益生菌被定义为对人类或其他动物宿主健康具有有益影响的活的微生物[1-2]。许多研究表明，益生菌在缓解或预防人类疾病方面具有有益作用，如便秘[3]、肠易激综合征[4]、炎症性肠病[5]和神经退行性疾病[6]等。此外，研究发现很多益生菌具有恢复和维持肠道健康或平衡口腔微生物群落的功能[7-8]。许多有潜力的益生菌菌株也被分离筛选出来，有望被添加到食品或微生态药物中，给人类带来健康益处，预防或治疗人类疾病[9-10]。与此同时，对菌株进行全面系统的安全性评价也非常重要，这是菌株作为功能性原料被广泛使用的前提和基础。
kefir是一种黏稠、含微碳酸、对健康有许多益处的传统发酵乳，是益生菌的良好来源[11-13]。在前期研究中，从西藏采集的kefir粒中分离筛选出一株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3，它具有高产胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）[14-15]、显著改善乳制品质地、延长乳品保质期的特性[16]。功能实验证实，ZW3具有调节肠道微生物群、改善抑郁样行为障碍、减少免疫炎症[17]等功效。马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3是一种很有潜力的食品原料或功能成分，可应用于食品工业和疾病预防及治疗领域。然而目前国内外关于马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的综合毒理学评价研究报道较少。因此，本研究旨在通过大鼠急性经口毒理实验、细菌回复突变实验、哺乳动物红细胞微核实验和体外哺乳类细胞染色体畸变实验，评估马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的遗传毒性、致突变、潜在致癌作用及食用安全性，为其应用作食品原料提供参考。
1 材料与方法
1.1 菌株及主要试剂
马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3：天津科技大学微生物资源与开发实验室分离鉴定；马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3冻干菌粉（活菌浓度6×1010CFU/g）：诺佰克（武汉）生物科技有限公司；血液稀释液、溶血剂：上海东湖生物医学有限公司；叠氮钠、琼脂粉（生物纯）：美国Amresco公司；环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）：德国 Baxter Oncology GmbH 公司；敌克松、1，8-二羟基蔥醌蔥：德国Dr.EhrenstorferGmbH公司；DME/F12 1∶1（体积比）无血清培养液、磷酸盐缓冲液（pH值7.2～7.4）：美国 HyClone公司；葡萄糖-6-磷酸盐（分析纯）：美国SIGMARLife Science公司；2-氨基菊、丝裂霉素 C（mitomycin C，MMC）、秋水仙素：美国默克公司；L-组氨酸（分析纯）、D-生物素（分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；氯化钾、氯化镁、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氯化钠、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、柠檬酸、磷酸氢钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 实验动物
急性经口毒理实验选择7～8周龄、SPF级的SD大鼠20只，雌雄各半，体重：180 g～220 g。哺乳动物红细胞微核实验选择7～12周龄、SPF级的昆明小鼠50只，雌雄各半，体重：25 g～35 g。实验动物均由湖北省实验动物研究中心提供。
1.3 实验细胞株
中国仓鼠卵巢细胞株（CHO-K1细胞株）：中国典型培养物保藏中心（武汉大学）；5株鼠伤寒沙门氏菌菌株（组氨酸缺陷型 TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535）：美国 moltox公司。
1.4 主要仪器设备
MEK-6318K型自动血球计数仪：日本光电工业株式会社；MCO-18AIC（UV）CO2培养箱：日本 SANYO公司；SW-CJ-2F超净工作台：苏州安泰空气净化有限公司；DMIL LED倒置显微镜、DM500 R H三目生物显微镜：德国徕卡微系统股份公司。
1.5 方法
1.5.1 急性经口毒性实验
