咖啡是茜草科常绿灌木或小乔木植物，其产量、销售量、消费量均居世界三大饮料植物之首[1]，具有提神醒脑、预防糖尿病、肝硬化与肝癌等作用[2]。咖啡鲜果分咖啡豆和咖啡果皮两部分，其中咖啡果皮含有原花青素和花青素等，具有抗氧化、抗癌、清除自由基等生理活性[3]。云南的保山、普洱、澜沧和德宏的咖啡产量占全国咖啡产量的99%[4]，咖啡果皮占成熟鲜果的43%～50%[5]，随着咖啡饮品越来越受欢迎，普洱咖啡产量越来越多，咖啡果皮量随之增加。但目前大部分咖啡果皮均被废弃未能合理开发利用，出现了资源浪费和环境污染等问题，且目前关于咖啡果皮的研究应用较少。沈晓静等[6]研究了不同海拔高度云南小粒咖啡生豆的抗氧化，发现不同海拔高度下云南小粒咖啡均具一定的抗氧化活性。刘亚玲等[7]分析了咖啡豆中咖啡类黑精的化学组成，表明咖啡豆的蛋白质和粗脂肪含量随烘焙程度加深而增加，总氨基酸含量则降低。王彦兵等[8]采用超声波辅助法结合响应面优化了咖啡果皮总黄酮的最佳提取条件和体外抗氧化活性，研究表明咖啡果皮可作为一种天然抗氧化剂来源。
白藜芦醇主要存在于虎杖[9]、葡萄[10-11]和花生[12-13]等植物中，具有显著的抗氧化性和抑菌性，有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗细菌和真菌感染等作用[14-15]。Holme等[16]研究结果证实白藜芦醇能够抑制肿瘤细胞生长；姜宁等[17]通过建立小鼠模型，得出白藜芦醇能够改善哮喘小鼠的肺功能；卢晨欣等[18]研究得出白藜芦醇与紫杉醇联合用药能够更好地抑制人喉癌Hep-2细胞的增殖，具有良好的抗癌活性；Wu等[19]研究得出白藜芦醇能够改善金黄色葡萄球菌细胞因子水平；孙慧等[20]研究得出花生壳中白藜芦醇含量较高，具有较好的抗氧化活性；王彦平等[21]研究赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇最佳提取条件及抗氧化性，研究表明白藜芦醇对DPPH·和·OH 具有较好的清除效果。研究表明，白藜芦醇在葡萄皮渣、花生茎、虎杖中的含量分别为0.014%、0.083%、0.328%[22-24]，含量较低。前期研究发现咖啡果皮中含有一定量的白藜芦醇，且关于咖啡果皮中白藜芦醇的研究鲜见报道。
因此，本试验以咖啡主要产区普洱本地丰富的咖啡果皮为原料，采用超声辅助酶法探究咖啡果皮中白藜芦醇提取的最佳工艺条件，并通过研究白藜芦醇乙醇提取液对DPPH·、·OH 的清除作用和总还原能力，评价其体外抗氧化活性，旨在高效率提取咖啡果皮中的白藜芦醇，为咖啡果皮的产品研发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与试剂
新鲜云南小粒种咖啡：采自普洱市思茅区木乃河咖啡园，咖啡鲜果果皮与种子分离后自然晒干，粉碎，过60 目筛，密封保存备用。
乙酸、乙醇、抗坏血酸、双氧水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；水杨酸、乙酸钠、硫酸亚铁（均为分析纯）：天津市风船化学试剂有限公司；纤维素酶（10 万U/g）、果胶酶（10 万U/g）、半纤维素酶（10 万U/g）、木聚糖酶（10 万U/g）（均为食品级）：山东隆科特酶制剂有限公司；白藜芦醇、1，1-二苯基-2-三硝 基 苯 肼 [1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH]（标准品）：成都植标化纯生物技术有限公司。
1.1.2 主要设备
电子天平（PR224ZH/E）：奥豪斯仪器（常州）有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-2600）：岛津国际贸易有限公司；恒温水浴锅（HH-S28s）：常州市金坛大地自动化仪器厂；多功能粉碎机（BJ-800A）：浙江杭州拜杰科技有限公司；超声波清洗机（YM-100S）：深圳市方奥微电子有限公司；低速离心机（SC-3616）：安徽中科中住科学仪器有限公司。
1.2 咖啡果皮白藜芦醇的提取工艺研究
1.2.1 标准曲线的绘制
准确配制质量浓度为0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 μg/mL 白藜芦醇标准溶液，306 nm 处测吸光度，以白藜芦醇浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。
1.2.2 咖啡果皮白藜芦醇供试液的制备与含量测定
准确称取咖啡果皮样品0.1 g，按咖啡果皮∶酶质量比500∶1 添加酶，pH5，50 ℃酶解90 min，加乙醇超声提取一定时间，3 500 r/min 离心5 min，取上清液，得一定量白藜芦醇提取液。取提取液1.00 mL，乙醇稀释至20 mL，306 nm 处测吸光度[25]，计算白藜芦醇提取率（B，%），平行测定3 次，取平均值。
