长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）属绿藻门（Chlorophyta），蕨藻科蕨藻属，主要生长在中国、日本、菲律宾、越南等国家的亚热带和热带海域[1]。长茎葡萄蕨藻是高价值的海水养殖藻类新品种，是一种天然可食用的绿色海藻。据文献报道，长茎葡萄蕨藻富含海藻多糖、不饱和脂肪酸、矿物质和维生素等成分[2]，并且有增强免疫、降血压、降胆固醇、抗氧化、抗炎、抑菌等多种潜在活性作用[3]，具有较好的营养和药用开发价值。
胰脂肪酶是催化脂肪水解为甘油、脂肪酸等的关键酶，通过抑制其活性可延缓饮食中脂肪的水解，降低脂肪酸等的吸收，从而达到治疗或预防肥胖的目的[4]。α-葡萄糖苷酶是碳水化合物在人体消化吸收的一种关键酶，其通过断裂α-1，4糖苷键剪切下葡萄糖来参与糖代谢，当其活性受到抑制时可延迟与减少人体对葡萄糖吸收，达到降低餐后血糖的效果[5]。目前常用的胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂，如奥司利他、阿卡波糖等，长期使用往往引起胃胀气、腹泻等副作用[6-7]。为了更好地预防和控制血脂和血糖异常的发生，寻找毒副作用低且效果良好的天然胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶等关键代谢酶的抑制剂已成为研究热点。长茎葡萄蕨藻富含多种小分子活性成分，如蕨藻红素、黄酮、萜类、多酚等[8-10]，这些成分使长茎葡萄蕨藻具备发挥多种生物活性的基础。
目前关于长茎葡萄蕨藻对胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究鲜有报道。本研究以长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物为对象，测定其中的黄酮、多酚及萜类含量，以对胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶的抑制能力为评价指标，通过相关性分析探究长茎葡萄蕨藻中可能存在活性的组分，并探讨抑制能力最强萃取物的作用机制，以期为长茎葡萄蕨藻在维持血糖稳定方面的应用及相关功能性食品的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜长茎葡萄蕨藻样品：由海南文昌养殖场提供；α-葡萄糖苷酶（1 000 U/mL）、没食子酸：北京索莱宝科技有限公司；胰脂肪酶（30 U/mg）、脱氧胆酸盐：上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖（≥98%）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、对硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）、二甲基亚砜、无水碳酸钠、阿拉伯树胶、异丙醇、4-硝基苯棕榈酸酯（p-nitrophenyl palmitate，PNPP）、香草醛、齐墩果酸、福林酚（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；奥利司他（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷（分析纯）：广州赛国生物科技有限公司；磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）：武汉赛维尔生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器
VGT-1730QTD7超声波清洗机：广东固特超声股份有限公司；5430R离心机：德国Eppendorf公司；ME140E电子分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；181003E酶标仪：美国BioTek公司；F-4700荧光分光光度计：日本HITACHI公司；HH-2恒温水浴锅：江苏科析仪器有限公司；DHG-9140A台式恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3CepH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SIM-F140AY65-PCe制冰机：普和希健康医疗器械有限公司；UV/V1系列紫外可见分光光度计：上海翱艺有限公司。
1.3 方法
1.3.1 长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物的制备
新鲜长茎葡萄蕨藻洗净、晒干，加入液氮研磨成粉末。以10倍体积的95%乙醇为溶剂，15℃超声浸提40 min，超声波功率为100 W，反复浸提3次。滤液合并后45℃减压旋蒸至浸膏状，加入少量去离子水重悬，依次用3倍量的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇充分萃取，浓缩并干燥各萃取液得到长茎葡萄蕨藻醇提物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后剩余的水萃取物。以上样品储存于-20℃备用。
1.3.2 多酚含量测定
以没食子酸为标准品，福林酚法测定样品中多酚含量[11]。
1.3.3 萜类含量测定
以齐墩果酸为标准品，香草醛-冰醋酸-浓硫酸法测定萜类含量[12]。
1.3.4 黄酮含量测定
以芦丁为标准品，亚硝酸钠-硝酸铝法测定黄酮含量[13]。
1.3.5 胰脂肪酶活性抑制活性试验