实验参考GB 15193.3—2014《食品安全国家标准急性经口毒性试验》[18]中限量法进行。实验动物2只同性别一笼，共10笼进行饲养。设定一次灌胃剂量为10.0 g/kg体重，准确配制浓度为0.5 g/mL的ZW3菌液，以20 mL/kg体重剂量对每只大鼠进行灌胃。观察期14 d，灌胃当天停留0.5 h连续观察，其余时间每日上、下午各观察1次大鼠临床体征，记录动物中毒症状及死亡数，并对异常情况作详细记录；实验前后测量并记录动物体重；分别在给予受试物前，给予受试物后1、24、48、72 h及实验结束时，对所有动物各测量1次肛温；在适应性喂养期、给药后24 h和实验结束时，对所有存活的动物进行尾静脉采血并测量血液学指标；最后，颈椎脱位处死动物，收集并观察动物各组织器官情况。
1.5.2 细菌回复突变实验
实验参考GB 15193.4—2014《食品安全国家标准细菌回复突变试验》[19]进行测定。实验设置3个对照组，即自发回变对照组、阴性对照组（1和2，1为蒸馏水，2为DMSO）、阳性对照组（敌克松、叠氮钠、2-氨基芴、1，8-二羟基蒽醌）。准确配制浓度为 50、20、8、3.2 和1.28 mg/mL的ZW3菌液；将0.1 mL各剂量ZW3菌液和0.5 mL S9（需要活化时）加入测试平板顶部琼脂中，混合并倒入底层培养基平板上，制备出5个剂量组的测试平板，每个剂量组均设含或不含S9代谢活化系统的两个组别。每个菌株测试组和每个对照组在每个浓度下做3组平行，且在相同条件下重复整个测试一次。以上所有平板均在37℃下孵育48 h～52 h，计算每个培养皿中回变的菌落数并进行结果分析。
1.5.3 哺乳动物红细胞微核实验
实验参考GB15193.5—2014《食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验》[20]进行。实验设置阴性对照组、阳性对照组和高、中、低剂量组。对小鼠进行适应性喂养3 d后，随机分成5组，每组雌雄各5只，同性别5只一笼进行饲养。实验开始前，给动物称重，并排除疾病或其他异常迹象；准确配制浓度为500、250、125 mg/mL的ZW3菌液，供高、中、低剂量灌胃使用；通过管饲法，对每组小鼠进行两次灌胃，两次灌胃间隔24 h，小鼠灌胃容量均为20 mL/（kg体重/次），阴性对照组给予无菌蒸馏水，阳性对照组给予40 mg/kg体重的环磷酰胺溶液，高、中、低剂量组分别给予 10、5.0、2.5 g/kg 体重的ZW3菌液；第二次灌胃后6 h处死动物，取动物股骨骨髓，按照标准要求制片、观察、统计数据并分析，实验结果以P＜0.05被判定为具有显著性差异。
1.5.4 体外哺乳类细胞染色体畸变实验
实验参考GB 15193.23—2014《食品安全国家标准体外哺乳类细胞染色体畸变试验》[21]进行。实验设置高、中、低3个测试剂量组（ZW3浓度分别为5 000、2 500、1 250 μg/mL），阴性对照组（等量无血清培养液），阳性对照组1（终浓度为15 μg/mL的环磷酰胺）和阳性对照组2（终浓度为0.8 μg/mL的丝裂霉素C），其中各剂量组及阴性对照组均分别设置加和不加S9代谢活化系统的组别，而阳性对照组1为加S9、阳性对照组2为不加S9的情况下测试。中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1经48 h培养（37℃，5%CO2）后，弃其培养液，各组分别暴露于受试物（或对照），培养4 h后弃上清，用生理盐水洗涤3次，加入5 mL含10%胎牛血清的培养液，培养24h。在收获前4 h，加入秋水仙素（终浓度为1 μg/mL），按常规方法消化、低渗、固定、制片、染色。每剂量组选200个分散良好的中期分裂相细胞，观察记录染色体畸变类型及畸变数目，计算细胞畸变率（裂隙和多倍体单独记录不作为畸变率统计），计算公式如下。
1.6 数据处理
急性经口毒性实验数据采用Microsoft Excel软件建立数据库，计量资料采用t检验，计数资料采用非参数统计法，并按动物性别分别统计。其他实验数据采用SPSS软件建立数据库，采用卡方检验对数据进行统计。
2 结果与讨论
2.1 大鼠急性经口毒性实验结果
实验前后动物体重见表1，大鼠肛温检测结果见表2，血常规指标检测结果见表3。
表1 大鼠急性经口毒性实验结果
Table 1 Summary of acute oral toxicity test results in rats
性别 剂量/（g/kg体重）动物数 动物体重/g 死亡动物数LD50/（g/kg体重）初重 终重雌 10.0 10 187.6±2.7 243.1±9.2 0 ＞10雄 10.0 10 195.3±7.0 336.7±25.4 0 ＞10
表2 大鼠肛温检测结果
Table 2 Rat anal temperature test results
性别剂量/（g/kg体重）动物数肛温/℃给药前 给药后1 h 给药后24 h 给药后48 h 给药后72 h 实验结束雌10.0 10 37.2±0.7 37.3±0.7 37.3±0.4 37.3±0.4 37.4±0.5 37.4±0.4雄10.0 10 37.5±0.7 37.2±0.4 37.5±0.6 37.4±0.4 37.5±0.6 37.6±0.5
表3 大鼠血常规指标检测结果
