麦麸（wheat bran，WB）是小麦加工的主要副产物，富含膳食纤维、蛋白质、低聚糖、植酸以及一系列生物活性物质如黄酮类化合物、多酚等，因此WB 具有很高的营养价值和研究价值[1]。大量研究表明，由WB 中提取的多酚、黄酮和可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）等具有良好的抗氧化特性，而经过蛋白酶酶解形成的多肽及其衍生物也表现出较强的抗氧化能力[2]。尽管WB 具有良好的营养价值和应用前景，但大多数WB 被用作酿酒或者动物饲料，其价值远远未得到充分利用[3]。
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis，BV）是一种益生菌，通过发酵会产生非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs），NRPSs 是一种多功能酶复合物，也是重要的非核糖体合成的肽，能够催化刺激特定蛋白转换为相应的氨基酰基硫酯和被激活肽键的氨基酸片段[4]。有报道称，BV 属的成员显示出广谱的葡聚糖苷水解酶，可以对纤维素和木质纤维素进行水解[5]。
研究表明，蛋白酶酶解WB 得到的WB 蛋白水解物及其超滤组分表现出很强的抗氧化活性、肾素抑制作用和血管紧张素转换酶抑制作用，还具有一定的降血压作用[2]；蛋白酶处理的紫麦麸水解物及其多肽产物具有很强的抗氧化活性和超氧阴离子自由基清除能力，并具有良好的体外消化稳定性[6]；WB 的水提取物可有效抑制抗原刺激的RBL-2H3 细胞中肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2 和诱导型一氧化氮合酶等过敏性和炎症介质的脱颗粒和表达，从而抑制免疫球蛋白E/抗原诱导和化合物48/80 诱导的体内过敏反应[7]。WB 膳食纤维可以在肠道远端充当结合酚类物质的载体，经微生物发酵刺激有益细菌的生长，改善和维持肠道健康[3]。
本文采用生物酶联反应释放麦麸中的多肽，并开展了抗氧化试验和体外发酵试验，对麦麸衍生多肽功能进一步验证，旨在为植物源多肽提供一种高效、快速和高得率的制备方法，并为提高麦麸的综合利用提供了一种新途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
麦麸：山东省德州市发达面粉集团有限公司；贝莱斯芽孢杆菌：天津科技大学粮油课题组实验室保藏；氢氧化钠、无水碳酸钠、酒石酸钾钠、无水硫酸铜、过硫酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸钠、铁氰化钾、氯化铁、乙醚、丙酮、浓硫酸、浓盐酸、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）：国药集团化学试剂有限公司；福林酚（Folin-Ciocalteu，FC）、牛血清白蛋白、没食子酸、水溶性维生素E（Trolox）、抗坏血酸、2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵盐）[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS]、2，4，6-三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：索莱宝生物科技有限公司。所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
全自动立式蒸汽灭菌器（CT62A）：驰通仪器（上海）有限公司；超净工作台（SW-CJ-1FD）：苏州净化设备有限公司；恒温培养振荡箱（ZHWY-2102C）：上海智城分析仪器制造有限公司；水浴恒温振荡器（TS-110XS）：上海科辰实验设备有限公司；大容量高速冷冻离心机（GL-10MD）：湘仪实验室仪器开发有限公司；冷冻干燥机（Alpha 1-2 LD plus）：Marin Christ 公司（德国）；酶标仪（Epoch2）：美国伯腾仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂；厌氧培养箱（YQX-Ⅱ）：上海溪乾仪器设备有限公司；气相色谱仪（GC-2014C shimadzu）：日本岛津公司；循环水真空泵（SHZ-D Ⅲ）：巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酶液的准备
