微生物多糖是微生物菌体细胞在生长代谢过程中产生的一类高分子聚合物[1]，能在高压、高渗、高酸碱等环境下保护自身免受损伤[2]。根据在细胞中的位置，微生物多糖可分为胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、胞壁多糖和胞内多糖[3]。其中微生物EPS 具有乳化[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、抗炎[7]及免疫调节[8]等特性，被广泛应用于医疗、护肤、食品、制药、石油开采等领域，同时因易分离、周期短、杂质少等优点而备受学者关注[9]。
随着社会经济增长和人们生活水平的提高，微生物EPS 产品的市场需求越来越大。当前微生物EPS主要来自于乳酸菌、芽孢杆菌（Bacillus）以及链霉菌（Streptomyces）等[10]，多数菌种的产糖能力和性能仍有待进一步提高。良好、新颖的产EPS 菌种来源和独特的生物活性开发，以及合适的发酵产糖工艺构建，仍是当前微生物EPS 的研究热点和进一步开拓应用市场的必要前提。
乳化是微生物EPS 的重要功能之一，能使疏水性底物分散成细小的液滴，可作为天然乳化剂应用于相关行业。王纯玮等[11]研究发现，两种开菲尔EPS 在1 h时的乳化活性分别为51.68%和48.26%，高于瓜尔豆胶和黄原胶，能在溶液中长时间保持乳化液状态，该多糖产品可作为乳化剂应用于食品行业。Vinothkanna等[12]研究发现，地衣芽孢杆菌AG-06 EPS 的絮凝和乳化活性分别为71.83%和67.79%，该菌所产EPS 经纯化后可作为生物絮凝剂应用于食品和石油行业。
水体沉积物蕴藏丰富的微生物菌种资源。本研究从太湖沉积物中筛选获得一株产EPS 的细菌TH21-44，经鉴定为当前微生物EPS 报道较少的副球菌属，并对其产糖能力、发酵条件和乳化性能进行研究，以期为丰富微生物EPS 生产来源、性能开发和应用提供参考和依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌株TH21-44：太湖沉积物中筛选获得；葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、硝酸钠、尿素、无水乙醇、苯酚（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；酵母浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、丙酮酸钠、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限公司；氯仿、正丁醇：四川西陇科学股份有限公司。
R2A 培养基[13]：酵母浸粉0.5 g/L、胰蛋白胨0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、葡萄糖0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸钠0.3 g/L，pH7.0～7.2，115 ℃灭菌30 min。
改良R2A 培养基：酵母浸粉0.5 g/L、胰蛋白胨0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、葡萄糖1.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸钠0.3 g/L，pH7.0～7.2，115 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
UV-2450 紫外可见分光光度计：日本SHIMADZU（岛津） 公司；VS-840-2 洁净工作台、BXM-30R 立式压力蒸汽灭菌锅、BSD-YX2400 智能精密摇床：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 细菌种属鉴定
参考《常见细菌系统鉴定手册》[14]对菌株TH21-44进行形态观察和生理生化试验，采用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-碱裂解法提取细菌的基因组DNA，使用E.coli 16S rRNA 基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）[13]，对其16S rRNA 基因进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测后进行核苷酸序列测定，所得序列提交GenBank 数据库中对比，并用MEGA-X 软件[15]以邻接法（neighbor-joining）[16]构建系统发育树。结合形态观察、生理生化结果和16S rRNA基因系统发育分析结果，确定菌株的种属地位。
1.3.2 生长曲线及产EPS 曲线
菌株TH21-44 于改良R2A 固体培养基上培养3～5 d，挑取新鲜菌体接入改良R2A 液体培养基，28 ℃、150 r/min 培养24 h，调整OD600 为0.8 用作种子液，以5%（体积比）接种量接入改良R2A 液体培养基，同条件培养，不同时间（0、12、18、24、36、42、48、60、66、72、84 h）采集发酵液样品，测定OD600，绘制生长曲线。发酵液样品以8 000 r/min 离心10 min，上清液采用硫酸苯酚法[17]测定EPS 含量，绘制菌株产EPS 曲线。
