据世界卫生组织统计，全球约有20 亿人经常饮酒，其中超过7 500 万人被诊断出患有与酗酒相关的疾病，并面临发展为与酒精相关的肝病的风险[1]。酒精性肝损伤是酒精与肝脏细胞频繁接触而导致的一种肝损伤，主要由于酒精代谢产物会改变细胞色素P450s的酶活性、增加细胞内游离铁的水平以及降低谷胱甘肽、谷氨酸等抗氧化剂的水平，从而促进活性氧的产生，导致脂质过氧化和肝细胞损伤[2-5]。过量饮酒会导致酒精性肝损伤，继而引发一系列病理特征，包括从单纯性脂肪变性到急性酒精性肝炎、慢性纤维化、肝硬变以及肝细胞癌等[6]。
目前，对于酒精性肝损伤的改善途径，主要通过减轻酒精性肝损伤的严重程度、阻止肝纤维化、改善继发性营养不良和治疗酒精性肝硬化等[7]。主动戒酒是目前缓解酒精性肝损伤最有效的方法，但对大多数人来说比较困难。近年来，营养或功能食品干预逐渐成为缓解或预防酒精性肝损伤的新策略，营养功能食品越来越受到人们的关注。降低活性氧水平可减轻酒精引起的氧化应激，从而有助于抑制酒精性肝损伤[8]。Kirpich 等[9]最早使用益生菌治疗酒精性肝损伤患者，发现B.bifidum 和L.plantarum 8PA3 显著增加了人粪便中乳杆菌和双歧杆菌的数量，改变了血清中谷丙转氨酶、低密度脂蛋白和总胆红素水平。Zhou 等[10]发现生物活性多肽如玉米肽和鲨鱼肝源性多肽，由于其抗氧化能力而显示出对酒精性肝损伤的保护作用。此外，根据Li 等[11]的报道，桑葚多糖的肝脏保护活性可能与其对乙醇脱氢酶的活化、自由基的消除和/或脂质过氧化能力的抑制有关。
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种单细胞绿藻，可在细胞内积累大量具有良好抗氧化活性的虾青素，已被我国批准为新资源食品原料[12]。目前，大多数研究主要集中在雨生红球藻中虾青素的提取和功能活性的评价，而对其蛋白利用的报道相对较少[13-14]。事实上，雨生红球藻中的蛋白质含量为18%～30%，其必需氨基酸模式接近联合国粮食及农业组织和世界卫生组织提出的理想模式，是一种潜在的可利用蛋白质来源[15]。研究表明，雨生红球藻蛋白具有良好的乳化特性和乳化稳定性，为Pickering 乳液乳化剂的发展提供了新的可能性[16-17]。作为一种藻类来源的乳化剂，雨生红球藻蛋白的提取率可能较其他植物蛋白低，但其具有用量更少、不易受温度影响、对环境影响小等优势。
因此，本研究通过盐析法提取雨生红球藻蛋白（Haematococcus pluvialis protein，HPP），并通过一步乳化法制备稳定的Pickering 乳液。通过构造急性小鼠酒精性肝损伤模型，研究雨生红球藻蛋白Pickering乳液对小鼠酒精性肝损伤的保护作用，以期为雨生红球藻蛋白的开发利用提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6J 小鼠：辽宁长生生物技术股份有限公司，雄性，周龄8～10 周，体质量（20±2）g，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。饮用自来水，饲以标准小鼠饲料，每日进行12 h 光照和12 h 黑暗，室内温度维持在（23±2）℃，相对湿度保持在40%～60%，适应性喂养5 d。
1.2 材料与试剂
雨生红球藻藻粉：昆明白鸥微藻技术有限公司（中国昆明）；玉米油：西王集团有限公司；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性测定试剂盒、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）活性测定试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒、丙二醛（malondi aldehyde，MDA）试剂盒、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.3 仪器与设备
高速分散机（MICCRA D-4）：广州迈卡徕克工业技术有限公司；荧光倒置显微镜（Ti-S）：日本Nikon 公司；多功能酶标仪（Infinite M200）：上海帝肯实验器材有限公司；台式离心机（H1850R）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；旋转蒸发仪（SY-2000）：上海亚荣生化仪器厂。
1.4 方法
1.4.1 雨生红球藻蛋白Pickering 乳液的制备及表征
