我国的豌豆资源较为丰富，全国20 多个省份均有种植。豌豆分离蛋白（pea protein isolate，PPI）中氨基酸比例较为均衡，含有8 种人体必需氨基酸，生物价高，具有低致敏性，安全性比大豆蛋白更高[1]。PPI 具有良好的乳化性、分散性、保油和保水能力[2]，在食品加工与生产中有着广泛的应用。
黑咖啡具有抗衰老[3]、预防糖尿病[4]、降低呼吸道疾病发病率[5]等优点，但其苦涩的口感令很多人望而却步。咖啡伴侣的加入，使黑咖啡饮用起来口感更加细腻。咖啡伴侣配方中常见的植脂末，其主要成分氢化植物油是一种通过人工催化加氢而形成的半固态油脂，植物油在氢化过程中产生的反式脂肪酸会造成动脉粥样硬化、血栓以及冠心病[6]等心血管疾病。随着人们对健康意识的提高，人们对含有氢化植物油的产品产生了排斥心理。世界卫生组织已计划，逐步消除全球食品工业中的反式脂肪[7]。
微粒化技术是指利用物理剪切力，使蛋白质粒径达到10 μm 以下，此粒径小于人体口腔黏膜感知的阈值，可以达到模拟脂肪细腻丝滑的效果[8-9]。微粒化蛋白的方法主要有双乳化法、相分离法以及机械处理法[10]，其中机械处理法中最常见的方法是高压高剪切力和热处理。目前，已经有研究证明蛋白质可以较好地全部或部分替代食品中的脂肪，提高食品营养的同时并且不改变食品本身的口感。吴达雄等[11]利用高压均质技术对乳清蛋白进行微粒化处理，制备出具有细腻顺滑口感的新型双蛋白杏仁乳饮料。刘雨阳[12]用微粒化处理的小麦蛋白替代冰淇凌中的部分脂肪，降低冰淇淋硬度的同时，不改变其理化性质和口感。
本研究以PPI 为主要原料，通过湿热处理、高速剪切技术对PPI 进行微粒化处理，优化多糖、添加剂（三聚磷酸钠、磷酸三钙）添加量后，利用喷雾干燥技术开发出一种不含有氢化植物油、感官与市售咖啡伴侣接近的咖啡伴侣。随着大众的食品安全意识逐渐提高，健康成为消费者的最高追求。通过不断优化产品的工艺和配方，低脂食品将会逐渐替代或部分替代油脂成为市场的主流，从而使人们饮食更加健康。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豌豆分离蛋白粉（蛋白质质量分数为85%）：烟台优承生物科技有限公司；瓜尔豆胶、无水柠檬酸：食之味食品有限公司；磷酸三钙：连云港科德食品有限公司；三聚磷酸钠：江苏泰莱豪蓓特食品有限公司；黑咖啡、三合一咖啡、咖啡伴侣：东莞雀巢有限公司，以上试剂均为食品级。
1.2 仪器与设备
EMS-30S 磁力搅拌水浴锅：常州市人和仪器厂；PHS-25 型pH 计：上海雷磁科学仪器有限公司；NDJ-5S 旋转式黏度计：上海昌吉地质仪器有限公司；CS-800分光测色计：广州卓谐仪器设备有限公司；DNP-9082离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；T6 分光光度计、TU-1900 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Nano-Brook 90Plus 激光粒度仪：美国布鲁克海文仪器公司；T18 高速分散均质机：艾卡广州仪器设备有限公司；YC-1800 喷雾干燥机：上海雅程仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 豌豆分离蛋白凝胶的制备
将豌豆分离蛋白粉溶于去离子水，配制15%（质量分数）豌豆蛋白分散液。25 ℃下搅拌2 h 使其充分水合，得到豌豆分离蛋白分散液。用无水柠檬酸将豌豆分离蛋白分散液的pH 值调至7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0。将9 个样品放于90 ℃水浴锅中加热30 min，取出立刻冷却至室温，放入冰箱陈化过夜。
1.3.2 豌豆分离蛋白凝胶pH 值的筛选
1.3.2.1 粒径的测定
不同pH 值的豌豆分离蛋白凝胶分别用分散均质机8 000 r/min 进行均质3 min，分别用去离子水稀释125 倍，用粒度仪测定其粒径。