从-80 ℃冰箱中取出BV 菌种，解冻后进行活化和扩培得到扩培菌液。将扩培菌液按2%的比例加入卢瑞亚-贝尔塔尼（Luria-Bertani，LB）肉汤中，37 ℃培养48 h后得到发酵液。将发酵液以4 000 r/min 离心15 min，上清液过超滤膜浓缩为原体积的1/6 得到的浓缩液即为贝莱斯芽孢杆菌发酵酶（Bacillus velezensis fermentation enzyme，BVFE）[8]。
1.3.2 WBEE 的制备
粗WB 过筛至没有细粉筛出，按料液比1∶12（g/mL）加蒸馏水，浸润混匀后，调节体系pH8.0。分别按WB质量的0.8%和2%加入碱性水解蛋白酶（alkaline hydrolysis protease，AHPE）和BVFE。封口后，于水浴摇床中60 ℃、160 r/min 反应3 h 后，4 层纱布过滤。滤液经4 000 r/min 离心20 min，收集上清液即为麦麸酶解提取物（wheat bran enzymatic extract，WBEE）粗液。将提取制备的新鲜WBEE 粗液过3 kDa 滤膜除去大分子量的蛋白和酶，所得滤液经旋转蒸发器浓缩后于冻干机中冷冻干燥，制得WBEE 冻干粉。装袋密封于-20 ℃保藏，备用[6]。麦麸水提取物（wheatbranaqueousextract，WBAE）的制备方法除了不加AHPE 和BVFE 外，其他步骤同上述。由麦麸水提液最后制备的冻干粉统称WBAE。
1.3.3 WBEE 生产工艺的优化
1）料液比的确定：分别按照WB 与蒸馏水质量体积比1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）制作反应体系，以pH 值为6.8，AHPE 和BVFE 分别添加1%和2%，温度为55 ℃置于恒温水浴振荡器中以160 r/min反应4 h。
2）加酶量的确定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，pH6.8，分别加入0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的AHPE；同时，开展平行试验分别加入0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的BVFE。温度为55 ℃置于恒温水浴振荡器中以160 r/min 反应4 h。
3）pH 值的确定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，将体系pH 值分别调节至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，待体系稳定后，AHPE 和BVFE 分别添加0.8%和2%，55 ℃置于恒温水浴振荡器中，以160 r/min反应4 h。
4）反应时间的确定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，调pH 值至8.0，待体系稳定后，分别加入AHPE 和BVFE 为0.8%和2%，温度为55 ℃置于恒温水浴振荡器中以160 r/min 分别反应0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h。
5）反应温度的确定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，调pH 值至8.0，待体系稳定后，分别加入AHPE 和BVFE 为0.8%和2%，反应温度分别调为35、40、45、50、55、60、65、70 ℃以160 r/min 反应3 h。
1.3.4 WBEE 成分的测定
1.3.4.1 WBEE 提取率的测定
对经冷冻干燥制得的WBEE 和WBAE 的提取率进行测定和计算。准确量取适量新鲜制备的麦麸提取物（wheat bran extract，WBE）原液置于玻璃容器中，并记录溶液体积V 和玻璃容器质量m1。将样品冻干后，立即称量玻璃器皿和样品质量记为m2。采用理想模型法，默认1 g WB 可以提取出12 mL WBE。WBE 得率（X，g/100 g）的计算公式如下。
1.3.4.2 WBEE 中可溶性膳食纤维的测定
SDF 的测定采用AOAC 方法[9]。首先，准确称量（1.000±0.001）g 的样品，一式3 份。加入2 mL 无水乙醇、35 mL 50 mmol/L 马来酸缓冲液、α-淀粉酶和淀粉糖苷酶（10 万U/g）各5 mL。在37 ℃的水浴中搅拌下反应4 h。反应结束后，向体系中加入3 mL 0.75 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱溶液，以调整体系的pH 值至约8.2。取出使体系冷却至37 ℃，加入4.0 mL 2 mmol/L乙酸，将pH 值调整到约4.5，然后分别加入胰蛋白酶和胃蛋白酶（1.5 万U/g）各0.1 mL，反应30 min。抽滤后冷却至室温，加入4 倍体积的乙醇，搅拌并在室温下放置过夜。然后，以10 000 r/min 的速度离心10 min，除去上清液，并将残余物烘至恒重。SDF 提取率（X，g/100 g）计算公式如下。