参考文献[14]的方法，对胰脂肪酶的抑制活性进行测定。取长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物，以二甲基亚砜复溶为100mg/mL母液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液Tris-HCl（50 mmol/L，pH8.0，0.1%阿拉伯树胶粉，0.2%脱氧胆酸钠）稀释至不同浓度作为测试样液。采用比色法测定胰脂肪酶抑制活性，依次加Tris-HCl（pH8.0）75 μL、样品溶液30 μL、36 U/mL胰脂肪酶75 μL于1.5 mL离心管中，于台式恒温鼓风干燥箱中37℃气浴反应 10 min，再加入 0.2 mg/L PNPP 150 μL，气浴37℃反应15 min。待反应结束后4 500 r/min离心5 min，取上清200 μL于405 nm波长下测定吸光度（OD），以奥利司他做阳性对照，平行测定3次。按照下列公式计算抑制率。
抑制率/%=[1-（OD3-OD4）/（OD1-OD2）]×100
式中：OD1为空白对照组吸光度；OD2为空白对照组背景吸光度；OD3为样液组吸光度；OD4为样液组背景吸光度。
1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性测试
参考文献[15]的方法进行，对α-葡萄糖苷酶的抑制活性进行测定。取长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物，以二甲基亚砜（99.5%）复溶为100 mg/mL母液，用PBS（0.5 mol/L、pH6.8）稀释至不同浓度作为测试样液。采用微孔板法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性，在96孔板上依次滴加磷酸缓冲液（pH6.8）40 μL、20 μL 样品溶液、1.2 U/mL α-葡萄糖苷酶 20 μL，37 ℃反应 10 min，加入 0.375 mmol/L PNPG 20 μL，振荡摇匀，37 ℃反应15 min。加入 80 μL 0.2 mol/L 的 Na2CO3溶液，于 405 nm波长下测定吸光度（OD），以阿卡波糖做阳性对照，平行测定3次，抑制率的计算公式同1.3.5中的公式。
1.3.7 抑制动力学试验
对胰脂肪酶的抑制动力学试验反应体系同1.3.5。参考文献[16]的方法进行。测定不同质量浓度（0、0.625 mg/mL） 的样品在不同 PNPP 浓度（0.05、0.075、0.1、0.15、0.2 mg/mL）反应体系中的反应速率。对 α-葡萄糖苷酶的抑制动力学试验反应体系同1.3.6，测定不同质量浓度（0、0.08 mg/mL）的样品在不同PNPG浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）反应体系中的反应速率。分别以反应初速率的倒数（1/V0）为Y轴，浓度的倒数（1/[S]）为X轴绘制Lineweave-Burk双倒数图，经图形特征判断其是竞争性抑制、非竞争性抑制或反竞争性抑制类型。抑制动力学按下列公式计算Lineweaver-Burk曲线方程。
式中：V为酶促反应初速度，mmol/（L·min）；Km为米氏常数，mmol/L；Vmax为最大酶促反应速率，mmol/（L·min）；[S]为底物浓度，mmol/L。
1.3.8 对酶相互作用的荧光分析
对胰脂肪酶相互作用的荧光分析参考文献[17]的方法进行，取 0.2 mL 不同浓度样品（0、0.312、0.625、1.25、2.5、3.5、5 mg/mL）和 0.5 mL 浓度为 36 U/mL 的胰脂肪酶溶液，用Tris-HCl（pH8.0）缓冲液补足至1 mL，混合均匀，分别在273、298、310 K3个温度下静置15min，于荧光分光光度计中检测，设置激发波长为290 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm，扫描得到310 nm～450 nm波长范围内的荧光光谱。
对α-葡萄糖苷酶相互作用的荧光分析参考文献[18]的方法进行，取0.5 mL不同浓度样品（0、0.007 5、0.03、0.06、0.3 mg/mL）和 0.5 mL 浓度 1.2 U/mL 的 α-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，在273、298、310 K 3个温度下静置15 min后放置于荧光池中，设置激发波长为280 nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5 nm，扫描得到300 nm～450 nm波长范围内的荧光光谱。
荧光猝灭过程采用下列Stern-Volmer方程[18]进行判断。
式中：F0为初始体系荧光强度；F为加入猝灭剂后的体系荧光强度；Kq为荧光猝灭速率，L/（mol·s）；τ0为无猝灭剂时物质的荧光平均寿命，约为10-8s；Ksv为荧光猝灭常数，mL/mg；[Q]为猝灭剂浓度，mg/mL。
1.4 统计学处理方法
通过SPSS 19.0软件进行数据处理，组间差异按方差分析进行检验，最小显著性差异法作两两比较，p＜0.05表示差异显著。Graphpad prism 8作图，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物中多酚、萜类、黄酮含量分析
