红托竹荪（Dictyophora rubrovalvata）主产地为云贵川地区，是珍贵的食用菌品种，也是贵州具有代表性的珍稀特色食用菌资源，尤以贵州织金产的红托竹荪脆嫩鲜甜、肉厚多汁为佳品，所以织金素有“竹荪之乡”的美誉[1-2]。研究表明，红托竹荪含有多糖、氨基酸、类黄酮和维生素等多种营养物质，具有抗癌、抗炎、抗氧化和提高免疫力等功效[3-6]，属药食两用真菌，具有很好的开发前景。
竹荪子实体主要由菌柄和菌裙（子实体）、菌帽、菌托三部分组成，其中竹荪菌托的质量约占子实体鲜重的40%[7]。菌托由外膜和膜间胶质构成，是撒裙和子实体抽柄在菌蕾时期的营养供给体，含有多糖、氨基酸、蛋白质和维生素等，其中菌托多糖含量高于其他部分[8]。食用菌多糖是一种能够增强人体免疫功能的生物活性物质，具有降血脂、降血糖、抗衰老、抗炎和抗肿瘤等功效，国际学术界称之为生物应答效应物，受到药学、功能食品等领域的广泛关注[9-12]。目前，在竹荪的加工过程中，菌托部分常被当作废弃物处理，不仅污染环境，更是造成了资源的浪费[13]。因此，竹荪菌托的开发利用不仅有良好的商业价值，而且符合低碳环保的发展观念[14]。
多糖的提取方法较多，有水提醇沉法、酸碱法、酶解提取法、微波辅助提取法、超高压辅助提取法和超声辅助提取法等[15]。赵凯等[12]研究发现，料液比和浸提时间对多糖得率的影响较大，通过正交试验获得最佳条件为料液比1∶15（g/mL）、浸提时间4 h、提取2 次后的多糖得率为12.03%。吴雪艳等[16]利用响应面法优化竹荪菌托多糖提取条件，发现液料比为62∶1（mL/g）、提取温度为82 ℃、提取时间为3.1 h 时，竹荪菌托多糖的提取率为13.02%。本研究采用超声辅助提取法对红托竹荪菌托中的多糖进行提取，以响应面法优化确定竹荪菌托多糖提取工艺的最佳条件，并制备竹荪菌托多糖泡腾片，以期为推进红托竹荪功能食品的开发提供参考，为拓宽竹荪多糖的产业化应用范围提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红托竹荪菌托：贵州美味鲜竹荪产业有限公司。4 倍体积无水乙醇浸泡48 h，抽滤，55 ℃烘干至恒重，粉碎过40 目筛，密封保存备用。
无水乙醇、95%乙醇、苯酚、硫酸（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；正丁醇、丙酮、三氯甲烷、葡萄糖（均为分析纯）：安徽酷尔生物工程有限公司；柠檬酸、碳酸氢钠、阿斯巴甜、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）K30（均为食品级）：河南万邦实业有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000（食品级）：曲阜市天利药用辅料有限公司。
1.2 仪器与设备
FA1204 分析天平：上海良平仪器仪表有限公司；YF-150 研磨粉碎机：瑞安市永历制药机械有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；TD4 台式低速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；UV755B 紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；TDP-0 手摇单冲压片机：邢台荣武机械制造厂。
1.3 试验方法
1.3.1 超声辅助提取红托竹荪菌托多糖
称量3.0 g 红托竹荪菌托干粉，超声辅助提取2 次，4 000 r/min 离心15 min，取上清液，旋转蒸发仪蒸发浓缩（温度75 ℃、转速40 r/min、真空度0.06～0.07 MPa）至50 mL，冷却至室温（25 ℃）加入95%乙醇（多糖溶液∶95%乙醇=1∶3，体积比）醇沉，-4 ℃冰箱冷藏静置24 h，4 000 r/min 离心15 min，抽滤，滤饼用无水乙醇和丙酮各洗涤1 遍，55 ℃烘箱干燥至恒重，即得粗多糖，称质量，多糖提取率（Y，%）的公式如下。
Y=（m1/m2）×100
式中：m1 为提取液中粗多糖质量，g；m2 为红托竹荪干粉质量，g。
1.3.2 多糖含量的测定