式中：m0 为待测样品质量，g；m1 为烘至恒重的离心杯质量，g；m2 为离心杯和烘烤至恒重的可溶性膳食纤维块总质量，g。
1.3.4.3 WBEE 中多肽的测定
在WBEE 工艺优化中多肽含量的测定采用劳瑞法[10]。具体方法如下，酒石酸溶液A 与新鲜配制的光敏试剂溶液B 以100∶1（体积比）混合配制成碱性酒石酸铜工作液。取0.5 mL 待测液，加入1mL 酒石酸铜工作液，在室温下孵育10 min。加入125 μL FC 试剂，涡旋10 s 摇匀反应液。静置30 min 后，在Epoch2 酶标仪中测定720 nm 处吸光度。多肽含量以每100 mL WBE 的等效牛血清蛋白毫克当量（mg/100 mL）表示。每个样品测试均重复3 次[11]。
多肽的准确定量采用GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》的方法对WBE 中多肽含量进行测定和计算[12]。
1.3.5 抗氧化能力的测定
1.3.5.1 ABTS+自由基清除能力的测定
ABTS+自由基清除能力测定方法采用Zheng 等[13]的试验方法并进行稍作修改。将7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的K2S2O2 溶液按体积比1∶1 混合，避光静置12～16 h。用50 mmol/L 磷酸盐缓冲液梯度稀释到在734 nm 处的吸光度为0.70±0.02 时，即完成ABTS工作液的制备（现用现配）。分别取50 μL 的待测样液、去离子水、0.02～0.2 mmol/L 水溶Trolox 标准品溶液，加150 μL 的ABTS 工作液，轻微振荡混匀，室温避光静置6 min 后在Epoch2 酶标仪中测定734 nm 处的吸光度。每组样品做3 个平行样孔。
1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力的测定
在2 mL 试管中分别加入1 mL 0～0.8 mmol/L 的醇溶Trolox 标准液、待测液，再加入1 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 工作液。空白组：1 mL 95 %乙醇与1 mL 去离子水混合。将混合物涡旋混合30 s，室温避光反应30 min。待反应结束后，在Epoch2 酶标仪中测定517 nm 的吸光度。分别以Trolox 的浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[14]。
1.3.5.3 还原能力的测定
向100 μL 待测液、0.005～0.5 mmol/L 的抗坏血酸标准液中分别加入0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液和1 g/100 mL K3 Fe（CN）6 各250 μL，混合后，在50 ℃下反应20 min。加入250 μL 10%三氯乙酸混匀，随后10 000 r/min 离心3 min，获得250 μL 上清液。向上清液中加入250 μL 的蒸馏水和125 μL 的0.1%氯化铁，反应液上下摇匀，室温避光反应10 min。每个样品做3 个平行，在Epoch2 酶标仪中测定700 nm 的吸光度。
1.3.5.4 总抗氧化值的测定
样品的总抗氧化值采用铁还原抗氧化能力（ferricion reducingantioxidantpower，FRAP）来测定[16]。将10mmol/L TPTZ 溶液、20 mmol/L 的FeCl3 溶液和0.3 mol/L 的醋酸缓冲溶液（pH3.6） 按体积比1:1∶10 混合配制成FRAP 工作液，4 ℃避光保存，用时37 ℃预热20 min。向50 μL 待测液和0.01～2 mmol/L 的Trolox 标准溶液中加入950 μL FRAP 工作液，37 ℃避光反应30 min。取200 μL 的反应液放入酶标板中在593 nm 处于Epoch2 酶标仪测吸光度。
1.3.6 WBEE 体外发酵分析
体外模拟肠道微生物发酵试验参照Catarina 等[17]的试验方法测定。