参考朱明辉[18]的方法稍作修改，提取HPP。将100 g雨生红球藻藻粉加入2 L 2%氯化钠溶液中，搅拌至均匀分散，室温下过夜，使其充分溶胀。将雨生红球藻藻液在45 ℃的水浴中超声作用2 h，使雨生红球藻细胞壁破裂，提高蛋白质的提取效率。超声处理后，在4 ℃下以7 000 r/min 离心15 min，收集上清液。向上清液中加入0.662 g/mL 的硫酸铵粉末，充分溶解后以12 000 r/min的速度在4 ℃下离心5 min 收集蛋白质沉淀。将沉淀物溶于250 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）中，得到雨生红球藻蛋白溶液。用真空旋转蒸发法将蛋白质溶液在45 ℃下浓缩，备用。
采用高速分散机通过一步均质法，将2%的HPP 水溶液与玉米油（70%油相比）的混合物在10 000 r/min 下剪切3 min，制备HPP 稳定的水包油型Pickering 乳液。
将乳液样品滴在载玻片上，盖上盖玻片，采用倒置显微镜观察乳液液滴的大小及分布。采用扫描电子显微镜和样品制备系统观察HPP 的形貌。将HPP 稳定的Pickering 乳液样品放在冷冻传输-扫描电子显微镜的样品台上，液氮冷冻后转移至样品制备系统进行断裂和喷金，再转移到电镜观察室，在-140 ℃下进行观察。采用体外模拟消化模型评估乳液的可消化性，使用的模拟唾液、胃液和肠液根据文献[19]的方法预先进行配制。将7.5 mL 乳液与等体积的模拟唾液混合，并在37 ℃下以100 r/min 的速度混匀2 min；之后加入7.5 mL 的人工胃液，并在37 ℃下以100 r/min 的速度搅拌120 min；将模拟胃液消化混合物的pH 值调节至7.0，并与模拟肠液以1∶2 的体积比混合。消化过程中的乳液状态采用倒置显微镜进行观察。
1.4.2 动物分组与处理
将50 只小鼠随机分组，每组10 只。小鼠共分为5 组：对照（Control）组、模型（ALD）组、玉米油（Oil）组、雨生红球藻蛋白（HPP）组和雨生红球藻蛋白Pickering乳液（PE）组。小鼠适应性饲养5 d 后，重新记录时间，记录为0 d。对照组在第0～16 天正常饲喂饲料和饮用自来水；模型组在第0～14 天正常饲喂，第15 天断水断粮并灌胃浓度30%的酒精1 次，12 h 后再次灌胃浓度50%的酒精1 次；其他样品组在第0～14 天进行正常饲喂的基础上，分别灌胃200 μL 的玉米油、雨生红球藻蛋白、雨生红球藻蛋白乳液进行干预，第15 天处理与模型组相同。在酒精肝损伤模型构建期间时刻关注小鼠情况，第16 天采血后将小鼠全部处死，并摘取小鼠的组织和器官，进行后续实验测定。
1.4.3 标本的采集与处理
利用眼球取血法采集小鼠血液样品，置于4 ℃预冷的离心机中，4 000 r/min 离心10 min，取上清并做好标记保存于-80 ℃的冰箱中。采血后使用颈椎脱位法处死小鼠，剖开小鼠腹腔取小鼠各部分器官，每个器官都精准测量其质量并记录。每组取3 只小鼠的肝脏、心脏、肾脏和胃等器官用4%多聚甲醛溶液固定，其中，肝脏只切割出整个肝组织的一叶。其余小鼠器官迅速放入液氮中冷冻，然后转移到-80 ℃冰箱中保存。
1.4.4 小鼠体质量的测定
从样品开始干预的第0 天开始，每隔1 d 称1 次质量，直至样品干预结束。
1.4.5 小鼠肝脏指数的测定及肝脏形态的观察
在小鼠处死前称其质量，处死后取出小鼠肝脏，称其质量，并观察其形态。肝脏指数（X，%）的计算公式如下。
X=m1/m2×100
式中：m1 为肝脏质量，g；m2 为小鼠体质量，g。
1.4.6 组织病理学观察
取出的肝脏、心脏、肾脏和胃组织迅速固定于4%多聚甲醛固定液，进行组织切片，苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）处理，送回后使用倒置显微镜观察各组织的病理损伤情况。
1.4.7 血清生化指标检测
取保存好的血清样本进行测定。谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆固醇和甘油三酯的含量检测按照试剂盒说明书进行测定。
1.4.8 肝脏生化指标检测
分别取不同组的小鼠肝组织200 mg，加入1.8 mL无菌生理盐水，使用电动匀浆机将组织充分研磨，放至4 ℃预冷的离心机中，4 000 r/min 离心10 min，取出离心后的上清液，保存在-80 ℃的冰箱中。每个样品中的蛋白浓度使用BCA 试剂盒测定。对超氧化物歧化酶、丙二醛、还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶水平进行测定。所有操作均按照试剂盒说明书进行。
1.5 统计学方法