1.3.2.2 电势的测定
在pH3～8 时，以pH 值每升高0.5 为单位，用粒度仪测定0.5%豌豆分离蛋白凝胶电势，测定温度为25 ℃。
1.3.2.3 黏度的测定
按步骤1.3.1 制备pH4.0、4.5、5.0、5.5 的豌豆分离蛋白凝胶，均质后取分散液于离心管中，用旋转式黏度计2 号转子60 r/min 测定其黏度大小。
1.3.3 pH 值的测定
采用pH 计测定不同咖啡样品的pH 值。
1.3.4 复配瓜尔豆胶添加量的确定
选择1%的瓜尔豆胶溶液作为试验基点[13]。烧杯中量取100 mL 去离子水后置于46 ℃水浴锅中，称取1.0 g 瓜尔豆胶边搅拌边缓慢加入，搅拌40 min 至瓜尔豆胶全部溶解，溶液变为透明胶状，得到1%的瓜尔豆胶。取pH 值为5.5 均质后的蛋白分散液14.8、25.0、20.0、15.0、10.0 g，分别加入0、2.8、8.5、15.0、23.3 g 的1%的瓜尔豆胶。使得瓜尔豆胶在整个蛋白-多糖体系中的浓度依次为0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%，于25 ℃水浴锅中700 r/min 磁力搅拌30 min。
1.3.5 确定制备后豌豆分离蛋白凝胶的最佳pH 值
按步骤1.3.4 制备1%的瓜尔豆胶，分别取pH4.0、4.5、5.0、5.5 值均质后的蛋白分散液加入5.6 g 的瓜尔豆胶，使得瓜尔豆胶在整个体系中的浓度为0.1%，在25 ℃水浴锅中700 r/min 磁力搅拌30 min。
1.3.5.1 粒径的测定
测定制备后分散液初始粒径，静置4 d 后粒径以及静置4 d 后沸水冲调后粒径。测定方法同1.3.2.1。
1.3.5.2 黏度的测定
取复配多糖后的蛋白分散液30 mL 于离心管中，用旋转式黏度计2 号转子在60 r/min 下测定黏度值。
1.3.6 稳定剂添加量的确定
由于蛋白类饮品沉淀现象比较严重，大多数蛋白类饮料都会添加磷酸盐来稳定饮料[14]。本试验选择三聚磷酸钠作为稳定剂。按步骤1.3.1 制备pH 值为5.5的豌豆分离蛋白凝胶并进行均质。添加1%的瓜尔豆胶2.2 g 于17.8 g 的豌豆分离蛋白分散液中，25 ℃水浴锅中700 r/min 磁力搅拌30 min。以凝胶中蛋白的质量为基础分别添加三聚磷酸钠0、0.003、0.006、0.009、0.012、0.015 g，使得三聚磷酸钠添加量为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。在25 ℃水浴锅中，700 r/min磁力搅拌30 min。
取未添加三聚磷酸钠的空白样品稀释125 倍进行300～800 nm 全波长扫描，找出最大吸收峰。5 个梯度各取0.13 g 样品添加60 mL 去离子水稀释425 倍，取30 mL 样品于离心管中1 500 r/min 离心10 min，将剩余30 mL 样品静置10 min，400 nm 下测其两部分吸光度，其比值为稳定系数R[15]。
1.3.7 喷雾干燥
按步骤1.3.4 制备蛋白-多糖分散液，将豌豆分离蛋白稀释至1%，防止堵塞喷雾干燥机的喷雾头。喷雾干燥参数设定为进风温度160 ℃；出风温度103.6 ℃；风机设定30；通针设定8；蠕动速度16 r/min。
1.3.8 最佳冲调量的确定
0.36 g 市售黑咖啡和0.80 g 市售咖啡伴侣溶于30 mL 的70 ℃热水中，冷却后测定其色度，并以其色度为参考，确定最接近参考色度的豌豆分离蛋白-瓜尔豆胶粉末的冲调量。设置豌豆分离蛋白-瓜尔豆胶粉末在冲调体系中的浓度梯度为2.6%、3.2%、3.8%、4.4%、5.0%，分别用色差计测定其色度。
1.3.9 溶解度的测定
参考文献[16]的方法确定磷酸三钙添加量为0.05%，磷酸三钙添加量与豌豆分离蛋白添加量比为1.1∶100。取步骤1.3.6 中105.00 g 蛋白-多糖分散液加入0.17 g 磷酸三钙，加入0.02 g 的三聚磷酸钠，置于25 ℃水浴锅中700 r/min 转速下磁力搅拌1 h 进行充分混合，加入去离子水将豌豆分离蛋白稀释至1%，喷雾干燥得到混合粉末，即制得零脂咖啡伴侣。分别取0.40 g市售咖啡伴侣和零脂咖啡伴侣，两者都加入0.18 g 黑咖啡再分别溶于15 mL 沸水中，用玻璃棒匀速搅拌，记录两者溶解完全的时间。