1）发酵前准备：分别称取50 mg WBEE、WBAE 于10 mL 离心管中，用于体外发酵试验。培养基的配制按照表1 进行，配制好后进行高压灭菌。待用时再加入维生素K 和氯化血红素。
表1 体外模拟人体肠道发酵培养基配料
Table 1 Ingredients of in vitro simulated human intestinal fermentation medium
名称 配制浓度/（g/L） 名称 配制浓度蛋白胨 2 L-半胱氨酸 0.5 g/L酵母提取物 2 胆盐 0.5 g/L NaHCO3 2 NaCl 0.1 g/L MgSO4·7H2O 0.01 吐温80 2 mL/L CaCl2·6H2O 0.01 氯化血红素 0.05 g/L KH2PO4 0.04 维生素K 10 μL/L K2HPO4 0.04 刃天青 1 g/L
2）发酵液的制备：提前一周找到8 名无益生菌制品摄入、无抗生素摄入、无肠胃消化道疾病、身体健康的自愿者，男女各4 名。试验当天，收集其粪便。分别称量相同质量的粪便，以1∶3（g/mL）加入PBS 对粪便进行匀浆。4 层纱布过滤，滤液加入已灭菌并添加了维生素K 和氯化血红素的培养基，混合均匀后即为发酵液。
3）发酵样品处理：向装有样品的管中加入5 mL发酵液，以不加WBE 样品为对照组。在厌氧培养箱中37 ℃恒温培养0、6、12、24 h。对照组分别培养0、6、12、24 h。
4）短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的测定：按照Wang 等[18]的方法，对发酵好的样液中的SCFAs 进行测定。对肠道发酵环境的pH 值以及菌群浓度进行测定。
1.4 统计学分析
采用Office 2019、Origin 2021 等软件对数据进行计算处理、数据分析和作图分析。采用SPSS 26 软件对所得结果进行统计学分析，包括正态分析、方差齐性分析、单因素方差分析。通过Duncan 检验确定试验组间差异的显著性（p<0.05）。结果表述为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 WBEE 制备工艺优化结果
2.1.1 料液比最优条件的确定
料液比对多肽含量和抗氧化能力的影响见图1。
图1 料液比对多肽含量和抗氧化能力的影响
Fig.1 Effect of ratio of material to solvent on peptide content and antioxidant capacity
a.多肽含量；b.FRAP。
由图1 可知，料液比1∶8～1∶30（g/mL）的变化过程中，多肽含量逐渐升高，在料液比1∶20（g/mL）处基本达到稳定值（图1a）。FRAP 在料液比为1∶12（g/mL）时达到峰值，后逐渐下降并趋于平稳波动趋势（图1b）。考虑到实际生产情况和水资源节约问题，料液比最优条件确定为1∶12（g/mL）。
2.1.2 加酶量的确定
AHPE 添加量对多肽含量和抗氧化能力的影响见图2。
图2 AHPE 添加量对多肽含量和抗氧化能力的影响
Fig.2 Effect of AHPE addition on peptide content and antioxidant capacity
a.多肽含量；b.FRAP。
由图2 可知，随着AHPE 添加量的增加，多肽含量及FRAP 均呈现上升的趋势且在0.8%处达到峰值，然后随着添加量的增加，趋于平稳波动。这可能是底物已经被酶充分催化水解，酶添加量超过0.8%时出现冗余。因此，0.8%是AHPE 的最优添加量。
BVFE 添加量对多肽含量和抗氧化能力的影响见图3。
图3 BVFE 添加量对多肽含量和抗氧化能力的影响
Fig.3 Effect of BVFE addition on peptide content and antioxidant capacity
a.多肽含量；b.FRAP。
如图3 所示，BVFE 添加量从0.25%增加到2%时，随着BVFE 添加量的增加，多肽含量及FRAP 值均呈现稳定上升的趋势。在达到2%后，随着添加量的增加，多肽含量趋于稳定波动状态；而FRAP 值在2%出达到峰值，推测当酶添加量大于或等于2%时，底物被酶充分催化水解。因此，2%的添加量是BVFE 的最优添加量。
2.1.3 pH 值的确定
pH 值对多肽含量和抗氧化能力的影响见图4。
图4 pH 值对多肽含量和抗氧化能力的影响
Fig.4 Effect of pH value on peptide content and antioxidant capacity
