竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC.）与花椒同为芸香科，是花椒亚属植物，其叶狭长，枝叶垂散形似藤蔓，又得名藤椒[1-2]，其麻香独特，同时具有温中止痛、杀虫止痒的功效，可用于食品和医药行业[3-5]。竹叶花椒中含有酰胺、生物碱、木质素、挥发油、黄酮等多种活性物质[6-7]，其中竹叶花椒挥发油不仅为竹叶花椒提供了独特风味，还具有抗炎镇痛、抑菌杀虫、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[8-12]。开展竹叶花椒果皮中挥发油提取方法的研究以提高挥发油提取率，对开发竹叶花椒食用价值、提升竹叶花椒经济效益具有实际意义。
挥发油的提取方法有水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、微波辅助提取法等[13-14]，其中水蒸气蒸馏法加热温度高，易分解挥发油中的热不稳定性成分且提取效率低[15]；溶剂提取法会导致挥发油中有溶剂残留，且造成环境污染[16]；微波辅助提取法可能导致挥发油成分发生变化[17]。超临界CO2 萃取作为一种绿色、无毒害、效率较高的提取方法，能有效解决传统方法的不足，获得较高质量的挥发油[18-19]。
目前关于超临界CO2萃取竹叶花椒挥发油的报道较少，本文采用单因素试验和响应面试验研究萃取时间、压力、温度等因素对挥发油提取率的影响，以确定超临界CO2萃取竹叶花椒挥发油最佳提取工艺条件，以期为后续研究开发竹叶花椒挥发油提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干燥的竹叶花椒果皮（产自四川省眉山市洪雅县）：幺麻子食品股份有限公司；CO2 气体（纯度99.99%，食品级）：绵阳市昌俊气体有限公司。
1.2 仪器与设备
HA120-50-05 型超临界萃取装置：南通市华安超临界萃取有限公司；皇代200T 型粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；BSA124S 电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 材料预处理
选取成熟开裂无籽的竹叶花椒干燥果皮，用粉碎机将其粉碎，过20 目筛，将竹叶花椒果皮粉末装入密封袋中，放入4～6 ℃冰箱保鲜室备用。
1.3.2 工艺流程
称取50 g 竹叶花椒果皮粉末装入料筒后放入萃取釜，安装密封圈，上紧堵头，保证气密性；开制冷机组电源，开加热系统，设置温度，对萃取釜、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ进行预热；温度稳定后，打开CO2 气瓶送气，通过高压泵对萃取釜进行加压；调节阀门使压力达到预定萃取压力后，调节流量20 L/h，开始循环萃取；达到预定萃取时间，从分离釜Ⅰ下方阀门接取挥发油，进行称量，计算提取率。挥发油提取率按下式计算。
式中：Y 为挥发油提取率，%；M1 为挥发油质量，g；M2 为竹叶花椒果皮质量，g。
1.3.3 单因素试验
分别探究萃取时间（20、40、60、80、100 min）、萃取压力（10、15、20、25、30 MPa）、萃取温度（35、40、45、50、55 ℃）、分离釜Ⅰ压力（4、6、8、10 MPa）、分离釜Ⅰ温度（30、35、40、45、50 ℃）对竹叶花椒挥发油提取率的影响。
1.3.4 响应面优化试验
以萃取时间A、萃取温度B、萃取压力C 为自变量，以竹叶花椒挥发油提取率Y 为响应指标，采用Design-Expert 8.0.6 中的Box-Behnken 响应面法设计三因素三水平响应面优化试验。各因素水平见表1。
表1 响应面试验因素和水平编码
Table 1 Response surface test factors and level coding
水平-1因素A 萃取时间/minB 萃取温度/℃C 萃取压力/MPa 404520 0 605025 1 805530
1.4 数据处理
采用Design-Expert 8.0.6 软件，通过Box-Behnken中心组合试验设计，对试验数据进行回归分析并得到最佳提取工艺参数，图表采用Origin 2018 绘制。每组试验重复3 次。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 萃取时间对提取率的影响
设定萃取压力25 MPa、萃取温度50 ℃、分离釜Ⅰ压力6 MPa、分离釜Ⅰ温度45 ℃，研究萃取时间对竹叶花椒挥发油提取率的影响，结果如图1所示。
图1 萃取时间对提取率的影响
Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate
