蜂巢营养成分丰富且对人体无毒无害[1-2]，研究发现蜂巢制品不仅可以改善人体免疫功能[3]，还对人体内的一些病原菌有显著抑制作用[4-5]。有研究发现，蜂巢对肝炎表面抗原具有灭活作用[6]，对某些癌症也有一定的疗效[7]。此外，相关研究表明蜂巢的提取物有抗炎、抗菌和抗氧化作用[8]，蜂巢的抗氧化作用的主要机理是由于其含有的抗氧化活性物质可以与金属离子螯合，是天然抗氧化剂[9]，在食品、医药、化妆品等各行业被广泛应用。
关于蜂巢样本中主要成分及含量的测定，徐欢等[10]采用香草醛-冰醋酸显色法测定蜂巢中甾萜类物质的含量，结果表明无刺蜂蜂巢甾萜类乙醇提取物在体外具有较好的抗氧化活性。李超[11]采用高效液相色谱法对蜂巢黄酮化合物进行定性定量分析，发现蜂巢中含有黄酮类、糖类、氨基酸类、有机酸等化合物。范家佑等[12]提取了露蜂巢的挥发性物质，通过检测最终得到68 种挥发性物质，其主要成分中高级脂肪酸和酯类含量较少，而烃类化合物含量多，研究中对其物质活性成分功能分析较少。
近几年对于蜂巢生物活性物质功能的研究十分鲜见，蜂巢生物活性成分没有得到充分的研究利用，造成资源的浪费。本研究以不同蜜源的蜂巢为研究对象，采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-Q-TOF/MS）技术[13]，探究不同蜜源蜂巢的活性物质差异以及特有活性物质的功能，以期为蜂巢的综合利用和进一步的开发提供一定依据，为后续研究提供理论与方法的支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 蜂巢来源
样品均来自云南，样本分组信息如表1 所示。
表1 样本分组信息
Table 1 Sample grouping information
蜜源 样本名草药和米团花 A-1～A-3百花 B-1～B-3草药和米团花 C-1～C-2百花 D-1～D-3类别崖黑巢崖黑巢克巢克巢
1.1.2 试剂与仪器
乙腈、乙醇、甲醇（均为色谱级）：德国默克集团；醋酸铵、甲酸铵（均为色谱级）：上海创赛科技有限公司；甘油、4-（2-羟乙基）-哌嗪-1-乙磺酸（均为色谱级）：美国西格玛奥德里奇公司。
QTOF/MS-65454 质谱仪、1290 Infinity LC 超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；MIX-200 涡旋混合器：上海净信实业发展有限公司；5427R 台式高速冷冻离心机：德国艾本德公司；Milli-Q 水净化系统制备：法国莫尔谢姆集团。
1.2 试验方法
1.2.1 样品前处理方法
分别称取适当的样品加入离心管，控制样品的质量在（50.0±0.1）mg，加入预冷过的甲醇水（500 μL 70%，含1 mg/L 的2-氯苯丙氨酸）。对其进行匀浆操作（30 s，30 Hz），振荡充分混匀，静置冷却15 min 后进行离心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液400 μL 置于样品管中，沉淀部分加入500 μL 乙酸乙酯/甲醇（体积比1∶3），充分混合均匀后再次离心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），取二次离心后的上清液400 μL 与一次离心上清液混合，沉淀部分加入100 μL 70%甲醇水，超声破碎3 min 后离心（12 000 r/min，3 min，4 ℃），取60 μL 上清液注入玻璃内衬管中待用。
1.2.2 液相色谱条件
色谱柱采用Waters BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），色谱分离温度为35 ℃，流速为0.3 mL/min，进样量为5 μL。
正离子模式的流动相：含0.1%甲酸的乙腈为A相、含0.1%甲酸的超纯水为B 相，按照体积比进行梯度洗脱：0～2 min，90%A；2～6 min，70%A；6～7 min，50%A；7～8 min，35%A；8～9 min，30%A；9～10 min，20%A；10～15 min，10%A；15～16 min，90%A。
负离子模式的流动相：0.1%甲酸铵溶液为A 相、乙腈溶液为B 相；按照体积比进行梯度洗脱：0～2 min，90%A；2～6 min，70%A；6～10 min，35%A；10～15 min，10%A；15～16 min，90%A。
1.2.3 质谱条件