a.多肽含量；b.FRAP。
由图4 可知，在固定其他条件不变的情况下，pH值从4.5 逐渐升高到8.0，多肽含量及FRAP 均呈现稳定上升的趋势；并在pH 值为8.0 时，各指标达到峰值；当继续升高体系的pH 值时，各指标显示出急剧下降的趋势。这可能是高pH 值降低了AHPE 和BVFE 的活性，从而使催化效率降低。因此，pH8.0 是制备体系的最佳pH 值。
2.1.4 反应时间的确定
反应时间对多肽含量和抗氧化能力的影响见图5。
图5 反应时间对多肽含量和抗氧化能力的影响
Fig.5 Effect of reaction time on peptide content and antioxidant capacity
a.多肽含量；b.FRAP。
由图5 可知，随着反应时间的延长，多肽含量及FRAP 均呈现先迅速上升后稳定上升的趋势，在反应3 h时，各指标值达到峰值；当继续进行反应时，均表现出稳定波动。当体系反应到3 h 时，各反应可能均已接近结束或已经结束。因此，制备工艺最佳反应时间为3 h。
2.1.5 反应温度的确定
反应温度对多肽含量和抗氧化能力的影响见图6。
图6 温度对多肽含量和抗氧化能力的影响
Fig.6 Effect of reaction temperature on peptide content and antioxidant capacity
a.多肽含量；b.FRAP。
由图6 可知，随着温度从40 ℃逐渐升高到70 ℃，多肽含量及FRAP 均表现为先上升，达到峰值后再降低的趋势；当温度为60 ℃时，所测指标均达到峰值。继续升高体系的温度，各指标急剧下降，可能是高温使体系内的酶失活，抑制了酶解反应的进行。因此，制备工艺最佳反应温度为60 ℃。
2.2 麦麸酶解物中的主要成分
工艺优化后，对冻干处理后WBEE 和WBAE 的提取率进行比较。样品中主要成分含量如表2 所示。
表2 样品提取率与主要成分的含量
Table 2 Sample extraction rate and content of major components
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
样品 提取率/（g/100 g WB）SDF 含量/（g/100 g WBE）WBAE 16.77±0.63b 24.82±0.51b 68.14±1.05a WBEE 35.49±1.20a 33.93±0.84a 63.97±2.19a多肽含量/（g/100 g WBE）
由表2 可知，每100 g WB 仅能得到（16.77±0.63）g WBAE；而WBEE 的提取率则为（35.49±1.20）g/100 g WB。较之WBAE，WBEE 的提取率明显上升（p<0.05），说明酶处理显著提高了提取物的得率。
通过AOAC 法测得每100 g WBAE 中含（68.14±1.05）g SDF，而在WBEE 中SDF 的含量为（63.97±2.19）g/100 g WBEE。尽管SDF 在WBAE 和WBEE 冻干物中占比没有明显差异，结合WBEE 的高提取率，说明联合酶解对SDF 溶出和形成有提升作用。
由凯氏定氮的结果显示，100 g WBAE 中溶解的蛋白和多肽含量为（24.82±0.51）g，WBEE 中多肽含量为（33.93±0.84）g/100g。结合WBEE 与WBAE 提取率的显著差异，可以明显看出联合酶处理不仅显著提高了WBEE的产量（p<0.001），还提高了多肽在WBE 中的占比。
综上所述，酶联合处理能够有效的将WB 中的多肽和SDF 提取出来，显著提高麦麸中生物活性物质的产量，从而表现出更强的抗氧化活性。这可能是因为BVFE 软化和破坏了WB 的细胞壁保护组织，联合蛋白酶共同作用将WB 中的大分子蛋白质和附着在表层的活性物质分解并释放出来。结果表明WBEE 中主要成分为SDF 和多肽。
2.3 麦麸酶解物抗氧化能力的测定
在ABTS+自由基清除能力测定中，WBEE 与WBAE抗氧化性能及标准品的ABTS+自由基和DPPH 自由基清除率见图7。
图7 WBEE 与WBAE 的抗氧化性能的比较
Fig.7 Antioxidant property of WBEE and WBAE
a.DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力；b.不同浓度ABTS 标准品自由基清除率；c.不同浓度DPPH 标准品自由基清除率。*** 表示组间差异高度显著，P<0.001。