长茎葡萄蕨藻经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水处理得到4种不同极性萃取物，由于溶剂的极性不同，不同萃取物的成分存在较大差异，长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物中多酚、萜类、黄酮含量见表1。
表1 长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物中多酚、萜类、黄酮含量
Table 1 Content of polyphenols，terpenoids and flavonoids in Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents mg/g
注：同列不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
样品 多酚含量 萜类含量 黄酮含量石油醚萃取物 13.41±0.26b 182.41±0.86b 3.27±0.12a乙酸乙酯萃取物 23.79±0.30a 214.29±1.09a 1.64±0.01b正丁醇萃取物 9.59±0.07c 6.50±0.14d 0.35±0.01d水萃取物 0.62±0.02d 13.13±0.33c 0.70±0.07c
由表1可知，4个样品中，乙酸乙酯萃取物的多酚含量（23.79 mg/g）和萜类含量（214.29 mg/g）最高，黄酮含量较高。石油醚萃取物中黄酮含量最高（3.27 mg/g），多酚含量（13.41 mg/g）和萜类（182.41 mg/g）含量仅次于乙酸乙酯萃取物。正丁醇和水层萃取物中多酚、萜类和黄酮含量明显较低。乙酸乙酯从长茎葡萄蕨藻醇提取物中富集的多酚类和萜类成分含量最高，石油醚对其中的黄酮类物质富集效果最佳。通过分步萃取，长茎葡萄蕨藻醇提物中多酚、萜类和黄酮成分得到初步的分离纯化。
2.2 长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物对胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用
长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物对胰脂肪酶的抑制作用见图1。
图1 长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物对胰脂肪酶的抑制作用
Fig.1 Inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents on pancreatic lipase
（a）石油醚萃取物对胰脂肪酶的抑制作用；（b）乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶的抑制作用；（c）正丁醇萃取物对胰脂肪酶的抑制作用；（d）水萃取物对胰脂肪酶的抑制作用；（e）奥利司他对胰脂肪酶的抑制作用。
由图1可知，长茎葡萄蕨藻醇提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水萃取物对胰脂肪酶均有一定的抑制作用。石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物随质量浓度增加抑制效果逐渐增强，而当质量浓度高于一定值后逐渐达到平台期，继续增大质量浓度抑制率增加不明显。水萃取物随质量浓度增加，对胰脂肪酶的抑制作用表现出先升后降的趋势。安欢等[19]对苦瓜提取物的研究显示当苦瓜提取物质量浓度大于30 mg/mL时，对胰脂肪酶的抑制能力也表现出明显的下降。推测造成这种结果的原因可能是由于水萃取物中同时还存在对两种消化酶活力具有促进作用的物质，多种成分共同影响了与酶之间的相互作用结果。
长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图2。
图2 长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
Fig.2 Inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents on α-glucosidase
（A）石油醚萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；（B）乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；（C）正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；（D）水萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；（E）阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。
由图2可知，随着质量浓度的增大，长茎葡萄蕨藻醇提物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制程度均整体提高，且当各萃取物质量浓度超过一定值后，随着浓度的增大，抑制率的提高逐渐趋于平缓。
使用最小二乘法拟合曲线计算各萃取物对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用的IC50值，具体见表2。
表2 不同样品对胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶的抑制作用比较
Table 2 Inhibitory effects of different samples on pancreatic lipase and α-glucosidase