数据结果以平均值±标准差表示，使用IBM SPSS Statistics 27 软件分析，采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，p＜0.05 被认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 Pickering 乳液的外观及微观结构
图1 为雨生红球藻蛋白Pickering 乳液的外观及微观结构。
图1 雨生红球藻蛋白Pickering 乳液的外观及微观结构
Fig.1 Appearance and microstructure of Pickering emulsion stabilized by Haematococcus pluvialis protein
A.制备示意图；B.外观图；C.显微镜图；D.扫描电镜图。
通过前期研究不同HPP 浓度与油相比例对Pickering 乳液稳定性的影响，发现雨生红球藻蛋白浓度为2%，油相比例为70%时，制备的Pickering 乳液状态最佳。由图1B 可知，乳液中没有水相层或油相层的析出，颜色呈现出虾青素的特征颜色，原因可能是蛋白提取过程中雨生红球藻中的虾青素和蛋白质相结合。由图1C 可知，Pickering 乳液中的油滴分布较为均匀且排列紧密，油滴的平均尺寸为（21±5）μm。由图1D 可知，乳液中液滴的结构呈球型，直径大小为20～30 μm，与光学显微镜的观察结果相一致。
2.2 Pickering 乳液的模拟消化
制备的Pickering 乳液在消化过程中的外观及微观结构的变化如图2所示。
图2 雨生红球藻蛋白Pickering 乳液模拟消化过程中的外观及显微结构的变化
Fig.2 Changes of appearance and microstructure of Pickering emulsion stabilized by Haematococcus pluvialis protein during simulated digestion
由图2 可知，唾液中的液滴尺寸比新制备乳液液滴大，可能是在唾液的稀释作用下，液滴不断地聚集和融合的结果；经胃液消化2 h 后，液滴大小没有明显变化，几乎未见油滴聚集，因为胃液中不含分解脂肪的酶；经肠液消化1 h 和2 h 后，乳液液滴尺寸逐渐减小，乳液开始出现明显的油滴，说明乳液在肠液中开始分解。上述结果显示，由HPP 稳定的Pickering 乳液能够在模拟肠液中较好地消化，为后续探究乳液对急性酒精性肝损伤的保护效果提供参考。
2.3 小鼠体质量及肝脏指数变化
在样品干预的整个过程中，小鼠的体质量变化可以间接反映样品的安全性。样品干预期间小鼠的体质量变化及各组小鼠的肝脏指数如图3所示。
图3 样品干预过程中小鼠的体质量变化及各组小鼠的肝脏指数
Fig.3 Body weight changes of mice during sample intervention and liver index of mice in each group
不同小写字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
从图3 可以看出，在14 d 观察时间内，5 组小鼠的体质量没有发生明显变化，在第14 天时，不同组小鼠之间的平均体质量差异不明显，说明玉米油、雨生红球藻蛋白和雨生红球藻蛋白稳定的Pickering 乳液样品的干预不影响小鼠体质量的变化，对小鼠的正常生长没有伤害性的影响，所制备的样品具有良好的生物相容性。正常情况下，小鼠肝脏指数的比例相对稳定，但当肝脏器官充血、水肿，或增生、肥大时，肝脏指数增加；反之，肝脏指数下降。ALD 组与对照组相比肝脏指数显著增加，较对照组升高29.9%，说明酒精造模使小鼠肝脏出现明显的增大、肿胀，使肝脏变重。与ALD 组相比，Oil 组和PE 组的肝脏指数分别显著下降12.7%和14.7%（p＜0.05），但HPP 组的改善效果不显著。以上结果显示，玉米油和雨生红球藻蛋白稳定的Pickering 乳液的干预均能在一定程度上缓解酒精对肝脏指数的影响。
2.4 Pickering乳液对小鼠肝脏形态的影响
图4 是不同处理组小鼠肝脏外观组织形态的变化。
图4 各组小鼠的肝脏外观形态
Fig.4 Liver appearance and morphology of mice in each group
从图4 可以看出，对照组小鼠的肝脏正常，颜色呈玫瑰色，光泽鲜红，有弹性，并且边缘比较锐利，没有发生病变；ALD 组小鼠经酒精处理后的肝脏颜色暗淡无光泽，质地变软，边缘变钝，且有部分组织坏死；Oil 组小鼠的肝脏颜色较ALD 组有一定光泽，并且边缘有一定的锐利度；HPP 组小鼠的肝脏状态较ALD 组有所改善，但颜色仍比较暗淡，无光泽；PE 组小鼠的肝脏颜色鲜红，弹性有所恢复，且边缘也出现明显的锐利现象，状态与对照组接近。这一结果与肝脏指数的实验结果相吻合，经样品组的干预后，小鼠肝脏的病变现象较ALD 组均有所改善，其中PE 组改善效果最佳，说明HPP 稳定的Pickering乳液对ALD 小鼠的肝损伤有一定的保护作用。