以0.02～0.2 mmol/L 的Trolox 作标准曲线（y=-1.828 1x+0.472 9，R2=0.998 3）。由图7a 可知，WBEE原液的ABTS+自由基清除能力得到了显著提升（p<0.01），100 mL 的WBEE 和WBAE 的ABTS+自由基清除能力分别等效于（0.204±0.019）mmol 和（0.067±0.004）mmol的Trolox。
以0.1～0.8mmol/L 的Trolox 作标准曲线（y=-0.5446x+0.4995，R2=0.9992）。由图7a 可看出，100mLWBAE 原液的DPPH 自由基清除能力仅相当于（0.115±0.008）mmol的Trolox，而等体积的WBEE 原液较之有显著提升（p<0.001），达到等效于（0.679±0.117）mmol Trolox。酶处理提高了WBEE 原液的DPPH 自由基清除能力，这与Zhao 等[19]研究的紫麦麸提取物描述的结果相同。
WBE 的还原力和FRAP 的比较见图8。
图8 WBEE 与WBAE 的还原力和FRAP 的比较
Fig.8 Reducing power and FRAP of WBEE and WBAE
*** 表示组间差异高度显著，P<0.001。
采用Canabady-Rochelle等[20]的AERC 方法测定还原力，以0.005～0.5 mmol/L 的抗坏血酸作标准曲线（y=0.907 7x+0.000 9，R2=0.999 7）。由图8 可知，100 mL WBAE还原力等效抗坏血酸毫摩尔值为（0.032±0.003）mmol，同体积的WBEE 还原力有显著提升（p<0.001），较WBAE 提升了3 倍多，达到了（0.128±0.010）mmol。这可能是在酶解过程大量抗氧化肽和具有还原性的SDF 等生物活性物质得到释放，提高了提取物的还原力。
FRAP 以0.01～2 mmol/L 的Trolox 做标准曲线（y=0.123x+0.001 5，R2=0.998 7）。由图8 可知，WBEE 的总抗氧化活性出现较大幅度提升，100 mL 的WBEE 的FRAP 等效于（0.726±0.018）mmol 的Trolox。相较于等体积的WBAE 仅为（0.132±0.003）mmol Trolox 的FRAP，提升了4 倍多。这说明酶处理对WB 中抗氧化活性成分的释放具有明显的提升作用。这个结果与DPPH 自由基、ABTS+自由基清除活力以及还原力说明的现象基本一致，都表明WBEE 具有较好的FRAP 和还原性。另外，说明WBEE 可以作为膳食抗氧化剂的良好来源，为WB 综合利用开拓了一种新的渠道。
2.4 麦麸酶解物体外发酵试验结果
SCFAs 是肠道菌群对膳食纤维发酵进行糖酵解的产物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。近年来，越来越多的研究都在探究肠道菌群、短链脂肪酸与人体的代谢和免疫的关系[21]。大量研究表明，肠道菌群的代谢产物——SCFAs 与人体健康有显著相关性，肠道产丁酸菌和其他益生菌及其代谢产物可以调节肠道微环境的稳定[22]。
不同发酵时间下SCFAs 含量变化见图9。
图9 SCFAs 浓度在不同发酵时间的比较
Fig.9 SCFAs concentration at different fermentation time
a.乙酸含量；b.丙酸含量；c.丁酸含量；d.总SCFAs 含量。** 表示组间差异极显著，P<0.01；*** 表示组间差异高度显著，P<0.001。
体外模拟肠道微生物发酵试验结果表明，在发酵的不同时间段，WBEE 处理明显丰富了体内短链脂肪酸含量（p<0.01），特别是丁酸浓度（图9c）。可能是因为WBEE 通过调节肠道微生物组成和代谢产物对机体产 生有益影响。大量研究表明，肠道菌群消化膳食纤维，并转化为多种对人体健康有益的有机化合物，包括氨基酸、SCFAs 等[23-24]。丁酸及丁酸盐在体内可以通过脂肪酸氧化为机体供应能量，是肠道上皮细胞的主要供能物质。丁酸与机体健康密切相关，对调节肠道健康、抑制炎症及癌症等病症意义重大[22]。由图9a～图9c 可知，与空白组相比，WBAE 发酵产生的乙酸、丙酸、丁酸含量在6、12、24 h 均有极显著升高（p<0.01）。而WBEE 发酵产生的乙酸、丙酸、丁酸含量在12、24 h 较之WBAE 均有极显著升高（p<0.01）。不论是与空白组还是WBAE 相比，WBEE 对体外发酵肠道微生物代谢的影响显著，在12～24 h 发酵过程中，随着发酵时间的延长，总SCFAs 的含量与WBAE 相比有高度显著提升（图9d，p<0.001）；WBEE 在肠道发酵24 h后，乙酸、丙酸、丁酸和总SCFAs 的含量较之WBAE 增幅分别为34.2%、40.0%、79.0%和66.1%。因此，认为WBEE 中的可溶性膳食纤维和多肽可能为肠道菌群的生长提供营养和能量，改善了肠道能量供应。此外，多肽还可能会调节肠道微环境，减轻肠道内氧化自由基对肠道的损伤。这一点在肠道菌群的代谢产物（SCFAs）的恢复，尤其是丁酸显著增加，可以看出肠道环境得到改善。