Table 3 Rat blood routine index test results
性别 剂量/（g/kg体重） 动物数 时间 白细胞/（×109/L）红细胞/（×1012/L）血红蛋白/（g/L） 淋巴细胞/% 单核细胞/% 粒细胞/%雌10.0 10 适应性喂养期 14.1±3.9 7.06±0.37 142±8 68.8±6.5 5.7±0.9 25.5±6.6药后 24 h 14.4±2.2 7.02±0.76 138±13 66.4±8.4 5.4±0.7 28.2±8.4实验结束 13.8±3.7 6.92±0.88 143±15 70.4±7.5 5.2±0.9 24.4±7.1雄10.0 10 适应性喂养期 14.6±3.4 6.80±0.59 127±12 67.5±5.1 5.8±1.8 26.7±5.5药后 24 h 14.3±1.9 6.84±0.83 122±8 68.4±6.2 5.4±1.6 26.1±5.9实验结束 13.9±3.5 6.99±0.48 128±18 70.0±5.0 5.4±1.3 24.7±4.3
由表1可知，雌雄大鼠体重变化情况符合动物正常生长规律。由表2可知，雌性和雄性大鼠灌胃ZW3前后直肠温度相似，差异不明显。由表3可知，雌雄大鼠灌胃ZW3前后白细胞、红细胞、血红蛋白、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞值，均无明显差异，且动物灌胃ZW3后的血液学指标与其他益生菌如M1[22]、唾液乳杆菌REN[23]、发酵乳杆菌HM3和布氏乳杆菌FD2[24]的相关研究结果相似。在整个14 d的观察期内，未见受试动物死亡或出现明显中毒反应症状，运动活动、呼吸、消化和神经系统表现正常，皮肤、毛发、眼睛、口腔等均未见异常，水分和饲料摄取量正常。处死实验动物后检查胸腹部主要脏器，包括心脏、肺、肝、脾、肾、胃肠和生殖器，均无任何明显的病理改变。上述结果表明在本实验条件下，马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的大鼠急性经口毒性LD50大于10.0 g/kg体重，按照急性毒性分级标准，属于实际无毒级。
2.2 细菌回复突变实验结果
细菌回复突变第一次及重复实验阳性对照物结果见表4和表5。细菌回复突变第一次及重复实验结果见表6和表7。
表4 细菌回复突变实验第一次实验阳性对照物结果
Table 4 Positive control result for the first experiment of Ames test
注：+S9表示含S9代谢活化系统；-S9表示不含S9代谢活化系统。
组别 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9阳性物计量/（μg/皿）2-氨基芴50.0菌落数 1 122±71 1 191±80 913±62 912±100 1 183±122 1 202 ±64 1 080±155 1 163±115 588±111 679±83敌克松50.0 2-氨基芴10.0敌克松50.0 2-氨基芴10.0叠氮钠2.0 2-氨基芴10.0敌克松50.0 1，8-二羟基蔥醌50.0叠氮钠2.0
表5 细菌回复突变实验重复实验阳性对照物结果
Table 5 Positive control result for the repeat test of Ames test
注：+S9表示含S9代谢活化系统；-S9表示不含S9代谢活化系统。
组别 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9阳性物计量/（μg/皿）2-氨基芴50.0菌落数 1 092±80 1 205±77 936±129 879±44 1 120±79 1 119±94 1 234±70 1 178±93 607±74 600±30敌克松50.0 2-氨基芴10.0敌克松50.0 2-氨基芴10.0叠氮钠2.0 2-氨基芴10.0敌克松50.0 1，8-二羟基蔥醌50.0叠氮钠2.0
表6 细菌回复突变实验第一次实验结果
Table 6 First test results of Ames test
注：+S9表示含S9代谢活化系统，-S9表示不含S9代谢活化系统；ZW3组1～ZW3组5表示浓度分别为128、320、800、2000 μg/皿和5000 μg/皿。