红托竹荪菌托多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[17]。葡萄糖标准曲线：配制0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液，稀释至质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL 的溶液，取1 mL 样品加入1 mL 6%苯酚，再缓慢加入5 mL 浓硫酸，摇匀冷却后在490 nm 下测定吸光度（A），以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，并得到回归方程为y=11.051x+0.002 4，R2=0.999。
1.3.3 单因素试验
考察超声功率（280、320、360、400、440 W）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]和超声温度（35、45、55、65、75 ℃）对红托竹荪菌托多糖提取率的影响。标准提取工艺条件为超声功率400 W、超声时间40 min、料液比1∶30（g/mL）、超声温度45 ℃。
1.3.4 响应面优化试验
基于单因素试验结果，选择超声功率、超声时间、料液比和超声温度4 个因素为自变量，以竹荪菌托多糖提取率为响应值，依据Box-Behnken 中心组合试验原理设计四因素三水平响应面试验优化竹荪菌托多糖提取工艺，响应面试验因素和水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
因素水平A 超声功率/W B 超声时间/min C 料液比/（g/mL）D 超声温度/℃-1360301∶3045 0 400451∶4060 1 440601∶5075
1.3.5 粗多糖去蛋白、脱色及透析
菌托粗多糖研磨过80 目筛，按多糖∶水=1∶50（g/mL）加入蒸馏水，50 ℃超声至完全溶解。根据多糖溶液与Sevage 试剂（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1）体积比为3∶1，加入后充分振摇10 min，然后静置20 min。重复操作3 次，充分去除蛋白质。去蛋白后用1.5%活性炭脱色30 min，重复3 次。脱色后的多糖溶液先用棉花过滤掉活性炭，再用离心机4 000 r/min 离心15 min。上清液装入透析袋透析48 h，溶液醇沉、干燥后即得脱色去蛋白多糖。
1.3.6 竹荪菌托多糖泡腾片的制备
以红托竹荪菌托中提取的多糖为原料，采用酸碱分开制粒混合压片法制备泡腾片。在单因素试验的基础上，以崩解效果、色泽、口感等综合评分为评价指标，以酸碱比（2∶1、1.5∶1、1∶1）、黏合剂添加量（1%、2%、3%）、润滑剂添加量（1.5%、2.0%、2.5%）、竹荪菌托多糖添加量（1%、2%、3%）为影响因素，依据Box-Behnken中心组合试验原理设计四因素三水平响应面试验得出最佳原辅料比例。
1.3.7 竹荪菌托多糖泡腾片的质量评价
通过感官评价、发泡量、发泡时间、片重差异和崩解后溶液pH 值的测定，对制备的竹荪菌托多糖泡腾片进行质量评价。
1.4 数据分析处理
采用SigmaPlot 12.5 作图，数据以平均值±标准差表示，Design Expert 11.0 进行响应面优化。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声功率对多糖提取率的影响
超声功率对多糖提取率的影响见图1。
图1 超声功率对多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides
由图1 可知，超声功率为280～400 W 时，多糖提取率随超声功率的增加而增加。超声功率达到400 W时，多糖提取率最高，为10.28%。超声功率超过400 W后，提取率降低。推测可能是由于超声功率过高，破坏了多糖的分子结构。因此，选择超声功率360、400、440 W 进行后续试验。
2.1.2 超声时间对多糖提取率的影响
超声时间对多糖提取率的影响见图2。
图2 超声时间对红托竹荪多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides
由图2 可知，随着超声时间的延长，多糖的提取率先升高后降低。超声时间为50 min 时，多糖提取率最高，为10.96%。继续延长超声时间，提取率呈降低趋势。超声时间较短时，产生的空化效应和机械效应无法使多糖充分溶出，因此在一定时间内，随着超声时间的延长，多糖提取率呈上升趋势。但过长的超声时间会破坏多糖分子结构，大分子多糖可发生降解。因此提取多糖时要合理控制超声时间，既要避免短时间提取不充分，又要防止长时间破坏多糖结构。超声40 min 和50 min 提取率差值较小，因此，选择超声时间30、45、60 min 进行后续试验。
2.1.3 料液比对多糖提取率的影响