1.3.3 发酵产EPS 条件的单因素优化
以改良R2A 培养基为基础发酵培养基，初始条件为pH7.0、接种量5%、温度28 ℃、转速150 r/min、发酵时间42 h。分别考察1.0 g/L 碳源（葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖）及碳源浓度（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 g/L）、1.0 g/L 氮源（酵母浸粉、胰蛋白胨、酸水解酪蛋白、尿素、氯化铵、硝酸钠）及氮源浓度（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 g/L）、温度（25、28、31、34、37 ℃）、pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和接种量（1%、3%、5%、7%、9%）对菌株TH21-44 产EPS 量的影响。
1.3.4 发酵条件响应面试验设计
在单因素试验结果的基础上，使用Design-Expert 12 软件进行响应面试验设计，以葡萄糖浓度（A）、接种量（B）和pH 值（C）3 个因素作三因素三水平的响应面试验，EPS 产量（Y）为响应值，优化菌株产EPS 的综合条件。响应面试验因素与水平如表1 所示。
表1 发酵条件优化响应面试验因素水平
Table 1 Response surface factors and levels for optimization of fermentation conditions
水平 因素A 葡萄糖浓度/（g/L） B 接种量/% C pH 值-1 3 3 6.5 0 5 5 7.0 1 10 7 7.5
1.3.5 EPS 乳化性能测定
参照杨晨璐等[18]的方法提取菌株TH21-44 在优化条件下发酵所产的EPS。收集发酵液，55 ℃减压浓缩为原体积的1/5，加入1/4 体积的Sevage 试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1，体积比）反复振荡脱蛋白，8 000 r/min 离心10 min 直至两相之间无蛋白层，上清液用活性炭除色素，装入透析袋中透析48 h（截留分子量为2 000 Da），每6 h 换一次水，后加入3 倍体积的无水乙醇，4 ℃静置过夜，收集沉淀并用蒸馏水复溶，冷冻干燥得TH21-44 粗EPS。配制5 mg/mL 的粗EPS 溶液并测定其多糖含量，以芝麻油、大豆油、橄榄油、葵花油、汽油、柴油和二甲苯作乳化底物，吐温80 为阳性对照，以EPS∶底物=2∶3（体积比）混合，利用高速匀浆机剧烈搅拌2 min，精确测量24、48、72 h 的乳化高度和液体总高度，以乳化高度/总高度评估对油类和烃类的乳化能力[19]。
1.4 数据处理
所有试验设置3 个平行，结果用平均值±标准差表示，运用Origin 9.0 软件作图，单因素试验数据用IBM SPSS Statistics 26 软件进行显著性分析，响应面试验设计和分析运用Design-Expert 12 软件进行。
2 结果与分析
2.1 细菌种属鉴定结果
形态学和生理生化结果表明，菌株TH21-44 为革兰氏阴性菌，球状，菌体直径0.5～1.0 μm，于R2A 培养基上菌落显浅橙色，圆形，较湿润，接触酶、氧化酶、脲酶、硝酸盐/亚硝酸盐还原及吲哚产生阳性，H2S、反硝化作用阴性，不能降解淀粉、明胶和纤维素，生长条件为25～37 ℃、0%～1% NaCl、pH6.5～8.0。
基于菌株TH21-44 的16S rRNA 基因序列（Gen－Bank 登录号OP422630），采用邻接法构建系统发育树，结果如图1 所示。
图1 菌株TH21-44 基于16S rRNA 基因序列的系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of strain TH21-44 based on 16S rRNA gene sequences
Rhodobacter capsulatus ATCC 11166T 作外围参照菌，采用邻接法构建系统发育树，0.010 为进化距离，括号内为GenBank 登录号。
由图1 可知，TH21-44 16S rRNA 基因与Paracoccus aeridis JC501 的同源性最高，相似度98.54%，且二者聚在同一分支。综合形态和生理生化特征以及16S rRNA 系统发育分析结果，初步鉴定菌株TH21-44 为副球菌（Paracoccus sp.）。
微生物EPS 来源广，种类多，菌种资源开发和应用仍是当前相关领域研究的重点和前提。副球菌属（Paracoccus sp.）是由Davis 等[20]于1969 年提议并进行描述，该属大多为革兰氏阴性菌，球状或短杆状，过氧化氢酶和氧化酶阳性，具有不同的代谢特性[21]。Raguénès 等[22]描述了副球菌亚种玉米黄原菌的胞外多糖EPS1 和EPS2，其中EPS1 硫酸盐含量高，有潜力应用于化妆品领域。其他关于副球菌产EPS 的研究鲜有报道。
