糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种多病因引起的慢性代谢性疾病，其特征是持续的高血糖水平[1]，糖尿病会引发多种并发症，严重时会导致残疾、死亡等[2-3]。在过去的几十年里，已经开发出了越来越多的药物用来缓解糖尿病，但这些药物有一定的副作用。植物来源的化合物正在成为对抗糖尿病等代谢疾病的有利替代品[4]。
新橙皮苷二氢查耳酮（neohesperidin dihydrochalcone，NHDC）是从天然柑橘植物中提取到的新橙皮苷氢化而成的黄酮类衍生物，属于甜味剂，甜度是葡萄糖的1 500倍～1 800倍[5]。俞福惠等[6]发现NHDC具有强烈的甜味和极佳的屏蔽苦味的功效，能降低人体对饮料或医药中苦味的敏感程度，因而在医药领域有着广泛的应用。Takii等[7]在研究酚苷类物质降血糖活性中已经初步证明了NHDC能够降低小鼠的血糖含量，但关于NHDC降血糖活性的研究并没有新的进展。虽然关于NHDC降血糖方面的研究较少，但与其具有相似结构的橙皮苷等柑橘类黄酮的降血糖活性一直是研究热点，例如橙皮苷能够通过改善葡萄糖代谢相关酶的活性[8-11]、刺激β细胞胰岛素分泌[12]、增强胰岛素敏感作用[13]等发挥降血糖作用，柑橘黄酮能够通过抑制糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的活性来促进糖原合成，从而起到调节血糖的作用[14]。
斑马鱼是发育生物学、遗传学、毒理学、药理学等研究领域的理想脊椎动物[15]。研究表明斑马鱼血糖调控机制与哺乳动物高度一致[16-17]，斑马鱼产卵量大，生长周期短，在同样使用葡萄糖浸泡法的情况下，成年斑马鱼造模时间长（＞14 d），而受精120 h后的斑马鱼幼鱼却能快速建立糖尿病模型（＜5 d），大大缩短了实验周期，有效提高了整体实验效率，并且幼鱼体内与糖代谢相关的胰岛等器官已发育完全，能够作为评价天然化合物抗糖尿病研究的动物模型。基于上述研究，本文以幼鱼糖含量为评价指标，参照文献[16，18]的方法建立斑马鱼幼鱼高血糖模型，在建立高血糖模型的同时，拟用NHDC进行干预，通过测定葡萄糖、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、胰岛素、糖原含量评价其降血糖活性，为新橙皮苷二氢查耳酮的开发利用及降血糖药物筛选提供参考。
1 材料与方法
1.1 动物、试剂与仪器
斑马鱼胚胎：由野生WT品系雌雄鱼自然交配而得，WT品系斑马鱼由北部湾大学食品工程学院海洋资源开发与利用课题组提供。
葡萄糖（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；四氧嘧啶（≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；新橙皮苷二氢查耳酮（≥95%）：上海麦克林生化科技有限公司；阿卡波糖（≥98%）：杭州中美华东制药有限公司；蛋白含量检测试剂盒、葡萄糖检测试剂盒、甘油三酯检测试剂盒、总胆固醇检测试剂盒、糖原检测试剂盒、胰岛素检测试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司。
台式高速冷冻离心机（TGL20）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；罗氏血糖仪（CR2032）：罗氏诊断产品（上海）有限公司；生物恒温箱（SHP-80）：上海森信实验仪器有限公司；全波长酶标仪（Thermo-Multiskan Go）：赛默飞世尔科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 斑马鱼交配产卵
斑马鱼养殖于多水槽自动循环水系统，水温保持在28℃，昼夜循环为14 h光照/10 h避光的条件，使用成鱼交配产卵前，将雌雄按照1∶1分隔放在同一个交配缸，用挡板隔开，次日早晨将板拔掉，让其进行交配，收集2 h内所产的鱼卵，放在含0.5%亚甲基蓝胚胎培养液的培养皿中（每个培养皿放30颗鱼卵），每天早晚更换培养液。
1.2.2 建立斑马鱼高血糖模型