料液比对多糖提取率的影响见图3。
图3 料液比对红托竹荪多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides
由图3 可知，随着提取溶液体积的增加，多糖提取率呈现上升趋势。当料液比为1∶40（g/mL）时，提取率为最大值13.31%。多糖的溶出主要依赖于细胞膜内外浓度差，合适的浓度差有利于多糖的扩散。料液比较小时，溶液黏度大、扩散系数小，不利于提取；料液比过大，浓度差变小，但过多的提取液会造成试剂的浪费和旋转蒸发浓缩难度的增大。因此，选择料液比1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）进行后续试验。
2.1.4 超声温度对多糖提取率的影响
超声温度对多糖提取率的影响见图4。
图4 超声温度对红托竹荪多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polysaccharides
由图4 可知，随着超声温度的升高，多糖提取率先上升后下降。当超声温度达到55 ℃时，多糖提取率最高，为9.72%；超声温度超过55 ℃后，多糖的提取率下降；当超声温度达到75 ℃时，多糖提取率降至8.32%。可能原因为过高的温度破坏了多糖的内部结构，使多糖发生降解。相比于热水浸提法，超声辅助提取法能将提取温度降低20 ℃左右，节约能耗。由于55 ℃和65 ℃提取率差距较小，因此，选择超声温度45、60、75 ℃进行后续试验。
2.2 响应面优化试验结果
2.2.1 回归方程及方差分析
响应面试验设计及结果见表2。采用响应面软件Design Expert 11.0 对表2 试验数据进行多元回归拟合，得到的分析结果见表3。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface methodology
试验号ABCD提取率/%1010113.17 21 31 4-1 50 60 7-1 80 9000-19.49 00113.17 0-1012.23 00013.74-10111.03 10011.54 11013.12 01113.32 10-100-19.47 1110-1012.96 120-11011.72 13000013.90 1400-1-19.95 15-100112.63 16101013.20 17-101012.53 18000013.68 190-1-1010.91 20010-18.27 2101-1012.74 22000014.07 230-10-18.97 24-1-10011.13 25001-110.31 26000013.64 27110013.03 281-10011.16 2900-1113.44
表3 响应面模型方差分析
Table 3 Analysis of variance table of the regression model
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
项目平方和 自由度 均方F 值P 值 显著性模型74.71145.3478.12 ＜0.000 1**A 超声功率1.0111.0114.77 0.001 8**B 超声时间4.0314.0358.93 ＜0.000 1**C 料液比 0.323 410.323 44.730.047 2*D 超声温度 34.34134.34 502.73 ＜0.000 1**AB0.532 910.532 97.800.014 4*AC0.000 910.000 9 0.013 2 0.910 2 AD0.067 610.067 6 0.989 6 0.336 7 BC0.046 210.046 2 0.676 7 0.424 5 BD2.0212.0229.52 ＜0.000 1**CD0.057 610.057 6 0.843 2 0.374 0 A23.4713.4750.73 ＜0.000 1**B213.63113.63 199.56 ＜0.000 1**C20.388 310.388 35.680.031 8*D223.32123.32 341.33 ＜0.000 1**残差0.956 3140.068 3失拟项0.830 0100.083 02.630.182 3净误差0.126 340.031 6总误差75.6728