3 结论
本文旨在运用生物酶联合反应从麦麸中将具有抗氧化活性的可溶性成分提取出来，提高WB 的综合利用价值。试验中发现了一种区别于传统单酶和多酶的酶处理系统，成功运用贝莱斯芽孢杆菌发酵酶破坏掉包裹在麦麸蛋白周围的纤维素、半纤维素、木质素等保护层，增加了麦麸蛋白的酶解接触面积和位点；然后与碱性水解蛋白酶一起对麦麸蛋白质进行进一步催化分解，大大提高了酶解效率并缩短了酶解时间（3 h）；大大提高了多肽[（33.93±0.84）g/100 g]和可溶性膳食纤维[（63.97±2.19）g/100 g]的产量。试验表明，酶解得到的产物具有较高的自由基清除能力[等价于（0.679±0.117）mmol Trolox/100 mL 的DPPH 自由基清除能力和（0.204±0.019）mmol Trolox/100 mL 的ABTS+自由基清除能力]、还原力[等价于（0.128±0.010）mmol抗坏血酸标品/100 mL]和抗氧化能力[等价于（0.726±0.018）mmol Trolox/100 mL]。推测麦麸酶解物可能具有祛除体内自由基并抵抗机体氧化应激损伤的功能。此外，在体外模拟肠道消化试验中，麦麸酶解物表现出良好的短链脂肪酸调节能力。与麦麸水提物相比，总脂肪酸含量涨幅为66.0%，特别是丁酸含量涨幅为79.0%。可能是因为麦麸酶解提取物中的可溶性膳食纤维和多肽改善了肠道微环境，为肠道菌群提供了充盈的能量，促进了肠道益生菌的生长，因此，使菌群代谢的短链脂肪酸的增长。接下来可以继续设计衰老模型和炎症模型开展动物实验来验证麦麸酶解物的功能。期望可以为抗击炎症和防衰老提供一种绿色健康的功能食品，实现麦麸的综合利用。
[1] 薛玉,姚轩,周中凯.葡甘聚糖酶改性麦麸可溶性膳食纤维及其对小麦粉流变学特性的影响[J].食品研究与开发,2023,44(6):42-50.XUE Yu,YAO Xuan,ZHOU Zhongkai.Structural characteristics of soluble dietary fiber derived from wheat bran following glucomannanase modification and its influence on the rheological properties of wheat flour[J].Food Research and Development,2023,44(6): 42-50.
[2] ZOU Z P,WANG M J,WANG Z G,et al.Antihypertensive and antioxidant activities of enzymatic wheat bran protein hydrolysates[J].Journal of Food Biochemistry,2020,44(1)：13090.
[3] ZHANG L,WU T,ZHANG Y L,et al.Release of bound polyphenols from wheat bran soluble dietary fiber during simulated gastrointestinal digestion and colonic fermentation in vitro[J].Food Chemistry,2023,402: 134111.
[4] YE M,TANG X F,YANG R,et al.Characteristics and application of a novel species of Bacillus: Bacillus velezensis[J].ACS Chemical Biology,2018,13(3): 500-505.
[5] ARSOV A,PETROV K,PETROVA P.Enhanced activity by genetic complementarity: Heterologous secretion of clostridial cellulases by Bacillus licheniformis and Bacillus velezensis[J].Molecules,2021,26(18): 5625.