在显微镜下选取发育正常的5 d龄斑马鱼至6孔板中，每孔30尾，分别浸泡在浓度1%、2%、4%、6%和 8%的葡萄糖溶液及浓度为 0.050、0.100、0.200、0.400 mmol/L和0.800 mmol/L的四氧嘧啶溶液中，空白组浸泡于纯水中，于28℃培养箱孵育24 h，统计各实验组存活率，确定四氧嘧啶和葡萄糖的最适浸泡浓度。以血糖水平为指标，确定四氧嘧啶和葡萄糖处理的条件，建立斑马鱼急性高血糖模型。
1.2.3 NHDC干预条件对急性高血糖斑马鱼的降血糖作用
设置空白组、模型组、不同浓度NHDC组、0.1mg/mL阿卡波糖组，于28℃培养箱孵育16 h后检测血糖值，确定最佳降糖作用的药物浓度。
按照相同方法设置空白组、模型组、0.1 mg/mL阿卡波糖组、0.100 mg/mL NHDC组，浸泡20 h，每隔4 h检测血糖值，观察记录其变化趋势，探讨NHDC干预时间对高血糖斑马鱼的降血糖效果。
1.2.4 NHDC处理对斑马鱼糖代谢生化指标的影响
在显微镜下选取发育正常的5 d龄斑马鱼至6孔板中，每孔30尾。设置空白组、模型组、0.100 mg/mL NHDC组，处理16 h后采用试剂盒检测鱼体组织中葡萄糖、TG、TC、糖原、胰岛素含量。
1.2.5 数据处理与分析
每个实验平行重复3次，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 25.0及origin 9.0软件对数据进行处理及绘图（单因素ANOVA显著性分析多组数据差异，Student’s t test分析两组数据差异）。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异较显著，P＜0.005表示差异极显著，P＜0.001表示差异高度显著。
2 结果与分析
2.1 高血糖斑马鱼模型的建立
对斑马鱼幼鱼浸泡在不同浓度四氧嘧啶的存活率进行评价，结果见图1。
图1 四氧嘧啶浸泡浓度对斑马鱼存活率的影响
Fig.1 Effects of alloxan immersion concentration on survival rate of zebrafish
由图1可知，5个浓度处理组的存活率分别为98.0%、97.5%、63.5%、0%、0%。在浸泡浓度为 0～0.100 mmol/L时，斑马鱼幼鱼的存活率高于97.5%，此时四氧嘧啶对斑马鱼造成的损伤较轻，存活率较高；在浸泡浓度为0.100 mmol/L～0.400 mmol/L时，斑马鱼的存活率与浓度呈负相关，在浸泡浓度为0.200 mmol/L时为63.5%；在浸泡浓度≥0.40 mmol/L时，斑马鱼死亡率高至100%。因此，选择用于进一步诱导高血糖模型的四氧嘧啶浸泡浓度范围不超过0.100 mmol/L。
葡萄糖浸泡浓度对斑马鱼存活率的影响见图2。
图2 葡萄糖浸泡浓度对斑马鱼存活率的影响
Fig.2 Effects of glucose immersion concentration on survival rate of zebrafish
由图2可知，野生型斑马鱼幼鱼分别浸泡在葡萄糖浸泡浓度为1%、2%和4%时，存活率为99.0%；而当浸泡浓度为4%～8%时，随着葡萄糖浸泡浓度提升，斑马鱼存活率逐渐下降，浓度为6%时存活率仅为73.5%，浓度为8%时存活率为0%。因此，选择葡萄糖浸泡浓度为4%。
在0～0.100 mmol/L范围内选择3个梯度浓度四氧嘧啶和4%葡萄糖联用浸泡，结果见图3。
图3 不同浓度四氧嘧啶和4%葡萄糖联用对斑马鱼存活率的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of alloxan and 4% glucose combined on survival rate of zebrafish
由图3可知，四氧嘧啶与葡萄糖两者联用浓度为0.050 mmol/L+4%浸泡16 h时存活率为97.5%，16 h后下降，其他联用浓度在浸泡4h后存活率逐渐下降，当浸泡时间超过12h时，斑马鱼血糖值低于3.9 mmol/L，故采用0.050 mmol/L四氧嘧啶+4%葡萄糖浸泡16 h建立斑马鱼急性糖尿病模型。
由于斑马鱼幼鱼体积较小，无法采集血液样本，因此直接取幼鱼鱼体匀浆测定血糖含量。以血糖值作为评价指标，0.050 mmol/L四氧嘧啶+4%葡萄糖联用浸泡16 h后的斑马鱼为高血糖模型组，纯水浸泡为空白组，结果见图4。