理论上，在超临界CO2 萃取过程中，萃取时间越长，提取率越大，直到达到最大值，而在实际生产操作中，需要平衡提取率与能源消耗，以得到最大的收益。由图1 可知，提取率随着萃取时间的延长而增加，60 min后提取率较高，且随时间的继续延长变化不大，并且由于萃取时间过长，能源消耗高，收益低，从试验结果以及经济角度出发，选择萃取时间40、60、80 min 进行响应面优化试验。
2.1.2 萃取温度对提取率的影响
设定萃取压力25 MPa、萃取时间60 min、分离釜Ⅰ压力6 MPa、分离釜Ⅰ温度45 ℃，研究萃取温度对竹叶花椒挥发油提取率的影响，结果如图2所示。
图2 萃取温度对提取率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate
温度升高会使分子运动加快，一方面，会降低超临界CO2 流体的密度，使其溶解能力下降；另一方面，会使溶质的挥发性增强，同时加快传质过程，有利于萃取。由图2 可知，萃取温度在35～50 ℃时，竹叶花椒挥发油的提取率随温度的升高呈上升趋势。说明在当前压力下，35～50 ℃温度条件下进行萃取时，萃取温度对溶解度的影响较低，而对传质能力的影响在萃取过程中占主导地位，挥发油提取率上升。50～55 ℃时，萃取温度对溶解度的影响较大，增加的传质能力不能抵消掉这部分影响，从而导致挥发油提取率降低。因此，选择萃取温度45、50、55 ℃进行响应面优化试验。
2.1.3 萃取压力对提取率的影响
设定萃取温度50 ℃、萃取时间60 min、分离釜Ⅰ压力6 MPa、分离釜Ⅰ温度45 ℃，研究萃取压力对竹叶花椒挥发油提取率的影响，结果如图3所示。
图3 萃取压力对提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction pressure on extraction rate
由图3 可知，萃取压力小于25 MPa 时，由于CO2流体密度随压力增加而增大，挥发油在其中的溶解度增加，有利于萃取。萃取压力超过25 MPa 后，溶解性增加减缓，设备的稳定性下降，导致提取率略有下降。考虑到压力过大对设备造成的负担，结合安全性和经济性原则，因此选择萃取压力20、25、30 MPa 进行响应面优化试验。
2.1.4 分离釜Ⅰ压力对提取率的影响
设定萃取压力25 MPa、萃取温度50 ℃、萃取时间60 min、分离釜Ⅰ温度45 ℃，研究分离釜Ⅰ压力对竹叶花椒挥发油提取率的影响，结果如图4所示。
图4 分离釜Ⅰ压力对提取率的影响
Fig.4 Effect of pressure of separation tank I on extraction rate
临界压力附近微小的压力变化会使得超临界流体的密度发生较大改变，直接影响到超临界CO2 的溶解能力[20]。由图4 可知，当分离釜Ⅰ压力为4 MPa 时，提取率最高，但此时得到的挥发油中含有少量水分；6 MPa 时，提取率略微下降，但挥发油中的水分被除去；分离釜Ⅰ压力在8～10 MPa 时，挥发油提取率大幅度降低。综合分析，分离釜Ⅰ压力为6 MPa 时，分离效果最好，提取率较高，为最适分离釜Ⅰ压力。
2.1.5 分离釜Ⅰ温度对提取率的影响
设定萃取压力25 MPa、萃取温度50 ℃、萃取时间60 min、分离釜Ⅰ压力6 MPa，研究分离釜Ⅰ温度对竹叶花椒挥发油提取率的影响，结果如图5所示。
图5 分离釜Ⅰ温度对提取率的影响
Fig.5 Effect of temperature of separation tank I on extraction rate
由图5 可知，随着温度升高，CO2 流体密度降低，溶解度下降，有利于挥发油和CO2 流体的分离，挥发油的提取率随之上升。当温度达到40 ℃时，提取率达到最大值，但此条件下得到的挥发油中含有少量水分，油水分离不彻底。温度高于40 ℃后，水分被分离出去，且随着温度升高，易挥发性组分丢失，提取率随之降低。综合考虑，选择45 ℃作为最适分离釜Ⅰ温度。
2.2 响应面试验结果
按表1 进行响应面优化试验，响应面试验设计及结果见表2，对表2 中的数据进行回归方程的方差分析，结果见表3。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface experimental design and results
试验号A 萃取时间/min B 萃取温度/℃C 萃取压力/MPa Y 提取率/%60502513.90 2 60502514.08 3 40552511.46 4 80452513.92 5 60552012.12 6 60452011.94 7 80502014.12 8 80503014.24 9 40502011.12 1080552514.28 1160453012.66 1260502513.86 1360553012.96 1460502513.88 1540452510.98 1660502513.76 1740503012.08 1
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
