荷叶为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥叶，具有多种生理功效，如预防高脂血症、高血压、肥胖等[1-2]，同时具有抗氧化、抗癌、保肝、抗炎等作用[2]。荷叶中富含多种活性成分，如多糖、黄酮类化合物和生物碱等[3]。目前，国内外学者对荷叶的研究主要集中在黄酮类化合物[4-6]、生物碱等活性物质方面[7-10]，对荷叶多糖的研究较少，而多糖作为一种广泛存在的生物活性物质，具有抗氧化、降血糖、抗糖基化、免疫调节等作用[11-14]。我国荷叶年产量超过7 000 t，然而只有1%被用于茶叶和餐饮行业，大部分被作为副产品丢弃[2]。因此，为了促进荷叶在食品工业中的应用，开发绿色高效的荷叶多糖制备方法是必要的。
目前，植物多糖的提取方法有溶剂法、酶解法、微波提取法、超声辅助提取法、超临界流体萃取法等。酸碱溶剂提取法易破坏多糖结构[15]，超声辅助提取法和超临界流体萃取法则具有设备要求高、提取成本高、消耗能源大等缺点[16]。酶辅助可以提高多糖的提取效率和生物活性[17]。目前已有酶解法提取荷叶多糖的研究，但并未对其提取工艺进行优化[18]，有关多种酶复合后酶解荷叶多糖的研究鲜有报道。因此，本文选择纤维素酶和木瓜蛋白酶按照质量比为1∶1 复合，在考察pH 值、温度、液料比、复合酶添加量、提取时间5 个单因素对荷叶多糖得率影响的基础上，进一步采用响应面分析法优化荷叶多糖的提取工艺，并对其抗氧化性进行研究，以期为荷叶资源的深度开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 原料及试剂
荷叶饮片：市售；纤维素酶（50 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源叶生物科技有限公司；无水磷酸氢二钠、一水合柠檬酸、丙酮、浓硫酸、苯酚、无水葡萄糖标准品、乙醚、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ME204 电子天平：上海书培实验设备有限公司；HS-800D 恒温水浴锅：太仓市华利达实验设备有限公司；5804R 高速台式离心机：德国艾本德股份公司；RE-5286A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；UV5500PC 紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；Spectra Max 多功能酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司；SCIENTZ-12N/B 冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ST300 酸度计：奥豪斯仪器（上海）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 提取方法
荷叶饮片用粉碎机粉碎，过60 目筛，索氏提取器乙醚脱脂，挥干有机溶剂后65 ℃烘干。按照液料比30∶1（mL/g）配制pH 值为6.8 的碳酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，加入质量分数为0.6%的复合酶（纤维素酶∶木瓜蛋白酶质量比=1∶1），50 ℃水浴活化10 min，加入5.0 g荷叶粉，50 ℃水浴100 min。沸水浴5 min 使酶失活，抽滤后旋转蒸发，加入4 倍体积的无水乙醇，4 ℃静置24 h。3 000 r/min，离心5 min 得沉淀，无水乙醇和丙酮洗涤后冷冻干燥即得荷叶多糖。
1.3.2 荷叶多糖含量的测定
1.3.2.1 标准曲线的绘制
精密称取100 mg 无水葡萄糖标准品，于100 mL容量瓶中配制成质量浓度为1 mg/mL 的对照品溶液。分别精密移取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于具塞试管中，蒸馏水补至2.0 mL，再依次精密加入1 mL质量分数为5%的苯酚溶液，摇匀后迅速加入5 mL 浓硫酸，再次摇匀。50 ℃水浴30 min，流水冷却至室温[19]。采用紫外可见分光光度计在490 nm 处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度和吸光度关系作标准曲线，得回归方程为Y=6.693X+0.018 6，相关系数R2=0.999 5。
1.3.2.2 多糖得率的测定
准确吸取稀释后的溶液2.0 mL，按1.3.2.1 的方法，测定荷叶多糖的吸光度，重复测定3 次，取平均值，代入标准曲线回归方程计算荷叶多糖得率。荷叶多糖得率计算公式如下。
式中：Y 为荷叶多糖得率，%；C 为多糖质量浓度，mg/mL；V 为提取液体积，mL；N 为测定样品稀释倍数；M 为干粉质量，g。
1.3.3 单因素试验
精密称取经处理的荷叶粉5.0 g，置于250 mL 的具塞锥形瓶中，考察pH 值、温度、液料比、复合酶添加量、提取时间对荷叶多糖得率的影响，各因素分别设置5 个水平，进行单因素试验设计见表1。
表1 单因素试验设计
Table 1 Factors and levels of single factor tests