多元二次拟合方程为Y=13.81+0.29A+0.58B+0.16C+1.69D+0.37AB-0.02AC+0.13AD-0.11BC+0.71BD-0.12CD-0.73A2-1.45B2-0.24C2-1.90D2。回归模型P＜0.001，该模型极显著，失拟项P=0.182 3＞0.05，失拟项不显著，由此可判断该模型方程能够对超声辅助提取红托竹荪菌托多糖的提取率进行可靠预测。本试验模型确定系数R2=0.987 4，表明98.74%总变异可由模型解释，模型拟合度高，试验误差小。模型校正系数R2Adj=0.974 7，表示97.47%的响应值变化可由模型进行解释。模型预测系数R2pre=0.934 2，表明该响应面模型可预测93.42%的响应值。一次项超声功率（A）、超声时间（B）与超声温度（D）影响极显著（P＜0.01），料液比（C）影响显著（P＜0.05），BD、A2、B2、D2 极显著（P＜0.01），AB、C2 显著（P＜0.05），其余项均不显著。由显著性及F 值可知，对响应值多糖提取率（Y）影响程度的大小依次为超声温度（D）＞超声时间（B）＞超声功率（A）＞料液比（C）。
2.2.2 响应面交互作用分析
响应面和等高线都可显示试验因素之间相互作用，响应面最高点即最佳提取工艺参数。响应面倾斜度越高，即坡度越陡峭，表明因素间两两交互作用越显著[18-19]。响应面交互作用分析见图5。
图5 各因素交互作用的响应面
Fig.5 Response surface results of the interaction of various factors
由图5 可知，AC、BC、CD、AD 间交互作用微小（P>0.05）；AB 的响应曲面倾斜度较高，二者的交互作用对响应值（多糖提取率）的影响显著（P＜0.05），BD 响应曲面坡度陡峭，说明二者的交互作用明显强于其它交互项（P＜0.01）。
2.2.3 验证性试验
依据模型预测，竹荪菌托多糖的最佳提取工艺参数为超声功率419.312 W、超声时间50.978 min、料液比1∶48.284（g/mL）、超声温度60.117 ℃。此时回归模型的预测提取率达到14.18%。结合实际试验操作，将上述工艺参数值修改为超声功率400 W、超声时间51 min、料液比1∶48（g/mL）、超声温度60 ℃。平行试验3 次，多糖提取率为13.86%，与预测值接近。因此，响应面法优化红托竹荪菌托多糖提取工艺参数，经过平行验证性试验，证明该试验得出最优提取工艺具有可靠性，具备一定参考价值。
2.3 竹荪菌托多糖泡腾片的最佳制备工艺
红托竹荪菌托中的多糖经过去蛋白、脱色、透析后作为原料，利用酸碱分开制粒混合压片法制备泡腾片。得出最佳配比组成为酸碱比（柠檬酸∶碳酸氢钠）1.5∶1、泡腾崩解剂总量45%、黏合剂（3% PVP 水溶液）添加量2%、润滑剂（PEG 6000）添加量2%、竹荪菌托多糖添加量2%、甜味剂（阿斯巴甜）添加量1%。
2.4 竹荪菌托多糖泡腾片的质量评价结果
以最优原辅料配比工艺制备的竹荪菌托多糖泡腾片表面光滑、色泽均匀、无松片裂片现象，带有竹荪的特殊香气，泡腾片的平均质量为（2.96±0.04）g，质量差异小于1%。各片均可在3 min 内崩解完毕，且发泡体积大于6 mL，各项指标均符合《中国药典》（2020 版）的规定[20]。竹荪菌托多糖泡腾片溶于100 mL 水后溶液的pH 值在4.58～4.76，能适应人们的口味需求[21]。
3 讨论与结论
目前，关于竹荪菌托多糖的提取工艺的研究较多，但主要是围绕传统的水提醇沉法展开，通常进行料液比、提取时间和提取温度等因素的优化。对采用超声波辅助提取红托竹荪菌托多糖的相关研究较少。本研究确定超声波辅助提取红托竹荪菌托多糖工艺参数为超声功率400 W、超声时间51 min、料液比1∶48（g/mL）、超声温度60 ℃，此条件下的多糖提取率为13.86%。与传统提取方法相比，本试验在缩短提取时间的同时提高了提取率。菌托作为红托竹荪加工过程中的废弃物，多糖成分含量较高。泡腾片使用方便，生物利用度高，是功能食品剂型的优良选择，竹荪菌托多糖具有降血脂、降血糖和抗衰老等功效。将多糖提取后制成泡腾片可以更好地发挥其药理作用。试验通过单因素及响应面试验确定了竹荪菌托多糖泡腾片的最佳配比组成：酸碱比（柠檬酸∶碳酸氢钠）1.5∶1、泡腾崩解剂总量45%、黏合剂（3%PVP 水溶液）添加量2%、润滑剂（PEG 6000）添加量2%、竹荪菌托多糖添加量2%、甜味剂（阿斯巴甜）1%。其外观、片重差异、pH 值、发泡量等均符合《中国药典》（2020版）的质量要求。本研究制备了竹荪菌托多糖泡腾片，资源再利用的同时丰富了竹荪产品的多样性，具有广阔的市场前景。
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