自湖泊沉积物中分离筛选到的产EPS 副球菌TH21-44，所处环境低温少氧，分类同源最近的菌株P.aeridis JC501，分离于印度附生兰植物根样，菌落干燥，质地紧密，无产EPS 的明显特征[23]。
2.2 生长曲线及产胞外多糖曲线
菌株TH21-44 生长曲线和产EPS 曲线见图2。
图2 菌株TH21-44 的生长曲线和产胞外多糖曲线
Fig.2 Growth curve and exopolysaccharide production curve of strain TH21-44
由图2 可知，TH21-44 的生长和产EPS 变化趋势一致，但EPS 曲线时间上稍滞后，18 h 前菌株处于指数生长期，培养基中葡萄糖消耗速率大于EPS 产生速率，故曲线呈现下降趋势，在42 h 时菌株的EPS 产量最高，为（59.33±3.14）μg/mL，42 h 后EPS 产量有所下降，推测是由于培养基中葡萄糖消耗殆尽，少部分菌株会利用EPS 进行缓慢生长，减少EPS 积累[24]。
2.3 菌株TH21-44 发酵产EPS 单因素条件优化结果
2.3.1 碳源及其浓度
碳源及其浓度对菌株TH21-44 生长和EPS 产量的影响结果见图3。
图3 碳源及葡萄糖浓度对菌株TH21-44 胞外多糖产量的影响
Fig.3 Effects of carbon sources and glucose concentration on the exopolysaccharide production of strain TH21-44
A．碳源种类；B．葡萄糖浓度。不同小写字母表示EPS 产量差异显著（P＜0.05）。
由图3A 可知，菌株以葡萄糖作为碳源时产糖效果最佳，对应EPS 产量为（52.10±2.04）μg/mL。从生物量来看，菌株以葡萄糖为碳源时生物量最高，而对其它5 种碳源的利用率明显偏低；由图3B 可知，增大葡萄糖浓度，菌株EPS 产量先增加后减少，当葡萄糖浓度为5.0 g/L 时，EPS 的产量达到最高值，为（130.54±3.07）μg/mL。因此选择浓度为5.0 g/L 的葡萄糖为碳源进行后续试验。
2.3.2 氮源及其浓度
氮源及其浓度对菌株TH21-44 生长和EPS 产量的影响结果见图4。
图4 氮源及酵母浸粉浓度对菌株TH21-44 胞外多糖产量的影响
Fig.4 Effects of nitrogen sources and yeast extract concentration on the exopolysaccharide production of strain TH21-44
A．氮源种类；B．酵母浸粉浓度。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4A 可知，当酵母浸粉作为氮源时，菌株EPS 产量最高为（48.93±0.57）μg/mL，尿素和胰蛋白胨次之，酸水解酪蛋白作氮源的产糖量最低，以尿素、氯化铵和硝酸钠作为氮源时，菌株生长同时受限；由图4B 可知，当酵母浸粉浓度为3.0 g/L 时，菌株EPS 产量达到峰值，为（68.05±3.35）μg/mL，继续增大酵母浸粉浓度，菌体量和EPS 产量均下降。因此选择浓度3.0 g/L的酵母浸粉为氮源进行后续试验。
2.3.3 温度、pH 值和接种量优化
不同温度、pH 值和接种量对菌株TH21-44 产EPS 的影响见图5。
图5 温度、pH 值和接种量对菌株TH21-44 胞外多糖产量的影响
Fig.5 Effects of temperature,pH,and inoculum size on the exopolysaccharide production of strain TH21-44
A．温度；B．pH 值；C．接种量。不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5A 可知，菌株在28 ℃时发酵产量最高，EPS产量为（46.77±3.41）μg/mL，随着温度的增加，其产糖量逐渐趋于平稳；由图5B 可知，在pH6.0～8.0 时，随着pH 值的增加，菌株EPS 产量先增加后减少，在pH7.0 时产糖量达到最高，为（50.74±0.34）μg/mL，其他pH 值条件下，EPS 产量较低；由图5C 可知，以5%接种量培养发酵产糖的效果最佳，EPS 产量达到（44.05±3.63）μg/mL，菌株生物量也达到最高值。因此，分别选取温度28 ℃、pH7.0 和接种量5%进行后续分析。
2.4 响应面试验结果
2.4.1 单因素试验方差分析
运用SPSS Statistics 26 软件进行方差分析，确定对EPS 产量影响最显著的因素，结果见表2。
表2 IBM SPSS Statistics 方差分析
Table 2 Analysis of variance in IBM SPSS Statistics
注：* 表示影响显著（P<0.05）；** 表示影响极显著（P<0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 显著性葡萄糖浓度 18 905.570 5 3 781.114 65.967 0.000**酵母浸粉浓度 2 947.247 4 736.812 40.934 0.001**pH 值 1 217.860 4 304.465 27.963 0.001**温度 362.479 4 90.620 6.469 0.033*接种量 1 924.686 4 481.171 39.892 0.001**