pH 值 温度/℃ 液料比/（mL/g） 复合酶添加量/% 提取时间/min 5.6 40 10∶1 0.2 60 6.2 45 20∶1 0.4 80 6.8 50 30∶1 0.6 100 7.4 55 40∶1 0.8 120 8.0 60 50∶1 1.0 140
1.3.4 响应面法试验设计
根据单因素试验的结果，选取pH 值（A）、温度（B）、液料比（C）、复合酶添加量（D）、提取时间（E）为自变量，以多糖得率为响应值Y，采用软件Design-Expert V12.0 进行五因素三水平的响应面试验，响应面试验设计因素水平见表2。
表2 Box-Behnken 试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test
水平A pH 值B 温度/℃ C 液料比/（mL/g）-1 6.2 45 20∶1 0 6.8 50 30∶1 1 7.4 55 40∶1 D 复合酶添加量/%0.4 0.6 0.8 E 提取时间/min 80 100 120
1.3.5 荷叶多糖抗氧化试验
将采用最佳提取工艺提取的荷叶多糖配制成浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL 的溶液，通过分光光度法测定其对DPPH 自由基和羟自由基的清除能力，考察荷叶多糖的抗氧化作用。
1.3.5.1 荷叶多糖对DPPH 自由基清除率的测定
参考刘晓鹏等[20]的方法，并稍作修改。将100 μL测试样品与100 μL 新配制的DPPH 溶液（0.1 mmol/L）混合，轻微振荡后在室温下避光孵育30 min。混合物在517 nm 处测定吸光度。DPPH 自由基清除率（X1，%）计算公式如下。
式中：Ab 为对照组的吸光度；As 为样品组吸光度；Ac 为未添加DPPH 溶液的空白对照组吸光度。
1.3.5.2 荷叶多糖对羟自由基清除率的测定
参照Chen 等[21]的方法，并稍作修改。将1 mL 测试样品置于5 mL 离心管中，分别快速向离心管中加入1 mL FeSO4溶液（0.009mol/L）和水杨酸乙醇溶液（0.009mol/L），混匀后快速加入1 mL H2O2 溶液（0.009 mol/L），37 ℃水浴30 min，冷却至室温后测定吸光度。羟自由基清除率（X2，%）计算公式如下。
式中：Ab 为对照组的吸光度；As 为样品组吸光度；Ac 为多糖溶液本身吸光度。
1.4 数据分析
采用Graphpad Prism 8.0 进行绘图，Design-Expert V12.0 进行响应面设计试验和方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 pH 值对多糖得率的影响
pH 值对荷叶多糖得率的影响见图1。
图1 pH 值对荷叶多糖得率的影响
Fig.1 Effect of pH on the yield of lotus leaf polysaccharide
由图1 可知，随着pH 值的升高，荷叶多糖得率整体呈先升高后降低的趋势，当pH 值为6.8 时，荷叶多糖得率达到最大值，为2.37%。因此选择pH 值为6.2、6.8、7.4 进行响应面优化试验。
2.1.2 温度对荷叶多糖得率的影响
温度对荷叶多糖得率的影响见图2。
图2 温度对荷叶多糖得率的影响
Fig.2 Effect of temperature on the yield of lotus leaf polysaccharide
由图2 可知，多糖得率在40～50 ℃之间随温度的升高而增加，当温度为50 ℃时，荷叶多糖的得率达到最大值，为1.95%。这可能是由于复合酶在50 ℃时活性最强，分解细胞壁的效果最佳。当温度进一步升高时，酶蛋白开始受热变性，使得酶活性逐渐降低，导致多糖得率下降[22-23]。因此选择温度为45、50、55 ℃进行响应面优化试验。
2.1.3 液料比对荷叶多糖得率的影响
液料比对荷叶多糖得率的影响见图3。
图3 液料比对荷叶多糖得率的影响
Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of lotus leaf polysaccharide
由图3 可知，多糖得率呈先增后减的趋势，当pH 值为6.2 时，得率达到最大值，为1.99%。这可能是因溶剂增加扩大了反应体系中荷叶粉与复合酶的接触面积，随着溶剂体积的增加，提取液黏度降低，多糖分子更多地被溶出。当溶剂用量超过一定范围时，使得酶的浓度明显降低，从而影响到酶的催化效率，这可能是后期随着溶剂用量不断增加，荷叶多糖得率反而降低的原因[24-25]。此选择液料比为20∶1、30∶1、40∶1（mL/g）进行响应面优化试验。
2.1.4 复合酶添加量对荷叶多糖的影响
复合酶添加量对荷叶多糖得率的影响见图4。
图4 复合酶添加量对荷叶多糖得率的影响
Fig.4 Effect of complex enzyme addition on the yield of lotus leaf polysaccharide
由图4 可知，随着复合酶添加量的增加，荷叶多糖得率不断增加，当复合酶添加量为0.6%时，荷叶多糖得率达到最大值，随后得率不断下降。因此选择复合酶添加量为0.4%、0.6%、0.8%进行响应面优化试验。