自发回复突变组TA97a -S9 101±15 110±18 105±12 112±8 115±8 117±12 119±17 124±13+S9 114±11 120±12 129±6 114±8 128±2 114±9 120±17 130±22 TA98 -S9 33±3 34±6 38±6 38±8 33±2 31±2 33±3 28±4+S9 32±5 35±4 30±3 32±3 35±2 34±5 37±4 39±6 TA100 -S9 152±11 152±19 154±22 158±12 146±7 169±17 180±31 181±20+S9 151±16 156±24 145±14 146±4 137±15 168±39 133±16 166±15 TA102 -S9 303±11 302±17 310±21 313±11 302±11 300±14 309±28 297±18+S9 304±20 306±13 307±9 301±20 315±9 297±22 317±23 319±17 TA1535 -S9 11±1 13±5 16±4 13±3 13±3 11±2 14±4 14±4+S9 13±5 12±2 16±5 16±4 16±3 16±3 10±1 13±6组别 ZW3组1 ZW3组2 ZW3组3 ZW3组4 ZW3组5 溶媒对照组1（蒸馏水）溶媒对照组2（DMSO）
表7 细菌回复突变实验重复实验结果
Table 7 Repeat test results of Ames test
注：+S9表示含S9代谢活化系统，-S9表示不含S9代谢活化系统；ZW3组1～ZW3组5表示浓度分别为128、320、800、2000 μg/皿和5000 μg/皿。
自发回复突变组TA97a -S9 110±8 109±16 115±4 108±6 114±10 126±16 118±26 120±6+S9 118±9 123±3 120±20 118±15 120±21 130±13 127±9 125±17 TA98 -S9 33±5 39±9 39±10 38±4 34±5 37±5 36±6 32±4+S9 41±4 39±6 42±4 36±8 40±5 35±11 30±5 37±9 TA100 -S9 153±18 146±9 137±8 150±21 148±20 167±28 176±13 171±10+S9 167±8 170±17 167±18 176±9 158±11 157±29 161±25 166±34 TA102 -S9 304±6 287±I9 310±15 301±6 297±17 302±17 291±9 304±26+S9 300±17 307±23 312±6 301±8 315±11 314±7 306±30 306±16 TA1535 -S9 14±4 15±6 17±3 15±4 17±3 13±5 13±6 15±3+S9 12±5 16±4 15±5 17±3 14±4 17±4 16±6 17±4组别 ZW3组1 ZW3组2 ZW3组3 ZW3组4 ZW3组5 溶媒对照组1（蒸馏水）溶媒对照组2（DMSO）
由表4可知，所有的阳性对照剂在含或者不含S9代谢活化系统中均诱导了回复突变菌落的大幅成倍增加，而由表6可知，添加不同剂量的ZW3，在任何含或者不含S9代谢活化系统及不同测试菌株的组别中，测得的回复突变菌落计数数值，与蒸馏水、DMSO和自发回复突变对照组的数值相似。由表5及表7可知，重复实验结果与第一次实验结果相似。
马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3对5株实验菌株，在含或者不含S9代谢活化系统时，以及设置的各剂量组中，均未产生明显抑菌作用，且各剂量组回变菌落数均未超过溶媒对照组菌落数2倍，且无剂量-反应关系，判定ZW3的细菌回复突变实验结果为阴性。
2.3 小鼠红细胞微核实验结果
小鼠骨髓红细胞微核实验结果见表8。
表8 小鼠骨髓细胞微核实验结果
Table 8 Micronucleus test results of mouse bone marrow cells
注：**表示与阴性对照组比较有极显著差异，P＜0.01；PCE为嗜多染红细胞（polychromatic erythrocytes）；NCE为成熟红细胞（normochromatic erythrocyte）。
性别组别动物数PCE/个NCE/个[PCE/（PCE+NCE）]/%微核观察PCE/个 含微核的PCE/个 微核率/%雌 阴性对照组 5 1 000 860 53.8 10 000 32 0.32±0.06低剂量组 5 1 000 883 53.1 10 000 30 0.30±0.08中剂量组 5 1 000 862 53.7 10 000 31 0.31±0.15高剂量组 5 1 000 877 53.3 10 000 27 0.27±0.10阳性对照组 5 1 000 1083 48.0 10 000 157 1.57±0.26**雄 阴性对照组 5 1 000 885 53.1 10 000 29 0.29±0.12低剂量组 5 1 000 874 53.4 10 000 32 0.32±0.20中剂量组 5 1 000 877 53.3 10 000 28 0.28±0.15高剂量组 5 1 000 869 53.5 10 000 25 0.25±0.08阳性对照组 5 1 000 1 102 47.6 10 000 169 1.69±0.51**
