作为空白对照。
口蘑提取液还原糖含量测定参照高文军等[19]的方法稍加改动。适当稀释口蘑多糖提取液，取1 mL稀释液加入 2 mL 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂，沸水浴中加热2 min后然后迅速冷却，加入9.0 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm波长处测定吸光度，以1.0 mL蒸馏水作为空白对照。
口蘑多糖含量的计算公式如下。
多糖含量/（mg/mL）=（总糖含量-多糖含量）×0.9
1.3.3 工艺流程
具体步骤：将大麦用粉碎机粉碎过40目筛，大麦粉与水比例为1∶4（g/mL）进行浸出糖化过滤得到麦芽汁，麦芽汁煮沸过程中保持沸腾50 min，啤酒花加入量为0.1%，调整麦芽汁浓度为10°P，接入酵母量为0.8 g/L进行发酵。设定主发酵时间8 d，后发酵时间10 d，在后发酵结束后进行官评价和理化检测。
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 主发酵温度对口蘑多糖啤酒的影响
将得到的麦汁过滤后分装于三角瓶中，麦汁体积为200 mL，进行煮沸。设定主发酵温度分别12、14、16、18、20℃，并且在主发酵阶段加入口蘑多糖提取液，口蘑多糖提取液添加量为5.0 mL，其他工艺按照1.3.3操作，考察主发酵温度对口蘑多糖啤酒的影响。
1.3.4.2 口蘑多糖提取液添加量对口蘑多糖啤酒的影响
将得到的麦汁过滤后分装于三角瓶中，麦汁体积为200 mL，进行煮沸。在主发酵过程分别向麦汁中添加口蘑多糖提取液 1.0、3.0、5.0、7、9.0 mL。设定主发酵温度为16℃，其他工艺按照1.3.3操作，考察口蘑多糖提取液添加量对口蘑多糖啤酒的影响。
1.3.4.3 口蘑多糖提取液加入阶段对口蘑多糖啤酒的影响
将得到的麦汁过滤后分装于三角瓶中，麦汁体积为 200 mL，进行煮沸。分别在煮沸 20、30、40 min、主发酵、后发酵阶段添加口蘑多糖提取液。设定主发酵温度为16℃口蘑多糖添加量为5.0 mL，其他工艺按照1.3.3操作，考察口蘑多糖提取液加入阶段对口蘑多糖啤酒的影响。
1.3.5 响应面法优化试验
以酿造口蘑多糖啤酒的单因素试验结果为依据，以影响啤酒酒精度和感官评分的主发酵温度、口蘑多糖提取液添加量、口蘑多糖提取液加入时机为试因素，感官评分为响应值，以Box-Behnken为原理建立三因素三水平的中心组合试验。响应面法试验因素水平见表1。
表1 Box-Behnken中心组合试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design
水平C口蘑多糖提取液加入阶段-1 15 4.0 煮沸后40 min 0 16 5.0 主发酵1 17 6.0 后发酵因素A主发酵温度/℃ B口蘑多糖提取液添加量/mL
1.3.6 感官评分标准
参照 GB/T 4928—2008《啤酒分析法》和 GB/T 4927—2008《啤酒》对口蘑多糖啤酒的色泽、香气、泡沫、口感进行感官评定。感官评分见表2。
表2 口蘑多糖啤酒评分标准
Table 2 Scoring standards of Tricholoma mongolicum polysaccharide beer
项目 评分标准 分数色泽（25） 色泽金黄，无悬浮物 16～25色泽均匀，无悬浮物 6～15色泽不均匀，颜色 ≤5香气（25） 明显口蘑香气，花与口蘑香气协调 16～25口蘑香气不足，酒香与口蘑香气协调 11～15无口蘑香味或有异味 ≤10泡沫（20） 泡沫细腻、持久，洁白 11～20泡沫不细腻、持久，洁白 6～10泡沫不细腻、不持久，不洁白 ≤5口感（30） 口感醇正，无异味 20～30口感粗糙，无异味 6～19口感不协调，有异味 ≤5
1.3.7 指标测定
1.3.7.1 酒精度的测定
参考文献[20]的方法，采用蒸馏法测量酒精度。
1.3.7.2 总酸的测定
参考文献[21]方法，采用电位滴定法测定总酸含量。
1.3.7.3 双乙酰的测定
参考文献[22]的方法进行双乙酰含量测定。
1.3.7.4 色度的测定
参考文献[23]的方法，采用紫外分光光度计法测量啤酒色度。
1.3.7.5 杂醇的测定
参考文献[24]的方法，采用紫外分光光度法测定啤酒中杂醇含量。
1.3.8 数据分析
响应面试验设计及分析采用Design Expert 8.0.6，采用Origin 2022软件进行图形绘制。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
以葡萄糖为标准品，苯酚-硫酸法测得的标准曲线如图1。