2.1.5 提取时间对荷叶多糖得率的影响
提取时间对荷叶多糖得率的影响见图5。
图5 提取时间对荷叶多糖得率的影响
Fig.5 Effect of extraction time on the yield of lotus leaf polysaccharide
由图5 可知，随着提取时间的增加，荷叶多糖得率呈现先升高后下降的趋势，并在100 min 时达到最大值。因此选择提取时间为80、100、120 min 进行响应面优化试验。
2.2 响应面优化结果
2.2.1 响应面模型的建立
利用软件Design-Expert V12.0 对5 个自变量进行二次多元线性回归分析，得到结果见表3。
表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface testresults
试验号A pH 值 B 温度/℃C 液料比/（mL/g）D 复合酶添加量/%E 提取时间/min Y 得率/%1 6.2 45 30∶1 0.6 100 1.531 6 2 7.4 45 30∶1 0.6 100 1.099 1 3 6.2 55 30∶1 0.6 100 1.036 3 4 7.4 55 30∶1 0.6 100 2.015 7 5 6.8 50 20∶1 0.4 100 2.318 2 6 6.8 50 40∶1 0.4 100 2.060 5 7 6.8 50 20∶1 0.8 100 2.134 5 8 6.8 50 40∶1 0.8 100 3.042 1 9 6.8 45 30∶1 0.6 80 1.271 6 10 6.8 55 30∶1 0.6 80 1.417 3 11 6.8 45 30∶1 0.6 120 1.439 7 12 6.8 55 30∶1 0.6 120 1.444 2 13 6.2 50 20∶1 0.6 100 1.695 2 14 7.4 50 20∶1 0.6 100 2.571 5 15 6.2 50 40∶1 0.6 100 2.703 7 16 7.4 50 40∶1 0.6 100 2.264 5 17 6.8 50 30∶1 0.4 80 2.074 0 18 6.8 50 30∶1 0.8 80 1.885 7 19 6.8 50 30∶1 0.4 120 1.605 6 20 6.8 50 30∶1 0.8 120 2.652 2 21 6.8 45 20∶1 0.6 100 1.984 3 22 6.8 55 20∶1 0.6 100 1.199 9 23 6.8 45 40∶1 0.6 100 1.462 1 24 6.8 55 40∶1 0.6 100 2.448 2 25 6.2 50 30∶1 0.4 100 1.964 1 26 7.4 50 30∶1 0.4 100 1.818 5 27 6.2 50 30∶1 0.8 100 1.964 1 28 7.4 50 30∶1 0.8 100 2.602 9 29 6.8 50 20∶1 0.6 80 2.174 8 30 6.8 50 40∶1 0.6 80 2.286 9 31 6.8 50 20∶1 0.6 120 1.988 8 32 6.8 50 40∶1 0.6 120 2.582 7 33 6.2 50 30∶1 0.6 80 2.378 8 34 7.4 50 30∶1 0.6 80 1.379 2 35 6.2 50 30∶1 0.6 120 1.188 7 36 7.4 50 30∶1 0.6 120 2.721 7 37 6.8 45 30∶1 0.4 100 1.601 1 38 6.8 55 30∶1 0.4 100 1.087 9 39 6.8 45 30∶1 0.8 100 1.381 4 40 6.8 55 30∶1 0.8 100 2.165 1 41 6.8 50 30∶1 0.6 100 1.865 5 42 6.8 50 30∶1 0.6 100 1.865 5 43 6.8 50 30∶1 0.6 100 1.845 4 44 6.8 50 30∶1 0.6 100 1.874 5 45 6.8 50 30∶1 0.6 100 1.170 8 46 6.8 50 30∶1 0.6 100 1.421 8
建立二次回归方程，对响应因素和多糖得率进行二次多元方程拟合，得到回归方程为Y=1.67+0.125 6A+0.065 2B +0.174 0C +0.206 1D +0.047 2E +0.353 0AB-0.328 9AC+0.196 1AD+0.633 1AE+0.442 6BC+0.324 2BD-0.0353BE+0.291 3CD+0.120 5CE+0.308 7DE+0.144 2A2-0.384 9B2+0.476 1C2+0.262 8D2+0.107 3E2。
2.2.2 响应面模型的方差分析
回归方差分析见表4。
表4 回归方差分析
Table 4 Results of analysis of variance