由表8可知，ZW3的各个剂量组中，嗜多染红细胞与红细胞总数的比率[PCE/（PCE+NCE）]均不少于阴性对照组的20%，实验动物及观察样本符合要求。阳性对照组的雌性和雄性小鼠的微核率分别为（1.57±0.26）%和（1.69±0.51）%，均与阴性对照组的微核率有极显著性差异（P＜0.01）；相比之下，ZW3各剂量组的雄性和雌性小鼠的微核率，与阴性对照组的微核率无显著性差异，且均正常值范围内。表明ZW3不会导致哺乳动物嗜多染红细胞含微核细胞率增加，不具有诱导细胞变异的风险。
2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变实验
马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3对CHO-K1细胞的毒性见表9。
表9 马乳酒样乳杆菌ZW3对CHO-K1细胞的毒性
Table 9 Cytotoxicity of L.kefiranofaciens ZW3 on CHO-K1 cells
组别 样品浓度/（μg/mL）细胞存活率/% 细胞相对增长率/%-S9 +S9 -S9 +S9 1 0 91.6 92.7 2 39 92.5 80.9 93.4 77.1 3 78 94.8 92.7 93.4 72.2 4 156 92.9 89.5 109.0 79.6 5 312 87.7 85.4 90.0 77.9 6 625 88.8 93.2 75.7 82.0 7 1 250 90.5 81.1 80.1 73.0 8 2 500 89.2 91.8 80.1 76.3 9 5 000 84.3 83.0 69.0 75.5
由表9可知，当ZW3浓度达到5 000 μg/mL时，在含或不含S9的体系中CHO-K1细胞存活率分别为84.3%和83.0%，细胞相对增长率分别为69.0%和75.5%，且ZW3在5 000 μg/mL浓度下有少量沉淀，因而设置ZW3在体外细胞染色体畸变实验中的最大剂量为 5 000 μg/mL。
ZW3体外哺乳类细胞染色体畸变实验结果见表10。
表10 ZW3体外哺乳类细胞染色体畸变实验结果
Table 10 In-vitro mammalian cell chromosome aberration test results of ZW3
注：**表示与阴性对照组比较有极显著差异，P＜0.01；#表示染色体异常细胞数包括裂隙及多倍体，具体数量在括号中表示，即染色体异常细胞数（裂隙细胞数，多倍体细胞数）；+S9表示含S9代谢活化系统，-S9表示不含S9代谢活化系统。
组别终浓度/（μg/mL）观察细胞数染色体异常细胞数#畸变率/%+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9阴性对照组 0 200 200 25（15，4） 22（12，3） 3.0 3.5阳性对照环磷酰胺组 15 200 76（41，5） 15.0**阳性对照丝裂霉素C组 0.8 200 66（35，3） 14.0**马乳酒样乳杆菌ZW3组 1 250 200 200 24（14，4） 21（13，5） 3.0 1.5 2 500 200 200 24（16，4） 25（15，3） 2.0 3.5 5 000 200 200 22（13，3） 31（18，5） 3.0 4.0
由表10可知，阴性对照组有25个（+S9）和22个（-S9）染色体异常细胞，染色体畸变率分别为3.0%（+S9）和3.5%（-S9）；阳性对照环磷酰胺组有76个染色体异常细胞，丝裂霉素C组有66个，染色体畸变率分别为 15.0%（+S9）和 14.0%（-S9），极显著高于阴性对照组（P＜0.01）。而ZW3的不同剂量组（-S9和+S9），染色体异常细胞和染色体畸变率均与阴性对照组没有显著性差异。表明马乳酒样乳杆菌ZW3体外哺乳类细胞染色体畸变实验结果为阴性。
3 结论
本文通过大鼠急性经口毒性实验、细菌回复突变实验、小鼠红细胞微核实验和体外哺乳类细胞染色体畸变实验对马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3进行了全面的毒理学评估，以支持长期食用马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的安全性。结果表明，大鼠急性经口毒性研究中，在单剂量为10 g/kg体重剂量下未观察到与给药相关的死亡率、发病率或毒性临床症状。在细菌回复突变实验、小鼠红细胞微核实验和体外哺乳类细胞染色体畸变实验中，ZW3未表现出致诱变、致裂或基因毒性作用。因此，根据我国食品安全国家标准判断，马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3具有良好的食用安全性，为该菌株后续的功能研究以及其在产品中的应用，提供有力的安全性支持。
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