[6] ZHAO Y,ZHAO Q,LU Q Y.Purification,structural analysis,and stability of antioxidant peptides from purple wheat bran[J].BMC Chemistry,2020,14(1): 1-12.
[7] LEE J Y,AHN E K,PARK J H,et al.Wheat bran extract regulates mast cell-mediated allergic responses in vitro and in vivo[J].Molecules,2020,25(17): 3997.
[8] KHALID A,YE M,WEI C L,et al.Simultaneous production of βglucanase and protease from Bacillus velezensis strain identified in the manure of piglets[J].Preparative Biochemistry & Biotechnology,2020,51(5): 497-510.
[9] MCCLEARY B,DEVRIES J,RADER J,et al.Determination of insoluble,soluble,and total dietary fiber (CODEX definition) by enzymatic-gravimetric method and liquid chromatography: Collaborative study[J].Journal of AOAC international,2012,95(3): 824-844.
[10] RANJINI H S,PADMANABHA UDUPA E G,KAMATH S U,et al.A specific absorbance to estimate a protein by lowry's method [J].Advanced Science Letters,2017,23(3): 1889-1891.
[11] LU Y S,FU T J.Performance of commercial colorimetric assays for quantitation of total soluble protein in thermally treated milk samples[J].Food Analytical Methods,2020,13(6): 1337-1345.
[12] NOONE D G,MARKS S D.Hyperuricemia is associated with hypertension,obesity,and albuminuria in children with chronic kidney disease[J].The Journal of Pediatrics,2013,162(1): 128-132.
[13] ZHENG L,ZHAO M M,XIAO C Q,et al.Practical problems when using ABTS assay to assess the radical-scavenging activity of peptides: Importance of controlling reaction pH and time[J].Food Chemistry,2016,192: 288-294.
[14] XING L J,LIU R,GAO X G,et al.The proteomics homology of antioxidant peptides extracted from dry-cured Xuanwei and Jinhua ham[J].Food Chemistry,2018,266: 420-426.
[15] YUN J H,KIM Y J,KOH K H.Investigation into factors influencing antioxidant capacity of vinegars[J].Applied Biological Chemistry,2016,59(4): 495-509.
[16] SZAFRA N SKA K,SZEWCZYK R,JANAS K M.Involvement of melatonin applied to Vigna radiata L.seeds in plant response to chilling stress[J].Central European Journal of Biology,2014,9(11):1117-1126.
[17] CATARINA T G,TEREZA S M,CRISTINA P W,et al.In vitro modulation of gut microbiota and metabolism by cooked cowpea and black bean[J].Foods,2020,9(7): 5349-5371.
[18] WANG A Q,LIU M,SHANG W T,et al.Attenuation of metabolic syndrome in the ob/ob mouse model by resistant starch intervention is dose dependent[J].Food & Function,2019,10(12): 7940-7951.
[19] ZHAO Y,ZHAO Q,LU Q Y.Purification,structural analysis,and stability of antioxidant peptides from purple wheat bran[J].BMC Chemistry,2020,14(1):58.
[20] CANABADY-ROCHELLELLS,HARSCOAT-SCHIAVOC,KESSLER V,et al.Determination of reducing power and metal chelating ability of antioxidant peptides: Revisited methods[J].Food Chemistry,2015,183: 129-135.
[21] YAO Y,CAI X Y,FEI W D,et al.The role of short-chain fatty acids in immunity,inflammation and metabolism[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2022,62(1): 1-12.
[22] LIU X,QIU X Y,YANG Y,et al.Alteration of gut microbiome and metabolome by Clostridium butyricum can repair the intestinal dysbiosis caused by antibiotics in mice[J].iScience,2023,26(3): 106190.
[23] WEN J J,LI M Z,NIE S P.Dietary supplementation with resistant starch contributes to intestinal health[J].Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care,2023,26(4): 334-340.
[24] WENDYCP,ERIKAML.Effectsofshortchainfattyacidsonmetabolic and inflammatory processes in human health[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids,2021,1866(5): 158900.