注：* 表示影响显著（P<0.05）；** 表示影响极显著（P<0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 11.34 20 0.566 9 29.28 <0.000 1 **A pH 值 0.252 6 1 0.252 6 13.05 0.001 3 **B 温度 0.068 1 1 0.068 1 3.52 0.072 5 C 液料比 0.484 2 1 0.484 2 25.01 <0.000 1 **D 复合酶添加量0.679 9 1 0.679 9 35.12 <0.000 1 **E 提取时间 0.035 7 1 0.035 7 1.84 0.186 9 AB 0.498 4 1 0.498 4 25.74 <0.000 1 **AC 0.432 7 1 0.432 7 22.35 <0.000 1 **AD 0.153 8 1 0.153 8 7.95 0.009 3 **AE 1.6 1 1.6 82.82 <0.000 1 **BC 0.783 7 1 0.783 7 40.48 <0.000 1 **BD 0.420 5 1 0.420 5 21.72 <0.000 1 **BE 0.005 1 0.005 0.257 4 0.616 3 CD 0.339 5 1 0.339 5 17.54 0.000 3 **CE 0.058 1 0.058 3 0.095 7 DE 0.381 2 1 0.381 2 19.69 0.000 2 **A2 0.181 6 1 0.181 6 9.38 0.005 2 **B2 1.29 1 1.29 66.79 <0.000 1 **C2 1.98 1 1.98 102.19 <0.000 1 **D2 0.602 6 1 0.602 6 31.13 <0.000 1 **E2 0.100 4 1 0.100 4 5.19 0.031 6 *残差 0.484 25 0.019 4失拟项 0.024 2 20 0.001 2 0.013 2 1.0绝对误差 0.459 8 5 0.092总和 11.82 45
2.2.3 响应面条件优化及验证
回归方程的三维响应面和二维等高线如图6 所示。
图6 不同因素对荷叶多糖得率影响的响应曲面
Fig.6 Response surface plots of the effects of interactions between factors on the yield of lotus leaf polysaccharide
等高线图的形状越呈椭圆说明两个影响因素之间的交互作用越显著，反之则为不显著。由响应面优化得到荷叶多糖的最佳提取工艺条件为pH7.027、温度51.665 ℃、液料比39.163∶1（mL/g）、复合酶添加量0.739%、提取时间115.787 min。考虑到试验操作的可行性，对预测工艺条件修正为pH7.0、温度52 ℃、液料比39∶1（mL/g）、复合酶添加量0.7%、提取时间116 min。在此条件下，重复提取荷叶多糖3 次，结果荷叶多糖的得率均值为3.26%，与预测值接近，说明模型有效合理，可以用于荷叶多糖提取工艺的优化。
2.3 抗氧化活性
2.3.1 DPPH·清除能力
荷叶多糖的DPPH 自由基清除率如图7 所示。
图7 荷叶多糖的DPPH·清除率
Fig.7 DPPH free radical scavenging ability of lotus leaf polysaccharide
由图7 可知，荷叶多糖在0.1～4.0 mg/mL 的范围内对DPPH 自由基的清除率随着浓度增大而升高，IC50值为2.355 mg/mL。DPPH 自由基清除能力测定是一种快速、简便的评价天然产物抗氧化活性的方法，该结果表明荷叶多糖具有较好的清除DPPH 自由基作用。
2.3.2 羟自由基清除能力
荷叶多糖的羟自由基清除率如图8 所示。
图8 荷叶多糖的羟自由基清除率
Fig.8 Hydroxy radical scavenging ability of lotus leaf polysaccharide
由图8 可知，羟自由基随着荷叶多糖浓度的增加而增加，在2.0 mg/mL 时清除率接近100%，IC50 值0.331 2 mg/mL。活性氧中，羟自由基活性最强，可引起组织损伤或细胞死亡。因此，清除羟自由基对细胞或机体的抗氧化防御很重要，该结果表明荷叶多糖具有较好的清除羟自由基作用。
3 结论
本研究通过响应面法优化酶辅助提取荷叶多糖的最佳工艺条件为pH7.0、温度52 ℃、液料比39∶1（mL/g）、复合酶添加量0.7%、提取时间116 min，荷叶多糖得率可达3.26%，说明采用Box-Behnken 响应面法优化复合酶提取荷叶多糖的方法可行，具有较强的实际意义，可用于提取荷叶多糖。
荷叶多糖抗氧化试验结果显示，荷叶多糖对自由基的清除能力与浓度呈现一定的剂量依赖效应，多糖浓度越大，抗氧化能力越强，清除DPPH 自由基和羟自由基的IC50 值分别为2.355、0.331 2 mg/mL，表明荷叶多糖对羟自由基的清除能力强于对DPPH 自由基的清除能力，说明荷叶多糖具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂加以开发利用。因此，本研究结果为荷叶多糖的开发利用提供了实践基础和理论支撑。
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