1.3.10 感官评定
零脂咖啡伴侣产品按最佳冲调量进行冲调；市售咖啡伴侣按照0.18 g 黑咖啡，0.40 g 咖啡伴侣，15 mL沸水进行冲调。二者进行比较，感官评价评分标准[16]如表1所示。
表1 感官评价评分标准
Table 1 Sensory evaluation scoring table
项目感官评价标准评分外观（25）乳白色＞16～25浅黄色＞8～16色泽灰暗，不光亮1～8风味（25）香味很浓，无酸涩感＞16～25香味较淡，有轻微酸涩感＞8～16有异味，酸涩感很重1～8口感（25）口感细腻，润滑厚实，无粗糙感＞16～25稍有粗糙，稀薄感，＞8～16酸味重，明显粗糙感，很稀1～8质地（25）均匀丝滑＞16～25有颗粒感＞8～16有絮状，有水析出1～8
1.4 统计分析
每组试验做3 次平行，采用SPSS 22 统计软件对数据进行显著性分析（P＜0.05），利用Origin 2021 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 pH 值对豌豆分离蛋白形成凝胶的影响
不同pH 值下制备豌豆分离蛋白凝胶颗粒的粒径和电势的结果分别见图1 和图2。
图1 pH 值对豌豆分离蛋白微凝胶粒径影响
Fig.1 Effects of pH values on microgel size of PPI
图2 豌豆分离蛋白电势图
Fig.2 Diagram of potential determination of PPI
从图1 中可以看出，在pH3～7 时，剪切后的豌豆分离蛋白微凝胶颗粒的粒径最大值为5.92 μm，该pH值范围内的粒径都满足0.1～10 μm 的要求，表明此pH值范围内颗粒口感都比较细腻[8]。由图2 可以看出，豌豆分离蛋白的等电点在3 左右。在等电点附近，蛋白质的表面电荷基本为0，分子之间相互碰撞容易发生聚集，蛋白的溶解性较差[17]。当pH 值远小于等电点时，分子之间会产生纤维网状结构的聚合物，当pH 值远大于等电点时，分子之间会产生无序形状的聚合物[18]。
经测定，市售黑咖啡的pH 值为5，市售三合一咖啡的pH 值为6.45。所以市售黑咖啡冲调后溶液呈酸性，市售三合一咖啡冲调后溶液也呈酸性，其pH 值较黑咖啡溶液略有升高，说明添加植脂末后，咖啡的pH值升高。为最大程度保持咖啡的品质，制备咖啡伴侣时pH 值也应在酸性范围内，且以稍高于5 为宜。因此，本试验选择pH 值4.0、4.5、5.0、5.5 制备豌豆分离蛋白凝胶进行接下来的研究。
2.2 pH 值对豌豆分离蛋白凝胶体系的影响
图3 为豌豆分离蛋白凝胶均质后黏度随pH 值的变化。
图3 pH 值对豌豆分离蛋白微凝胶黏度的影响
Fig.3 Effects of pH values on viscosity of PPI
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，均质后的豌豆分离蛋白分散液黏度基本随着pH 值的增加整体呈上升趋势，在pH5.5 时黏度最大，最大黏度为217 mPa·s，且该黏度的分散液感官上仍呈流动状态。pH 值为5.5 时，黏度最大，其原因可能是在此pH 值下豌豆分离蛋白分散液的粒径最小，颗粒之间位置相对紧凑，该pH 值远离豌豆分离蛋白的等电点，蛋白质液滴之间的静电斥力增强，粒径变小，溶解度增强[19]，水合性增强，使分散液的黏度增加。
2.3 复配不同浓度瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶粒径的影响
相同pH 值复配不同浓度瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶颗粒的粒径如图4所示。