由表2 可知，葡萄糖浓度、酵母浸粉浓度、pH 值和接种量对EPS 的产量均具有极显著的影响（P<0.01），而温度对EPS 产量具有显著影响（P<0.05），影响的主次顺序为葡萄糖浓度>酵母浸粉浓度>接种量>pH 值>温度。
2.4.2 响应面试验设计及结果分析
氮源浓度过高对菌株有一定毒害作用，影响微生物EPS 的积累，因此选取葡萄糖浓度（A），接种量（B）和pH 值（C）为主要影响因素，EPS 产量（Y）为响应值，设计三因素三水平的Box-Behnken 试验，结果见表3，方差分析结果见表4，各因素交互作用对EPS 产量影响的三维模型图见图6。
图6 各因素交互作用对EPS 产量影响的响应面与等高线
Fig.6 Response surface plots and contour plots of the effects of the interactions between factors on the yield of exopolysaccharides
表3 Box-Behnken 试验设计及结果
Table 3 Box-Behnken design and test results
试验号 A B C Y/（μg/mL）1-1-1 0 61.31±11.35 2 1-1 0 121.24±7.72-1 1 0 65.63±2.04 4 1 1 0 151.89±3.41 3 5-1 0-1 69.71±5.68 6 1 0-1 110.35±1.36-1 0 1 36.57±6.13 8 1 0 1 141.68±9.99 7-1-1 116.70±0.91 10 0 1-1 136.23±8.63 11 0-1 1 108.99±2.27 12 0 1 1 139.18±1.59 13 0 0 0 145.99±6.13 14 0 0 0 147.12±2.72 15 0 0 0 150.30±0.45 16 0 0 0 153.93±0.91 17 0 0 0 154.62±5.22 9 0
表4 二次回归方程方差分析
Table 4 Analysis of variance of the quadratic regression equation
注：* 表示影响显著（P<0.05）；** 表示影响极显著（P<0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 22 658.83 9 2 517.65 84.78 <0.000 1 **A 10 653.69 1 10 653.69 358.78 <0.000 1 **B 1 013.87 1 1 013.87 34.14 0.000 6 **C 41.50 1 41.50 1.40 0.275 7 AB 122.94 1 122.94 4.14 0.081 3 AC 970.52 1 970.52 32.68 0.000 7 **BC 28.46 1 28.46 0.958 4 0.360 2 A2 13 218.48 1 13 218.48 445.15 <0.000 1 **B2 226.74 1 226.74 7.64 0.028 0 *C2 1 331.21 1 1 331.21 44.83 0.000 3 **残差 207.86 7 29.69失拟项 147.40 3 49.13 3.25 0.142 3 不显著纯误差 60.46 4 15.12总和 22 866.69 16
对Box-Behnken 试验设计数据进行多元二次回归拟合，得到响应值Y 与3 个因素A、B、C 的回归方程：Y =179.23 +36.49A +11.72B +2.37C-5.31AB +14.91AC +2.67BC-71.88A2-7.34B2-17.78C2。
由表4 可知，模型F 值为84.78，P<0.000 1,差异极显著，表明模型具有较高的可信度，方程式中一次项A 和B 对菌株产EPS 的影响极显著，C 影响不显著，各个因素影响的顺序为A>B>C；结合图6 可知，A和C 的响应曲面走势最陡，且A 和C 的等高线呈椭圆形，说明两者交互作用影响极显著，交互项因素影响的次序为AC＞AB＞BC；二次项A2 和C2 影响极显著，B2影响显著。失拟项P=0.142 3，差异不显著，表明模型拟合效果好；相关系数R2=0.990 9，表明模型回归效果好，R2adj 和R2pre 分别为0.979 2 和0.897 9，两者相差远小于0.2，信噪比=27.035 2>4，表明模型更精准，真实性强。因此，该模型可以用来解释发酵条件对菌株TH21-44产EPS 的影响。
2.4.3 发酵最优条件及验证试验
对响应面优化所得模型进行数值分析，得到EPS产量最高值为188.99 μg/mL，对应最优发酵条件为葡萄糖浓度7.160 g/L、接种量6.123%和pH7.112，其他条件为酵母浸粉3.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L 及丙酮酸钠0.3 g/L。实际验证操作按照葡萄糖浓度7.2 g/L、接种量6.1%和pH7.1，其他参数不变，该条件下测得菌株TH21-44 产EPS 的实际值为（188.89±0.91）μg/mL，与预测值一致，由此可知该模型能够较好地预测菌株TH21-44 产EPS 的实际情况。