式中：C 为咖啡果皮提取液白藜芦醇浓度，μg/mL；F 为咖啡果皮提取液稀释倍数；V 为咖啡果皮提取液体积，mL；m 为咖啡果皮质量，μg。
1.2.3 单因素试验设计
以白藜芦醇提取率为评价指标，设计单因素试验。
1）固定乙醇体积分数70%、料液比1∶50（g/mL）、超声时间30 min、超声温度30 ℃、酶添加量0.20%，考察不同酶（纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、木聚糖酶）对白藜芦醇提取率的影响。
2）固定料液比1∶50（g/mL）、超声时间30 min、超声温度30 ℃、酶添加量0.20%，考察乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%、80%） 对白藜芦醇提取率的影响。
3）固定乙醇体积分数70%、超声时间30 min、超声温度30 ℃、酶添加量0.20%，考察料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）]对白藜芦醇提取率的影响。
4）固定乙醇体积分数70%、料液比1∶60（g/mL）、超声温度30 ℃、酶添加量0.20%，考察超声时间（10、20、30、40、50、60 min）对白藜芦醇提取率的影响。
5）固定乙醇体积分数70%、料液比1∶60（g/mL）、超声时间30 min、酶添加量0.20%，考察超声温度（35、40、45、50、55、60 ℃）对白藜芦醇提取率的影响。
6）固定乙醇体积分数70%、料液比1∶60（g/mL）、超声时间30 min、超声温度50 ℃，考察酶添加量（0、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%） 对白藜芦醇提取率的影响。
1.2.4 正交试验优化与验证
结合单因素试验结果，设计L9（34）正交试验优化咖啡果皮白藜芦醇提取工艺，正交试验因素水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal design
水平因素A 乙醇体积分数/%D 超声温度/℃1 60 45 2 70 50 3 80 55 B 料液比/（g/mL）C 超声时间/min 1∶50 20 1∶60 30 1∶70 40
1.3 咖啡果皮白藜芦醇体外抗氧化活性研究
1.3.1 DPPH·清除率的测定
参照李中尧等[26]的测定方法，稍作改动。准确配制20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL 和120.00 μg/mL白藜芦醇样品提取液。分别移取样品提取液1.00 mL，加0.20 mmol/L DPPH 溶液3.00 mL，混匀，静置30 min，517 nm 处测吸光度。以抗坏血酸（VC）为阳性对照，计算DPPH·清除率（D，%）。
式中：Ax 为样品溶液与DPPH 的吸光度；Ax0 为无水乙醇代替DPPH 的吸光度；A0 为无水乙醇代替样品溶液的吸光度。
1.3.2 ·OH 清除率的测定
参照李燕等[27]的方法，稍作改动。分别移取20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL 和120.00 μg/mL 白藜芦醇样品提取液1.00 mL，加1.00 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和1.00 mL 6 mmol/L 水杨酸溶液，摇匀，加1.00 mL 6 mmol/L H2O2 溶液，35 ℃反应30 min，510 nm 处测吸光度。以VC 为阳性对照，计算不同浓度·OH 清除率（O，%）。
式中：Ax 为样品混合液的吸光度；Ax0 为蒸馏水代替H2O2 溶液的吸光度；A0 为蒸馏水代替样品混合液的吸光度。
1.3.3 总还原能力的测定
参照王晗等[28]的方法。分别移取20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL 和120.00 μg/mL 白藜芦醇样品提取液1.00 mL，加2.50 mL pH6.6 磷酸盐缓冲液、2.50 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃反应30 min，流水冷却，依次加2.50 mL 10%三氯乙酸、2.50 mL 蒸馏水、0.50 mL 0.1% FeCl3 溶液，混匀，反应10 min。以蒸馏水为参比，VC 为阳性对照，700 nm 处测吸光度，总还原能力与吸光度大小成正比。
1.4 数据处理
试验数据结果处理采用Origin 9.0 软件统计计算并作图，工艺优化采用L9（34）正交优化分析方法。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