图4 四氧嘧啶与葡萄糖联用浸泡对斑马鱼幼鱼血糖值的影响
Fig.4 Effects of combined immersion of alloxan and glucose on blood glucose values of juvenile zebrafish
***表示与空白组相比，差异极显著（P＜0.005）。
如图4所示，模型组血糖值（5.6 mmol/L）与空白组（2.3 mmol/L）差异极显著（P＜0.005），表明模型建立成功。王泽民[19]使用高胆固醇饮食加上3%葡萄糖溶液浸泡诱导斑马鱼幼鱼糖尿病的快速形成，其模型组的葡萄糖值为4.7mmol/L，低于本实验模型组的葡萄糖值，说明四氧嘧啶+葡萄糖联用能够快速建立急性高血糖模型。
2.2 NHDC干预浓度和干预时间对高血糖斑马鱼血糖水平的影响
不同浓度药物对斑马鱼血糖水平的影响见图5。
图5 不同浓度药物对斑马鱼血糖水平的影响
Fig.5 The effects of different concentrations of drugs on blood glucose level of zebrafish
***表示与空白组相比，差异极显著（P＜0.005）；****表示与空白组相比，差异高度显著（P＜0.001）；###表示与模型组相比，差异极显著（P＜0.005）。
如图5所示，在干预16 h后，药物组血糖水平均明显低于模型组，但相比于空白组，0.025、0.050、0.075 mg/mL 3个剂量组血糖水平仍较高，0.100 mg/mL NHDC组血糖值与空白组相比无差异，与阿卡波糖组相当。前期研究发现，用浓度大于0.1 mg/mL NHDC处理斑马鱼后，其死亡率较高（＞70%），因此选定0.100mg/mL为最佳剂量。劳乔聪[18]通过1.00 mmol/L四氧嘧啶+4%蔗糖联用浸泡建立斑马鱼糖尿病模型，在阿卡波糖给药后血糖值明显低于模型组。丁薇娜[20]的研究表明3'-香叶基柑橘查耳酮（100 mg/kg）给药后能明显降低糖尿病小鼠的餐后血糖值，并且降糖作用效果与阿卡波糖（100 mg/kg）相当。阿卡波糖属于临床中常见的α-糖苷酶抑制剂，其作用效果为降低糖尿病患者的餐后高血糖[21]，同样作为柑橘查耳酮的NHDC也具有降血糖作用，与丁薇娜[20]的研究结果一致，因此初步认为NHDC能起到餐后降血糖作用。
NHDC干预时间对斑马鱼血糖水平的影响见图6。
图6 NHDC干预时间对斑马鱼血糖水平的影响
Fig.6 The effect of NHDC administration time on blood glucose of zebrafish
**表示与空白组相比，差异较显著（P＜0.01）；****表示与空白组相比，差异高度显著（P＜0.001）；##表示与模型组相比，差异较显著（P＜0.01）；####表示与模型组相比，差异高度显著（P＜0.001）。
如图6所示，从总体上看干预时间为4 h～20 h时，空白组血糖值无明显变化，模型组血糖水平逐步升高，当斑马鱼在溶液中浸泡4 h时，除空白组外，药物组血糖值均与模型组无明显差异，可能由于阿卡波糖及NHDC餐后降血糖作用起效慢，因此干预4 h的降血糖效果并不明显。0.100 mg/mL NHDC在干预8 h～16 h时间段内血糖值随着时间的延长稳步下降，且始终低于模型组，到16 h时与空白组无差异，其降血糖效果与阿卡波糖相当。表明NHDC降血糖作用随着时间的延长而增加，血糖值下降较为稳定，降血糖作用时间长。
2.3 NHDC对高血糖斑马鱼血脂水平的影响
多数糖尿病患者伴有血脂代谢异常[22]，这是因为糖尿病患者胰岛细胞分泌胰岛素的能力降低，糖代谢紊乱造成脂质代谢发生异常，氨基酸合成脂蛋白酶的能力降低，从而增加了血液当中的脂肪含量，造成血脂异常[23]，通常表现为甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白的升高以及高密度脂蛋白的降低[24]。因此，斑马鱼的葡萄糖、胆固醇和甘油三酯含量可从侧面反映血糖的高低[25]。NHDC给药对斑马鱼葡萄糖含量、TG含量、TC含量的影响见图7～图9。
图7 NHDC给药对斑马鱼葡萄糖含量的影响