图4 不同浓度瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶粒径的影响
Fig.4 Effect of guar gum concentration on microgel size of PPI
不同小写字母表示与初始值相比差异显著（P＜0.05）。
将复配多糖后的豌豆分离蛋白分散液进行静置处理和100 ℃热水冲调处理，通过比较三者的粒径，可以选择出具有最佳的热稳定性和静置稳定性的试验组。由图4 整体来看，除浓度为0.7%外，每组放置4 d后和放置4 d 沸水冲调后颗粒粒径都较初始值大，但增大的幅度不同，热稳定性差的分散液，沸水冲调时蛋白颗粒发生聚集的程度也较大。比较放置4 d 后和放置4 d 沸水冲调后的粒径，发现当多糖添加量占整个体系浓度为0.1%和0.3%时，这两种条件下的粒径变化没有显著性差异，表明按两者浓度添加时，分散液的热稳定性较好。在放置过程中，静置稳定性差的分散液，蛋白质颗粒会发生聚集[20]导致颗粒的粒径增大。比较刚复配完初始值和放置4 d 后的粒径，发现都有显著性差异但差异较小的为0.1%、0.5%、0.7%添加浓度。综上所述，为节省原料，选择0.1%作为试验接下来多糖在蛋白分散液的添加量。
2.4 不同pH 值复配相同浓度瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶粒径的影响
图5 为不同pH 值复配相同浓度的瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶颗粒粒径的影响。
图5 不同pH 值复配相同浓度瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶粒径的影响
Fig.5 Effects of different pH values and the same concentration of guar gum on particle size of PPI
不同小写字母表示与初始值相比差异显著（P＜0.05）。
由图5 可知，对比复配后豌豆分离蛋白分散液的加热稳定性和静置稳定性，以及初始值和沸水冲调后的颗粒粒径可以看出，当pH 值为4.0 时，初始值粒径和沸水冲调后的粒径无显著差异，热稳定性较好，其次，在有显著性差异情况下，热稳定性从高到低依次是pH5.5、5.0、4.5。通过比较初始值和放置4 d 后的颗粒粒径发现pH 值为4.5 和pH 值为5.5 时，初始值颗粒粒径和放置4 d 后颗粒粒径没有显著性差异，表明静置稳定性较好。由于pH 值为4.5 的豌豆分离蛋白分散液的热稳定较pH 值为5.5 时差，所以选择pH 值为4.0 和5.5。
2.5 不同pH 值复配相同浓度瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶黏度影响
不同pH 值复配相同浓度瓜尔豆胶后，豌豆分离蛋白微凝胶颗粒的黏度如图6所示。
图6 不同pH 值复配相同浓度瓜尔豆胶对豌豆分离蛋白微凝胶黏度的影响
Fig.6 Effects of different pH values and the same concentration of guar gum on viscosity of PPI
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
瓜尔豆胶是中性多糖，在溶液中不带电荷，pH 值为4.0、4.5、5.0、5.5 时，豌豆分离蛋白带负电荷，带负电的蛋白颗粒会吸附不带电荷的瓜尔豆胶，适当的蛋白-多糖复合物搭配可以提高溶解性和稳定性[21]。由图6可知，与图3 相比，仅有pH 值为5.5 时分散液的黏度明显增大，表明pH 值为5.5 时，豌豆分离蛋白具有更好的吸附力。因此，选择制备豌豆分离蛋白-瓜尔豆胶复合物的最佳pH 值为5.5。
2.6 豌豆分离蛋白-瓜尔豆胶复合物最大吸收峰