注：p＜0.05 表示影响显著；p＜0.01 表示影响极显著。
方差来源 平方和自由度均方差F 值p 值模型22.0492.45119.12＜0.000 1 A14.91114.91724.99＜0.000 1 B0.2210.2210.590.014 0 C0.8710.8742.370.000 3 AB3.6×10-313.6×10-30.180.688 2 AC0.1810.188.580.022 1 BC3.6×10-313.6×10-30.180.688 2 A20.6210.6230.040.000 9 B23.0613.06149.01＜0.000 1 C21.6311.6379.49＜0.000 1残差0.1470.021失拟项0.09030.0302.230.227 6纯误差0.05440.013总误差22.1916
回归方程为Y=13.90+1.37A+0.17B+0.33C-0.03AB-0.21AC+0.03BC-0.38A2-0.85B2-0.62C2。由表3 可知，模型的p＜0.000 1，表示模型极显著，拟合程度高；失拟项p=0.227 6＞0.05，不显著，说明干扰项对试验的影响可以忽略；信噪比为30.826，远大于4，表明信号充足；预决定系数RPred2（0.931 3）与校准决定系数RAdj2（0.985 2）合理一致，差异较小，说明该模型可用于模拟预测。F 值越大说明因素对提取率的影响越大，由表3 中F 值可知，影响竹叶花椒挥发油提取率的因素依次为萃取时间（A）＞萃取压力（C）＞萃取温度（B）。通过p 值大小可知，因素A、B、C、AC、A2、B2、C2 对挥发油提取率均有显著影响（p＜0.05），AB、BC 两项影响不显著。
用Design-Expert 8.0.6 软件根据回归方程绘制AB、AC、BC 的响应曲面分析图，结果见图6～图8。
图6 萃取时间与萃取温度的交互作用
Fig.6 Effect of the interaction between extraction time and extraction temperature on extraction rate
由图6 可知，等高线趋于圆形，说明萃取时间与萃取温度的交互作用不显著，与方差分析结果一致。等高线随时间变化颜色加深，说明萃取时间对提取率的影响更大，响应曲面表现为坡度更陡。
由图7 可知，萃取时间与萃取压力的交互作用显著，表现为提取率在较高压和较低压时随时间变化的曲线有较大区别，响应曲面曲折，等高线变化趋于椭圆形。图中萃取时间对应的响应面曲线坡度更陡，等高线更密集，颜色逐渐加深，说明萃取时间对提取率影响更大。
图7 萃取时间与萃取压力的交互作用
Fig.7 Effect of the interaction between extraction time and extraction pressure on extraction rate
由图8 可知，响应曲面平缓，等高线趋于圆形，萃取压力与萃取温度交互作用不显著。
图8 萃取温度与萃取压力的交互作用
Fig.8 Effect of the interaction between extraction temperature and extraction pressure on extraction rate
通过软件Design-Expert 8.0.6 求解回归方程，得到最佳工艺条件：萃取时间80 min，萃取温度50.405 ℃，萃取压力25.486 MPa，此时超临界CO2萃取竹叶花椒挥发油的理论提取率可达14.889%。根据实际情况进行调整，确定萃取时间80 min，萃取温度50.5 ℃，萃取压力25.5 MPa。在此条件下进行3 次验证试验，结果见表4。
表4 验证试验结果
Table 4 Results of repeated experiments for validation
序号1提取率/%相对误差/%14.234.43 2 14.343.69 3 14.184.76
由表4 可知，3 组重复试验得到挥发油提取率与预测值的相对误差均在5%的合理范围内，说明响应面优化试验的设计结果是合理的。
3 结论
超临界CO2 萃取时间短，萃取效率高，较低的萃取温度不会破坏生物活性成分，CO2 还能保护活性成分，避免其在萃取过程中被氧化。同时，该技术集萃取与分离于一体，操作简单，无溶剂污染，能很好地应用于竹叶花椒挥发油的萃取。本研究通过单因素试验结合响应面法优化超临界CO2萃取竹叶花椒挥发油工艺。结果显示，模型差异极显著，可用于模拟预测，3 个因素对挥发油的影响次序为萃取时间>萃取压力>萃取温度，且都对提取率有显著影响。求解回归方程并根据实际情况调整得到最佳工艺条件为萃取时间80 min、萃取温度50.5 ℃、萃取压力25.5 MPa、分离釜Ⅰ压力6 MPa、分离釜Ⅰ温度45 ℃，在此条件下竹叶花椒挥发油平均提取率为14.25%，结果符合模型预测。
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