研究表明，Xu 等[25]通过搅拌速率、曝气速率和分批补料的发酵模式使光滑念珠菌的EPS 产量提高了1.53 倍；孙建瑞等[26]采用响应面试验对淡水微藻EPS的积累进行优化，结果使其EPS 产量达到70.37 mg/L，是优化前的1.62 倍。本研究采用响应面法优化TH21-44 发酵产EPS，结果产量是优化前的3.18 倍。
微生物培养基成分、培养条件对EPS 的产量、生物活性及结构表征有较大影响[27-29]。本研究当葡萄糖浓度增加到10 g/L 时，菌株TH21-44 的生物量和EPS产量均下降，这可能是因为葡萄糖浓度过高，增大环境渗透压，从而导致细菌细胞吸收葡萄糖的效率降低，影响EPS 的产生[30]；当酵母浸粉浓度超过3 g/L 时，生物量和产糖量急剧下降，可能是由于高浓度氮源对微生物细菌有毒害作用，氮源被细菌代谢后产生铵态氮或硝态氮，一定程度上影响菌体生长，从而抑制EPS 的产生[31]，此外，氮源作为细菌合成蛋白质、核酸以及其他能源物质的前体，浓度过高会使菌株胞内和胞外蛋白的合成量增加，从而影响后续的产物提纯[32]。同时，高于28 ℃、偏酸以及偏碱的培养条件下，菌株TH21-44 生物量和EPS产量也有所下降，高温、酸性或碱性环境会严重影响相关酶活和新陈代谢[33]；当接种量低于5%时，菌株生长缓慢，耗时耗力，接种量高于5%时，菌株生长迅速，衰亡期提前，菌体自溶释放出EPS，被其他细菌细胞吸收利用，从而影响EPS 积累[34]。
2.5 菌株TH21-44 所产EPS 的乳化性能
本研究中制备所得粗EPS 溶液中多糖浓度为4.87 mg/mL，其乳化能力测试结果见表5。
表5 菌株TH21-44 胞外多糖对油类和烃类的乳化能力
Table 5 Emulsification capacity of EPS produced by strain TH21-44 for oils and hydrocarbons %
注：同行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
油/烃类 24 h 48 h 72 h EPS EPS EPS 吐温80芝麻油 62.58±3.82a 61.39±3.67a 60.49±3.31a 60.68±0.33a大豆油 62.13±0.65b 61.35±1.15b 60.46±0.96b 63.57±0.61ab橄榄油 66.55±0.48a 64.38±1.08a 63.01±0.19a 64.24±2.25a葵花油 69.62±0.82a 69.04±1.04a 68.10±1.17a 59.94±1.37b汽油 63.26±0.30ab 62.61±0.46ab 62.20±0.64ab 61.56±0.15b柴油 64.60±1.38a 63.58±1.00ab 62.76±0.81ab 59.93±1.57b二甲苯 67.13±2.60ab 66.55±2.14ab 65.38±2.59b 65.75±2.58b吐温80 62.74±0.69a 64.94±0.49a 66.85±3.30a 63.36±1.08b 63.97±1.26a 62.77±1.57ab 75.41±3.72a吐温80 61.50±0.27a 64.34±0.42ab 65.87±2.93a 61.87±1.06b 62.83±0.26ab 61.35±1.50ab 70.22±2.24ab
由表5 可知，EPS 对油类和烃类的乳化能力在72 h内均保持60%以上，其中对葵花油的乳化能力最强，24 h 时达到69.62%，优于吐温80 的乳化能力，且72 h的乳化能力仅下降1.52%，无显著差异（P＜0.05），说明该EPS 对葵花油的乳化稳定性较好，这样的稳定性在乳化芝麻油、大豆油、橄榄油和汽油上也有体现。
据报道，海氏芽孢杆菌CamB6 所产EPS 在24 h时对葵花油的乳化能力为62.73%[35]，泛菌属BCCS 001 GH 所产EPS 在72 h 时对葵花油的乳化能力为50.60%，72 h 内的乳化效果下降了2.30%[36]。相比之下，本研究中菌株TH21-44 的EPS 对葵花油的乳化能力及乳化稳定性具有较强的优势，具备作为生物乳化剂应用于食品和洗涤行业的潜力。
4 结论
分离筛选获得的高效产胞外多糖菌株TH21-44，经鉴定为副球菌（Paracoccus sp.）；其EPS 最佳发酵条件为pH7.1、接种量6.1%、温度28 ℃、葡萄糖7.2 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L 及丙酮酸钠0.3 g/L，该条件下EPS 产量为188.89 μg/mL，是优化前的3.18 倍；该条件下所产EPS对油类和烃类具有良好的乳化性能，其中对葵花油的乳化能力最强，24 h 达到69.62%，72 h 时仍保持稳定，能力明显优于吐温80。本研究丰富了微生物EPS 的菌种来源，并对微生物EPS 的开发及其乳化性能应用，提供了重要的参考依据。
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