图1 苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线
Fig.1 Standard curve of phenol-sulfuric acid method for glucose
以葡萄糖为标准品，DNS法测得的标准曲线见图2。
图2 DNS葡萄糖标准曲线
Fig.2 Standard curve of glucose by DNS method
2.2 单因素试验结果与分析
2.2.1 主发酵温度对口蘑多糖啤酒的影响
主发酵温度对口蘑多糖啤酒的影响见图3。
图3 主发酵温度对口蘑多糖啤酒的影响
Fig.3 Effect of main fermentation temperature on the Tricholoma mongolicum polysaccharide beer
由图3可知，随着发酵温度的升高，口蘑多糖啤酒感官评分和酒精度均呈先升高后降低的趋势。当主发酵温度为16℃，酒精度为4.92%vol，感官评分为75.55。当主酵温度较低时，酵母发酵速度缓慢，产生的酯香味淡薄；当主发酵温度较高时，酵母代谢能力增强，发酵速度快，产生副产物高级醇等含量高，产酒精能力增强，对整体口感影响大[25]。因此，主发酵温度为16℃合适口蘑多糖啤酒。
2.2.2 口蘑多糖提取液添加量对口蘑多糖啤酒的影响
口蘑多糖提取液添加量对口蘑多糖啤酒的影响见图4。
图4 口蘑多糖提取液添加量对口蘑多糖啤酒的影响
Fig.4 Effect of Tricholoma mongolicum polysaccharide extract addition on the T.mongolicum
由图4可知，随着口蘑多糖提取液添加量的增加，酒精度和感官评分均呈先升高后降低的趋势。当口蘑多糖提取液的添加量为5.0 mL时，酒精度为4.68%vol，感官评分为84.8，麦芽香和口蘑香味突出。当口蘑多糖提取液添加量较低时，感官得分较低，由于口蘑多糖提取液添加量过低，造成口蘑香气口感不突出；而口蘑多糖提取液添加量过高，又会导致口蘑香味覆盖麦芽和酒花的香味，使得产品口感单薄[26]。所以将口蘑多糖提取液的添加量选为5.0 mL较为合适。
2.2.3 口蘑多糖提取液加入阶段对口蘑多糖啤酒的影响
口蘑多糖提取液加入阶段对口蘑多糖啤酒的影响见图5。
图5 口蘑多糖提取液加入阶段对口蘑多糖啤酒的影响
Fig.5 Effect of Tricholoma mongolicum polysaccharide extract adding stage on the T.mongolicum polysaccharide beer
1～5分别为麦汁煮沸后10 min、麦汁煮沸后30 min、麦汁煮沸后40 min、主发酵、后发酵。
由图5可知，随着口蘑多糖提取液加入阶段的改变口蘑多糖啤酒的酒精度基本保持稳定，感官评分呈现先升高后降低，在煮沸阶段加入口蘑多糖提取液，煮沸时间过长，影响口蘑多糖啤酒口感，造成口蘑香气不足，在主发酵阶段添加口蘑多糖提取液，口蘑香气突出，酒精度为4.46%vol，感官评分最高为79.8。在后发酵加入口蘑多糖提取液，口蘑香气太重，造成口蘑多糖啤酒口感和气味不协调[27]。所以将口蘑多糖提取液的加入阶段为主发酵较为合适。
2.3 响应面试验结果与分析
2.3.1 口蘑多糖啤酒发酵工艺优化回归分析
响应面优化试验见表2。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Box-Behnken design and results
编号 A主发酵温度/℃感官评分1 -1（1 5） -1（4） 0（主发酵） 8 1.3 2 1（1 7） -1 0 9 0.0 3 -1 1（6） 0 8 0.1 4 -1 1 0 8 0.9 5 -1 0（5） -1（煮沸后 4 0 m i n） 8 0.3 6 -1 0 -1 8 2.6 7 -1 0 1（后发酵） 7 9.1 8 -1 0 1 8 4.8 9 0（1 6） -1 -1 8 2.4 1 0 0 1 -1 7 9.9 1 1 0 -1 1 8 2.5 1 2 0 1 1 7 9.5 1 3 0 0 0 8 7.5 1 4 0 0 0 8 7.8 1 5 0 0 0 8 9.5 1 6 0 0 0 8 8.3 1 7 0 0 0 8 8.5 B口蘑多糖提取液添加量/m L C口蘑多糖提取液加入阶段
由表2可知，以感官评分（Y）为因变量，主发酵温度（A）、口蘑多糖提取液添加量（B）和口蘑多糖添加阶段（C）为自变量，进行回归拟合，方程如下。
回归方程分析见表3。
表3 回归方程分析
Table 3 Regression equation analysis