注：同列不同字母表示差异显著（p＜0.05）；-表示未检出。
样品IC50/（mg/mL）抑制率/%胰脂肪酶 α-葡萄糖苷酶 胰脂肪酶 α-葡萄糖苷酶石油醚萃取物 5.320±0.981a 1.255±0.223b 49.449±0.011b 41.203±0.066c乙酸乙酯萃取物 1.662±0.122b 0.017±0.002c 71.823±0.012a 80.709±0.017a正丁醇萃取物 - 1.644±0.238a 14.844±0.035d 56.018±0.021b水萃取物 - - 43.082±0.073c 9.700±0.028d奥利司他 0.014±0.001c - - -阿卡波糖 - 0.001±0.000d - -
由表2可知，乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶抑制作用最强，其IC50为1.662 mg/mL，高于奥利司他（IC50=0.014 mg/mL），对α-葡萄糖苷酶也表现出最强的抑制作用，其IC50为0.017 mg/mL，高于阳性对照品阿卡波糖（IC50=0.001 mg/mL）。不同萃取物对胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶抑制率具有显著性差异，当样品质量浓度为5 mg/mL时，对胰脂肪酶抑制率大小依次为乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物＞正丁醇萃取物。当样品质量浓度为0.5 mg/mL时，各萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制率大小依次为乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物。
从天然食品来源中获得的消化酶抑制剂大多具有较温和的作用效果。陈永丽等[20]对桑叶多糖的胰脂肪酶抑制作用研究表明其IC50为10.32 mg/mL，活性远低于相同条件下的阳性对照奥司利他（IC50为0.47 mg/mL）。滕俊英等[21]对苦荞麦提取物的α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究结果显示其IC50为241.79 mg/L，活性低于同条件下的阳性对照阿卡波糖。据文献报道，由于奥利司他对胰脂肪酶抑制能力强，会干扰正常脂肪代谢，长期服用往往出现胰腺炎、胃肠胀气等副作用。阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的强烈抑制作用会导致未消化的碳水化合物异常发酵，引起腹痛、腹泻等胃肠道功能紊乱[6-7]。长茎葡萄蕨藻醇提物的萃取物由天然可食藻类经初步分离获得，具有相对温和有效的抑制活性，可能对胃肠道的刺激较小，在开发天然降脂降糖功能性食品方面是一种优质的候选原料。
2.3 不同溶剂萃取物中多酚、萜类、黄酮含量与胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性分析
长茎葡萄蕨藻醇提物的不同溶剂萃取物中多酚、萜类、黄酮含量与胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性见表3。
表3 不同溶剂萃取物多酚、萜类、黄酮含量与胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性
Table 3 Pearson's correlation of content of polyphenols，flavonoids，and terpenoids of Caulerpa lentillifera extracts by different solvents with inhibitory activities against pancreatic lipase and α-glucosidase
注：*表示差异显著（p＜0.05）。
项目 胰脂肪酶抑制率/% α-葡萄糖苷酶抑制率/%多酚 0.608* 0.917*萜类 0.815* 0.585*黄酮 0.511 0.123
如表3所示，萃取物中多酚、萜类含量与胰脂肪酶酶抑制率差异显著（p＜0.05），萃取物中多酚含量与α-葡萄糖苷酶抑制率差异显著（p＜0.05），因此，推测长茎葡萄蕨藻中对胰脂肪酶活性起抑制作用的主要活性成分可能为多酚与萜类物质；对α-葡萄糖苷酶活性起抑制作用的主要活性成分可能为多酚类物质。研究发现，天然来源的小分子化合物具有多重降脂降糖药理作用，其中对糖脂代谢中某些关键酶活性的调节是重要的途径之一[22-23]。三萜酸类成分熊果酸和齐墩果酸是许多蔬菜水果和中药中的活性成分[24]，对血脂和血糖的调节作用明显，已经证明它们具有很高的胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。周一鸣等[25]的研究表明苦荞中的黄酮类物质芦丁和槲皮素对α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶活性具有抑制作用，存在治疗糖尿病的潜力。柳余莉等[26]的研究发现杨梅中的多酚类物质能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性。研究表明由天然产物分离得到的多酚、黄酮、萜类物质与降脂降糖活性明显相关[27-28]，这些小分子物质是挖掘生物活性的重要对象。
2.4 长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制动力学试验