白藜芦醇标准曲线见图1。
图1 白藜芦醇标准曲线
Fig.1 Standard curve for determination of resveratrol concentration
由图1 可知，回归方程为y=0.132 43x-0.038 81，R2=0.997 99，表明在分析浓度范围内白藜芦醇质量浓度与吸光度呈正相关，线性关系良好。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶种类对白藜芦醇提取率的影响
酶种类对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响结果见图2。
图2 酶种类对白藜芦醇提取率的影响
Fig.2 Effect of enzyme on the extraction rate of resveratrol
由图2 可知，不同酶对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响由大到小依次为果胶酶＞半纤维素酶＞木聚糖酶＞纤维素酶，咖啡果皮含有大量果胶，果胶酶会破坏细胞壁的网状结构去除果胶，促使白藜芦醇的溶出。故确定最佳酶种类为果胶酶。
2.2.2 酶添加量对白藜芦醇提取率的影响
酶添加量对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响结果见图3。
图3 果胶酶添加量对白藜芦醇提取率的影响
Fig.3 Effect of pectase addition on the extraction rate of resveratrol
由图3 可知，0%～0.20%果胶酶添加范围内，白藜芦醇以白藜芦醇苷的结构存在于植物中，添加外酶可使白藜芦醇苷分解为白藜芦醇，酶添加量越大白藜芦醇提取率越大，果胶酶添加量为0.20%时，提取率达0.854%。当果胶酶添加量大于0.20%时，咖啡果皮中的白藜芦醇提取量基本已达到最大极限，提取率趋于平缓，故确定最佳酶添加量为0.20%，后续不对该条件进行优化。
2.2.3 乙醇体积分数对白藜芦醇提取率的影响
乙醇体积分数对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响结果见图4。
图4 乙醇体积分数对白藜芦醇提取率的影响
Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of resveratrol
由图4 可知，白藜芦醇提取率呈先升后降趋势，乙醇体积分数为70%时，提取率最大，达0.718%。分析原因可能是随着乙醇体积分数的增加，白藜芦醇亲和力增强，同时一些与白藜芦醇竞争乙醇-水分子的亲脂性成分也会随之增加[29]，从而导致白藜芦醇溶出度降低，提取率下降。因此选取乙醇体积分数60%、70%、80%进行正交优化。
2.2.4 料液比对白藜芦醇提取率的影响
料液比对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响结果见图5。
图5 料液比白藜芦醇提取率的影响
Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of resveratrol
由图5 可知，随着提取溶剂的增加，咖啡果皮白藜芦醇提取率不断增大，料液比为1∶60（g/mL）时提取率最大，之后提取率趋于平缓。因此选取料液比1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）进行正交优化。
2.2.5 超声时间对白藜芦醇提取率的影响
超声时间对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响结果见图6。
图6 超声时间对白藜芦醇提取率的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of resveratrol
由图6 可知，白藜芦醇提取率呈先升后降趋势，当超声时间为30 min 时，提取率最大，达0.934%。超声时间为10～30 min 时，由于超声波转化为热能，物料内部温度升高，使得白藜芦醇加速溶解；其次在溶液中超声波传播时会发生空化效应[30]使细胞壁迅速破裂，白藜芦醇不断从咖啡果皮中被释放出来。随着超声时间的延长，大部分白藜芦醇已被提取出来，超声时间过长会破坏白藜芦醇分子结构，导致白藜芦醇提取率下降。因此选取超声时间20、30、40 min 进行正交优化。
2.2.6 超声温度对白藜芦醇提取率的影响
超声温度对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响结果见图7。
图7 超声温度对白藜芦醇提取率的影响
Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of resveratrol