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 239.69 9 26.63 32.48 ＜0.000 1 **A 38.28 1 38.28 46.68 0.000 2 **B 31.20 1 31.20 38.05 0.000 5 **C 0.061 1 0.061 0.075 0.792 5 AB 15.60 1 15.60 19.03 0.003 3 **AC 2.89 1 2.89 3.52 0.102 6
续表3 回归方程分析
Continue table 3 Regression equation analysis
注：*表示差异显著（p＜0.05）；**表示差异极显著（p＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性BC 0.063 1 0.063 0.076 0.790 5 A2 22.47 1 22.47 27.40 0.001 2 **B2 36.27 1 36.27 44.23 0.0030 **C2 78.22 1 78.22 95.38 ＜0.000 1 **残差 5.74 7 0.82失拟项 3.37 3 1.12 1.90 0.271 1 不显著纯误差 2.37 4 0.59总误差 245.43 16
由表3可知，在感官评价中回归模型p＜0.01，表示差异极显著（p＜0.01），失拟项 P=0.271 1＞0.05，失拟项差异不显著；由F值可知，3个因素影响大小关系为A＞B＞C；一次项 A、B、交互项 AB 及二次项 A2、B2、C2对感官评分的影响极显著（p＜0.01）；一次项C和交互项AC、BC对结果影响不显著；方差分析表明该模型不存在失拟因素，拟合程度好，可用于分析口蘑多糖啤酒感官的评分。
2.3.2 响应面分析
响应面分析见图6。
图6 各因素交互作用对感官评分的影响
Fig.6 Influence of interaction of various factors on the sensory score
由图6可以看出，主发酵温度与口蘑多糖提取液添加量交互作用最强，其次是主发酵温度与口蘑多糖提取液加入阶段，而口蘑多糖提取液添加量与口蘑多糖提取液加入阶段交互作用最弱。
模型预测最优条件为主发酵温度为16℃、口蘑多糖提取液加入量为4.41 mL，口蘑多糖提取液加入阶段为主发酵期间。在此条件下口蘑多糖啤酒感官评分最高为89.715 9。为进一步确定口蘑多糖啤酒在实际生产中的可靠性与可行性，方便于实际操作，将工艺条件修改为主发酵温度16℃、口蘑多糖提取液加入量4.4 mL、口蘑多糖提取液加入阶段为主发酵期间，并以其为条件进行扩大性试验验证，经品评后，感官评分为90.0，与模型预测值89.715 9分基本一致，表明模型有效可靠。
2.4 口蘑多糖啤酒理化分析
在主发酵温度16℃、口蘑多糖提取液加入量4.4 mL，主发酵加入口蘑多糖提取液条件下，对口蘑多糖啤酒色度、酒精度、总酸及杂醇等含量进行检测，结果见表4。
表4 口蘑多糖啤酒理化分析
Table 4 Physical and chemical analysis of the Tricholoma mongolicum polysaccharide beer
种类色度/EBC杂醇含量/（mg/L）酒体酵母数量（个/100 mL）双乙酰含量/（mg/L）酒精度/%vol总酸含量/（mL/100 mL）国家标准 ＜14 ≤0.100 ≥3.70 ≤2.60口蘑多糖啤酒 7.2 103.45 1.3×104 0.075 5.14 2.00
由表4可知，在最优发酵工艺条件下，口蘑多糖啤酒均符合GB/T 4928—2008《啤酒分析法》和GB/T 4927—2008《啤酒》。口蘑多糖啤酒色泽金黄，无悬浮物，泡沫较持久洁白，细腻，具有和谐的酒香，口蘑香和麦芽香，口感醇正，无异味。
3 结论
本研究采用单因素试验和响应面法分析对口蘑多糖啤酒酿造工艺条件进行优化。结果表明，口蘑多糖啤酒最佳酿造工艺条件为主发酵温度16℃、口蘑多糖提取液加入量为4.4 mL，口蘑多糖提取液加入阶段为主发酵阶段，其感官评分为90。在最优发酵工艺条件下进行理化指标检测，口蘑多糖啤酒符合GB/T 4928—2008《啤酒分析法》和GB/T 4927—2008《啤酒》，酒体色泽呈金黄，无明显悬浮物；泡沫持久洁白，细腻；具有口蘑、麦芽特有香气；口感醇正，无酸味。本研究为口蘑多糖啤酒的发酵生产可行性提供了理论和实践基础，对口蘑的有效利用有重要的指导和意义。
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