采用双光束紫外可见分光光度计，对豌豆分离蛋白-瓜尔豆胶复合物进行全波长扫描，结果如图7所示。
图7 豌豆分离蛋白-瓜尔豆胶复合物全波长扫描
Fig.7 Full wavelength scan of the proteoglycan complex
由图7 可知，测得的豌豆分离蛋白-瓜尔豆胶复合物最大吸收波长为400 nm，在此波长下，吸光度变化不大，具有较高灵敏性，不会造成朗伯比尔定律的偏移，具有较高的准确度。
2.7 三聚磷酸钠不同添加量对体系吸光度的影响
当豌豆分离蛋白微凝胶颗粒分散体系中添加不同浓度三聚磷酸钠时，在400 nm 下离心和静置后的吸光度比值结果如图8所示。
图8 不同三聚磷酸钠添加量对体系稳定系数R 的影响
Fig.8 Effects of different sodium tripolyphosphate additions on stability coefficient R
稳定系数R 指的是离心后分散液的吸光度比静置后分散液的吸光度，R 值越接近1，表明体系内物质的沉淀变化比较小，体系越稳定[22]。由图8 可知，当三聚磷酸钠添加量为0.2%时，稳定系数R（A离心/A静置）最接近1，说明此时体系内物质的较为稳定。因此，选用0.2%作为三聚磷酸钠最佳添加量。
2.8 零脂咖啡伴侣冲调量对咖啡色度的影响
不同零脂咖啡伴侣冲调量对咖啡的色度影响如图9所示。
图9 冲调量对咖啡色度的影响
Fig.9 The influence of brewing quantity on coffee chroma
咖啡伴侣除了改善咖啡的酸涩口感还对咖啡有增白效果，好的色度可以使人的食欲增加。由图9 可知，从亮度L*可以看出，最接近市售伴侣搭配黑咖啡的零脂咖啡伴侣浓度为依次为4.4%、3.8%、5.0%；从红绿值a*可以看出，最接近市售伴侣搭配黑咖啡的零脂咖啡伴侣浓度依次为4.4%、3.8%、3.2%；从黄蓝值b*可以看出，最接近市售伴侣搭配黑咖啡的零脂咖啡伴侣浓度依次为4.4%、5.0%、3.8%。所以，最后选择浓度为4.4%的搭配，即冲调配方为2 g 咖啡，7 g 伴侣和150 mL 水。
2.9 溶解性以及感官评定结果
不同产品溶解性测定结果如表2所示。抽选感官评价人员，按感官评价表对两种咖啡伴侣分别搭配黑咖啡进行感官品尝打分，结果如图10所示。
图10 感官评价得分图
Fig.10 Sensory evaluation score chart
表2 产品溶解性测定
Table 2 Determination of solubility of products
种类溶解时间溶解现象市售咖啡伴侣+黑咖啡溶解比较快，几乎没有沉淀零脂咖啡伴侣+黑咖啡顺时针搅拌1 min 43 s 全溶顺时针搅拌3 min 40 s 全溶溶解较慢，有少量沉淀
由表2 可知，零脂咖啡伴侣搭配黑咖啡的溶解性与市售咖啡伴侣搭配黑咖啡相比还有较大差距，可能原因是本试验咖啡伴侣中未加蔗糖、甜味剂等助溶剂，导致咖啡伴侣在水中的分散性较差。由图10 可知，零脂咖啡伴侣搭配黑咖啡在外观上与市售咖啡伴侣搭配黑咖啡相当，其他各项得分都低于市售咖啡伴侣搭配黑咖啡的评分，但其对黑咖啡的风味、口感上有所改善。本试验说明零脂咖啡伴侣仍有较大的改进空间。
3 结论
本试验以豌豆分离蛋白和瓜尔豆胶为主要原料，制备零脂咖啡伴侣。通过对制备工艺进行优化得到豌豆分离蛋白处理的pH 值为5.5。零脂咖啡伴侣制备的最佳配方为100 g 豌豆分离蛋白粉、0.75 g 瓜尔豆胶、0.2 g 三聚磷酸钠、1.1 g 磷酸三钙。成品的最佳冲调量为2 g 黑咖啡和7 g 零脂咖啡伴侣溶于150 mL 水中。通过感官和色差测定，本产品与市售咖啡伴侣之间在色度上很接近，但在味道和溶解性上还存在一定的差异，今后可以再通过进一步优化添加剂的添加量和多糖的种类来改善零脂咖啡伴侣，使其更接近市售咖啡伴侣。本试验研究将有助于提高豌豆分离蛋白的附加值，促进其在低脂食品中的应用。
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