2.5 HPP 稳定的Pickering乳液对小鼠器官组织病理学影响
对各组小鼠的肝脏、胃、心脏和肾脏组织进行病理学观察，结果如图5所示。
图5 各组小鼠的肝脏、胃、心脏和肾脏组织病理切片
Fig.5 Pathological sections of liver，stomach，heart，and kidney of mice in each group
由图5 可知，对照组小鼠的肝组织结构正常，致密的肝细胞整齐排列在中央静脉周围，可以观察到清晰的细胞间隙，且细胞核为规则的圆形，没有发生病变；ALD 组小鼠的肝组织细胞结构紊乱且细胞肿胀，细胞间隙模糊或过大，细胞核形状不规则，有破裂或溶解现象出现，并伴有粒细胞的侵入，发生病变；Oil 组小鼠肝细胞仍有一定肿胀，细胞间隙稍有模糊但细胞没有出现融合，病变情况优于ALD 组，但不能完全改善酒精所导致的肝损伤；HPP 组中小鼠肝细胞排列较为整齐，结构轮廓相对完整，细胞核形状也较为规则，但仍有少量炎症细胞的存在，在很大程度上预防了酒精性肝损伤；PE 组的肝组织细胞结构较为完整，排列相对整齐，细胞间隙较为清晰，还有少量的肝细胞肿胀，但没有炎症细胞的存在，组织形态与对照组接近。以上结果表明，HPP 稳定的Pickering 乳液能有效改善ALD小鼠中酒精所导致的肝脏损伤。另外，酒精处理还能引起胃组织微观结构的变化，造成胃黏膜腺体排列不均，细胞核排列紊乱，粒细胞堆积严重。经Oil 组干预后，腺体排列的整齐度有所改善，但仍有炎症细胞；HPP 组和PE 组小鼠的胃黏膜细胞排列整齐，细胞核分布均匀，黏膜损伤较少，基本无炎症细胞。以上结果表明HPP 和HPP 稳定的Pickering 乳液均可以减轻酒精所带来的胃损伤。从心脏和肾脏结果来看，各处理组之间无明显差异，表明酒精处理不会对心脏和肾脏器官造成显著性的损伤。
2.6 HPP 稳定的Pickering乳液对小鼠血清相关指标的影响
为了进一步研究酒精对小鼠肝脏的损伤情况，以及不同样品处理对肝损伤的缓解情况，分别对小鼠血液中谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性、总胆固醇和甘油三酯的含量进行测定，结果如图6所示。
图6 各组小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆固醇和甘油三酯的水平
Fig.6 Serum levels of alanine transaminase，aspartate transaminase，total cholesterol，and triglycerides in mice of each group
不同小写字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
谷丙转氨酶和谷草转氨酶主要存在于肝细胞内，当肝组织受到损伤或有炎症因子的侵入时，便会释放到血液中，是检测肝脏细胞是否受到损害的常用指标[20]。由图6 可知，与对照组相比，ALD 组小鼠血清的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性均显著升高（p＜0.05），说明酒精处理引起了小鼠肝脏损伤，也证明了ALD 小鼠模型的成功建立。与模型组相比，Oil 组、HPP 组与PE组的谷丙转氨酶水平分别下降30.2%、42.5%和63.9%，其中HPP 组和PE 组缓解效果显著且PE 组水平下降最为明显（p＜0.05）。对于谷草转氨酶活性，Oil 组、HPP组与PE 组均有明显的缓解作用，其中PE 组较ALD组下降31.8%，且与对照组无显著差异（p＞0.05）。以上结果表明，雨生红球藻蛋白稳定的Pickering乳液对ALD 组小鼠肝损伤具有最佳的改善作用。与对照组相比，ALD 组小鼠的总胆固醇和甘油三酯含量分别升高60.9%和121.3%，这表明ALD 组小鼠体内胆固醇运输途径受到损害，造成血脂的代谢紊乱[21]。在总胆固醇结果中，Oil 组、HPP 组与PE 组相较于ALD 组均可抑制酒精诱导的总胆固醇水平升高，其中PE 组小鼠的总胆固醇含量下降到与对照组相当的水平，缓解效果最好。从甘油三酯的结果来看，Oil 组的甘油三酯水平与ALD 组几乎无差别，可能是因为灌胃的玉米油在胆汁酸、脂酶的作用下被肠黏膜吸收，在肠黏膜的上皮细胞内合成甘油三酯；HPP 组与ALD 组相比，甘油三酯水平降低最为显著（p＜0.05），与对照组相比无显著差异，对肝脏脂质蓄积的抑制作用最强，可能是由于HPP中的虾青素能有效地维持胆固醇的运输途径，改善血脂代谢紊乱；而PE 组的甘油三酯水平虽较对照组明显增加，但与ALD 组相比仍有19.7%的降低。