根据抑制剂结合酶的特点，通过Lineweaver-Burk双倒数图及其相关参数，可判断抑制剂对酶的抑制类型。酶的可逆抑制类型一般分为4种，分别为竞争性抑制（Vmax不变，Km增大）、非竞争性抑制（Vmax减小，Km不变）、反竞争性抑制（Vmax减小，Km减小）和混合型抑制（Vmax减小，Km增大或减小）。
因长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶的抑制作用最强，并且其中与酶抑制作用相关性最强的多酚和萜类物质含量最高，因此以其为对象进行酶抑制动力学研究。长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶抑制作用见图3，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图4，其具体动力学参数见表4。
表4 胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数
Table 4 Inhibitory kinetic parameters of pancreatic lipase and α-glucosidase
消化酶样品浓度/（mg/mL）拟合方程R2Km/（mmol/L）Vmax/[mmol/（L·min）]胰脂肪酶 0 y=0.015 6x+0.017 18 0.998 7 0.908 58.207 0.625 y=0.020 4x+0.022 84 0.998 5 0.894 47.687 α-葡萄糖苷酶 0 y=0.103 4x+0.056 89 0.999 7 1.818 17.578 0.08 y=0.110 6x+0.388 88 0.965 1 0.284 2.572
图3 长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线
Fig.3 Lineweaver-Burk curves of inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate on pancreatic lipase
图4 长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线
Fig.4 Lineweaver-Burk curves of inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate on α-glucosidase
由图3可知，两条斜率不同的直线相交于X轴。在反应体系中添加长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物后最大反应速率Vmax由58.207 mmol/（L·min）减小至47.687 mmol/（L·min），而米氏常数Km基本保持不变（表4）。长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶抑制类型符合非竞争性抑制特征，表明其不与底物竞争酶活性中心，而是与酶的其他基团进行结合，既可以与胰脂肪酶形成复合物，又可以与胰脂肪酶-底物形成复合物，进而影响底物的分解。此抑制类型的抑制程度取决于乙酸乙酯萃取物的质量浓度，底物的浓度不会影响对胰脂肪酶的抑制程度。
由图4可知，采用Lineweaver－Burk双倒数作图，得到两条斜率基本相同的直线。在反应体系中添加长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物后最大反应速率Vmax由17.578mmol/（L·min）减小至2.572mmol/（L·min），米氏常数Km由1.818 mmol/L减小至0.284 mmol/L（表4）。长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型符合反竞争性抑制特征，说明其不与酶单独结合，而是在酶与底物结合后，与胰脂肪酶-底物形成复合物，进而影响底物的分解。此抑制类型的抑制程度同时取决于乙酸乙酯萃取物的质量浓度与底物的浓度。当前报道的天然产物来源的具有酶抑制活性的物质种类繁多，涉及醌类、萜类、皂苷类、黄酮类、酚类、脂肪酸类等多种结构的化合物[29]。抑制剂结构的不同可能是造成不同抑制类型的原因。
2.5 长茎葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物与胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶相互作用的荧光分析
长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶相互作用的荧光分析见图5，对α-葡萄糖苷酶的相互作用的荧光分析见图6，其具体动力学参数见表5。
表5 胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer方程及参数
Table 5 Stern-Volmer equations and parameters of pancreatic lipase and α-glucosidase