Fig.7 The effect of NHDC administration on glucose value of zebrafish
**表示与空白组相比，差异较显著（P＜0.01）；#表示与模型组相比，差异显著（P＜0.05）。
图8 NHDC给药对斑马鱼TG含量的影响
Fig.8 The Influence of NHDC administration on TG content of zebrafish
*表示与空白组相比，差异显著（P＜0.05）；#表示与模型组相比，差异显著（P＜0.05）。
图9 NHDC给药对斑马鱼TC含量的影响
Fig.9 The Influence of NHDC administration on TC content of zebrafish
**表示与空白组相比，差异较显著（P＜0.01）；#表示与模型组相比，差异显著（P＜0.05）。
如图7～图9所示，与空白组相比，四氧嘧啶和葡萄糖处理的模型组的葡萄糖含量、TG含量、TC含量均有一定倍数的增加，而NHDC处理后，葡萄糖含量从0.49 mmol/g降至0.16 mmol/g，降低了67.35%，TG和TC含量分别降低了80.88%和55.31%，与模型组相比差异显著（P＜0.05），因此NHDC能够有效降低高糖环境诱导的斑马鱼高血脂水平。
2.4 NHDC对胰岛素分泌以及糖原合成水平的影响
胰岛素是调节血糖的关键激素，胰岛素与其受体结合后能够激活胰岛素信号通路，抑制糖原合成激酶-3β，并进一步激活糖原合酶（glycogen synthase，GS），通过刺激糖原合成减少肝脏葡萄糖输出[26]，因此当胰岛素分泌减少或生理效应降低会抑制胰岛素信号通路下游GS的激活与表达，直接造成糖原含量的降低，进而引发血糖水平的升高。NHDC给药对斑马鱼胰岛素分泌和糖原合成的影响见图10～图11。
图10 NHDC给药对斑马鱼胰岛素分泌的影响
Fig.10 The effects of NHDC administration on insulin secretion in zebrafish
*表示与空白组相比，差异显著（P＜0.05）；#表示与模型组相比，差异显著（P＜0.05）。
图11 NHDC给药对斑马鱼糖原合成的影响
Fig.11 The effects of NHDC administration on glycogen synthesis in zebrafish
*表示与空白组相比，差异显著（P＜0.05）；#表示与模型组相比，差异显著（P＜0.05）。
如图10～图11所示，四氧嘧啶和葡萄糖处理16 h后，模型组斑马鱼胰岛素含量显著低于空白组（P＜0.05），提示四氧嘧啶和葡萄糖可能造成斑马鱼β细胞功能受损使得胰岛素分泌下降，胰岛素含量的减少导致其生理效应降低，表现为糖原含量的减少（图11）。NHDC处理组与模型组相比，胰岛素分泌水平和糖原水平分别增加了58%（图10）和52%（图11），且与空白组无差异。因此，推测NHDC能够修复受损的胰岛β细胞、刺激胰岛素分泌、提高胰岛素作用的糖原合成水平，从而降低血糖浓度。
3 讨论与结论
四氧嘧啶会选择性破坏胰腺中产生胰岛素的胰岛β细胞，是制备糖尿病模型的常用药物。研究表明，0.050 mmol/L四氧嘧啶和4%葡萄糖浸泡处理16 h造成了幼鱼体内糖脂代谢紊乱，表现为血糖、葡萄糖、TG、TC水平的升高，同时β细胞功能受损使得模型组斑马鱼胰岛素分泌减少，糖原含量下降。胰岛素水平的变化与糖脂代谢和稳态紊乱密切相关，胰岛素生理效应降低会影响糖原合成过程，同时也会降低血糖水平。此外，游离脂肪酸是脂肪酸分解过程中生成的功能物质，胰岛素生理效应的降低会导致游离脂肪酸生成增加，游离脂肪酸含量偏高会导致高脂血症，因此模型组糖脂代谢紊乱的发生与胰岛素分泌下降有关。而0.100 mg/mL NHDC干预后能够刺激胰岛素分泌，恢复葡萄糖、TG、TC、糖原水平。基于这些研究结果，认为NHDC可能通过修复受损β细胞，增加胰岛素生理效应、促进糖原合成来发挥降血糖作用，但其具体降血糖作用的机制还需要再进行更深入的研究。本研究为后期斑马鱼高血糖模型的建立以及黄酮类化合物降血糖作用研究提供了参考，为糖尿病功能食品和治疗药物的开发提供科学依据。
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