由图7 可知，白藜芦醇提取率呈先升后降趋势，50 ℃时提取率最大，达0.754%。这是因为50 ℃是果胶酶的最适温度，继续增加温度则酶活性减弱，导致白藜芦醇难溶出，提取率下降。因此选取超声温度45、50、55 ℃进行正交优化。
2.3 正交试验优化结果
设计以乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声时间（C）和超声温度（D）单因素为基础的L9（34）正交试验，结果见表2。
表2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal test
试验号 A 乙醇体积分数 B 料液比C 超声时间D 超声温度 提取率/%1 1 1 1 1 0.791 2 1 2 2 2 0.677 3 1 3 3 3 0.623 4 2 1 2 3 0.679 5 2 2 3 1 0.823 6 2 3 1 2 0.739 7 3 1 3 2 0.730 8 3 2 1 3 0.709 9 3 3 2 1 0.637 K1 2.091 2.200 2.239 2.251 K2 2.241 2.209 1.993 2.146 K3 2.076 1.999 2.176 2.011
续表2 正交试验结果
Continue table 2 Results of orthogonal test
?试验号 A 乙醇体积分数 B 料液比C 超声时间D 超声温度 提取率/%k1 0.697 0.733 0.746 0.750 k2 0.747 0.736 0.664 0.715 k3 0.692 0.666 0.725 0.670 R 0.050 0.070 0.082 0.080
由表2 可知，各因素对咖啡果皮白藜芦醇提取率的影响程度为C＞D＞B＞A，即超声时间是影响咖啡果皮白藜芦醇提取率的主要因素，其次是超声温度、料液比和乙醇体积分数。最佳提取工艺条件为A2B2C1D1，即乙醇体积分数70%、料液比1∶60（g/mL）、超声时间20 min，超声温度45 ℃。在此最佳工艺条件下重复试验3 次测得咖啡果皮白藜芦醇提取率为0.856%，大于正交试验中最高提取率，说明正交试验设计合理，确定A2B2C1D1为咖啡果皮白藜芦醇的最佳提取工艺条件组合。
2.4 咖啡果皮白藜芦醇体外抗氧化活性研究
2.4.1 对DPPH·的清除作用
咖啡果皮白藜芦醇对DPPH·的清除效果见图8。
图8 咖啡果皮白藜芦醇提取液对DPPH·的清除作用
Fig.8 DPPH free radical scavenging effect of resveratrol from coffee bean peels
由图8 可知，20～120 μg/mL 浓度范围内，咖啡果皮白藜芦醇对DPPH·清除率基本随质量浓度的增加呈递增趋势，且在20 μg/mL 时清除率明显强于抗坏血酸，可能是因为此时提取液中有高比例的原花青素、花青素和绿原酸等抗氧化物质的溶出，对DPPH·清除率明显高于抗坏血酸。整体来看，在试验浓度范围内，咖啡果皮白藜芦醇对DPPH·清除率和抗坏血酸接近。
2.4.2 对·OH 的清除作用
咖啡果皮白藜芦醇对·OH 的清除效果见图9。
图9 咖啡果皮白藜芦醇提取液对·OH 的清除作用
Fig.9 Hydroxyl free radical scavenging effect of resveratrol from coffee bean peels
由图9 可知，20～120 μg/mL 浓度范围内，咖啡果皮白藜芦醇对·OH 有较强的清除能力，清除率与浓度呈线性关系，即随着浓度的增加清除能力增强，在分析的浓度范围内咖啡果皮白藜芦醇对·OH 清除能力明显强于抗坏血酸。
2.4.3 总还原能力的测定
咖啡果皮白藜芦醇的总还原能力见图10。
图10 咖啡果皮白藜芦醇提取液总还原能力
Fig.10 Reducing power of resveratrol from coffee bean peels
由图10 可知，20～120 μg/mL 浓度范围内，咖啡果皮白藜芦醇总还原能力与浓度存在一定量效关系，总还原能力随着浓度的增加而增强，在相同试验浓度下，咖啡果皮白藜芦醇总还原能力始终强于抗坏血酸，表明咖啡果皮白藜芦醇具有较强的总还原能力。
3 结论
本试验充分利用普洱本地丰富的咖啡果皮，在70%乙醇体积分数、1∶60（g/mL）料液比、20 min 超声时间、45 ℃超声温度条件下得到0.856%高提取率的白藜芦醇。
超声波辅助提取应用于大多数植物提取，提取时间短、操作简单、耗能低、安全性高；果胶酶有助于白藜芦醇的溶出，二者结合白藜芦醇提取效果更佳。体外抗氧化试验结果表明，在试验浓度范围内咖啡果皮白藜芦醇提取液对DPPH·和·OH 的清除能力明显强于VC，证明其在咖啡果皮抗氧化产品的研究方面前景广阔。
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