2.7 HPP 稳定的Pickering乳液对小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、还原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响
超氧化物歧化酶是酶防御系统中很重要的组成成分，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力[22]。丙二醛含量的高低可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出机体细胞受自由基攻击的严重程度。还原型谷胱甘肽可清除O2-、H2O2、LOOH 等自由基，是机体内最重要的非酶性抗氧化物，其含量多少是衡量机体抗氧化能力的重要因素[23]。谷胱甘肽过氧化物酶可特异性催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[24]。因此，对以上指标进行测定，评价不同处理对酒精引起的肝脏氧化应激的缓解作用，结果如图7所示。
图7 各组小鼠肝脏中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的酶活以及还原型谷胱甘肽、丙二醛含量
Fig.7 Activities of superoxide dismutase and glutathione peroxidase and content of reduced glutathione and malondialdehyde in the liver of each group of mice
不同小写字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
由图7 可知，与对照组小鼠相比，ALD 组小鼠肝脏匀浆中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性和还原型谷胱甘肽含量显著降低，而丙二醛的含量显著升高（p＜0.05），表明ALD 组小鼠体内的代谢平衡被打破，发生了严重的氧化应激损伤。从超氧化物歧化酶活性来看，Oil、HPP 和PE 组均较ALD 组显著增加，且HPP 组的超氧化物歧化酶水平恢复程度最佳，较ALD 组显著升高，这可能是因为雨生红球藻蛋白中含有的虾青素能够清除氧化应激产生的自由基；对于丙二醛含量，HPP 与PE 组含量较ALD 组分别降低21.8%和20.8%，而Oil 组小鼠的丙二醛含量与ALD组相比下降并不明显，说明玉米油干预的小鼠机体细胞受自由基攻击的程度仍较为严重，缓解损伤的效果并不明显。对于还原型谷胱甘肽含量，Oil 组不能明显抑制酒精所导致的还原型谷胱甘肽水平降低，但HPP和PE 组的还原型谷胱甘肽含量明显比ALD 组高，尤其是PE 组升高44.5%，几乎恢复到与对照组相当的水平，改善效果最佳。而对于谷胱甘肽过氧化物酶酶活，Oil 组与PE 组谷胱甘肽过氧化物酶活力较ALD 组升高不显著，而HPP 组显著升高。以上结果表明，雨生红球藻蛋白稳定的Pickering 乳液能在一定程度上抑制酒精代谢所造成的氧化应激损伤。
3 结论
本研究首先通过雨生红球藻藻粉提取蛋白，随后利用雨生红球藻蛋白成功制备了Pickering 乳液，所制备的Pickering 乳液具有较好的稳定性和可消化性。体内实验结果表明，通过HPP 稳定的Pickering 乳液干预，可使血液中作为肝损伤指标的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平分别降低63.9%和31.8%，且Pickering乳液还具有降低甘油三酯和总胆固醇的作用，可使总胆固醇水平下降37.5%。抗氧化酶和氧化产物的水平测定结果显示，HPP 稳定的Pickering 乳液可提高小鼠肝脏中超氧化物歧化酶酶活和44.5%的还原型谷胱甘肽含量，能有效抑制酒精代谢所造成的氧化应激损伤。此外，小鼠肝脏指数、肝脏形态和HE 染色结果也显示，Pickering 乳液干预能够使肝组织损伤状况有明显改善。以上结果表明，雨生红球藻蛋白Pickering 乳液可以作为一种预防和保护酒精性肝损伤的食源性功能成分，同时也为雨生红球藻的综合利用提供了新的思路和可能性。
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