消化酶 温度/K pH值 Stern-Volmer方程 R2 Ksv/（mL/mg）胰脂肪酶 273 8.0 lnF0/F=1.179[Q]-0.198 5 0.987 1 1.179 298 8.0 lnF0/F=1.161[Q]-0.052 5 0.983 4 1.161 310 8.0 lnF0/F=1.105[Q]-0.087 1 0.993 0 1.105 α-葡萄糖苷酶273 6.8 lnF0/F=3.693[Q]+0.015 6 0.999 9 3.693 298 6.8 lnF0/F=3.126[Q]+0.084 5 0.976 2 3.126 310 6.8 lnF0/F=2.377[Q]+0.168 3 0.967 6 2.377
图5 不同温度下长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶荧光光谱
Fig.5 Fluorescence spectra of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate against pancreatic lipase at different temperatures
（A）273K；（B）298K；（C）310K。0→5：抑制剂浓度范围（0～5mg/mL）。
图6 不同温度下长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶荧光光谱
Fig.6 Fluorescence spectra of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate against α-glucosidase at different temperatures
（a）273K；（b）298 K；（c）310K；0→0.3.抑制剂浓度范围（0～0.3mg/mL）。
蛋白质中的芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸等，在特定激发波长下可以发出不同的荧光。若受到其他条件的干扰，相应的荧光发射峰会出现蓝移和红移的现象，据此可以判断物质与酶之间是否存在相互作用。
由图5和图6可知，在273、298 K和310 K 3种温度下，当激发波长为280 nm时，胰脂肪酶最大发射峰（λmax）在343.8 nm附近，α-葡萄糖苷酶最大发射峰（λmax）在337.2 nm附近。当在反应体系中加入不同浓度的长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物时，胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶的荧光强度呈剂量依赖性降低，且最大发射峰发生移动。胰脂肪酶最大发射峰从343.8 nm移动到361.2 nm，发生轻微的红移。α-葡萄糖苷酶最大发射峰从337.2 nm移动到330.8 nm，发生轻微的蓝移。这种现象表明长茎葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物与胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶之间均存在互作，改变酶的构型使氨基酸残基逐渐暴露于水相，所在环境极性发生变化，从而使酶的催化活性降低。
荧光猝灭机制主要包括两种[30]，静态猝灭与动态猝灭。通过变温试验，建立Stern-Volmer方程判断长茎葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物与α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶之间的猝灭机制，分别在273、298 K和310 K 3种不同温度下研究了两种酶的荧光变化。由表5可知，随着温度的升高，长茎葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭常数Ksv值降低，对胰脂肪酶的Ksv由1.179 mL/mg降低至1.105 mL/mg，对α-葡萄糖苷酶的Ksv由3.693 mL/mg降低至2.377 mL/mg，说明其与胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶是通过形成复合物的方式发生静态猝灭。
3 结论
试验结果表明，长茎葡萄蕨藻醇提物的不同萃取物对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，其中长茎葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物的抑制作用最强，且抑制作用呈浓度依赖性。多酚和萜类物质在石油醚与乙酸乙酯萃取物中含量较多，黄酮类物质在石油醚萃取物中含量较多。对胰脂肪酶的抑制作用与多酚和萜类含量显著相关，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用与多酚含量显著相关。长茎葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制，对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为反竞争性抑制，对胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶的猝灭方式均为静态猝灭。胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶作为人体重要的消化酶，在生物体消化吸收脂肪与碳水化合物的过程中发挥重要功能，长茎葡萄蕨藻可以抑制这两种消化酶的活性，从而在维持血糖稳定方面起到一定作用。长茎葡萄蕨藻在开发成辅助降脂降糖的功能性食品方面具有一定的潜力。
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