质谱条件使用正负离子两种模式对数据进行采集，雾化气体为氮气。一级质荷比扫描范围为50～1 200，选择20～40 eV 的能量对其中的母离子进行破碎，对其碎片的数据信息进行采集。正离子模式下锁定质量数为556.277 1，负离子模式下锁定质量数为554.261 5，扫描时间0.2 s，采集间隔20 s，使用质量浓度为2 mg/mL亮氨酸脑啡肽作为校正液进行实时质量校正。质谱条件中流量为10 μL/min；毛细管电压为3 kV；锥孔电压为40 kV；离子源温度为120 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气流速为800 L/h；锥孔气流量为50 L/h；扫描时间为0.2 s。1.3 数据处理
LC-Q-TOF/MS 技术获得的原始数据经MassLynx 4.1 工作站、Progenesis QI 软件完成预处理，对其中的数据进行峰提取、峰对齐以及保留时间的校正。对缺失率大于50%的峰进行过滤，然后数据对比数据库。使用EZinf 软件对其代谢产物进行统计学分析，主要包括主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘（orthogonal projections to latent structures，OPLS）法等，根据统计学分析，结合T 检验和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonalpartialleast squares-discriminantanalysis，OPLS-DA）以及分析的变量对模型的重要性值（variable importance in the projection，VIP），进行差异代谢物的筛选工作，将VIP＞1，且P＜0.05 的代谢物定义为显著差异代谢物。随后对于检索出来的差异代谢物进行匹配及分析，通过关联分析、聚类分析等手段，对比人类代谢组数据库（human metabolome database，HMDB）信息，对差异代谢物的功能活性进行匹配，并最终确定差异代谢物成分和功能。
2 结果与分析
2.1 蜂巢活性物质探究
2.1.1 质控分析
质控分析（quality controlled，QC）是处理试验过程中数据重复性是否良好的检测手段[14]，在样本数据上机之前，需要使用QC 样本对仪器进行检测，并在样本上机过程中，不时使用QC 样本进行标定，避免数据的漂移，保证样本数据的准确性。通过总离子流图（total ion chromatogram，TIC），对其进行分析，可以得知仪器的准确性和可靠性是否良好。正、负离子两种模式下的TIC 重叠图如图1 所示。
图1 正、负离子两种模式下的TIC 重叠图
Fig.1 TIC overlay picture in cation and anion conditions
由图1 可知，正负离子模式下QC 样本都能较好地聚集在一起，重叠程度越高，表明本研究的质谱分析仪器运行情况越优良，稳定性越好。
2.1.2 蜂巢活性物质分析
两种蜂巢共检索出26 235 个物质，以物质峰强度，P＜0.01、两组数据之间的差异倍数≤0.5 或≥2 和VIP＞1 作为筛选标准[15]，HMDB 数据库中所筛选出克巢活性物质情况如表2 所示。
表2 克巢中的活性物质
Table 2 Active substances in gram nests
代谢物种类 代谢物名称 化学式 P 值氨基酸及其衍生物 L-酪氨酸（L-tyrosine） C9H11NO3 0.000 40 L-色氨酸（L-tryptophan） C11H12N2O2 0.003 27 D-焦谷氨酸（D-pyroglutamic acid） C18H28N4O7 0.005 81 L-谷氨酸（L-glutamic acid） C5H9NO4 0.000 15 L-赖氨酸（L-lysine） C6H14N2O2 0.000 38唾液酸（N-acetylneuraminic acid） C11H19NO9 0.000 48糖类 D-苏糖酸（D-threonic acid） C4H8O5 0.000 66 N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-d-glucosamine） C8H15NO6 0.000 10 D-果糖（D-fructose） C6H12O6 0.000 55生物碱 聚神经酰胺醛（polyneuridine aldehyde） C21H22N2O3 0.007 43黄酮类化合物 4＇，6，7-三羟基异黄酮（6-hydroxydaidzein） C15H10O5 0.002 25甘草素（liquiritigenin） C15H12O4 0.000 17山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷（kaempferol 3-sophoroside 7-glucoside） C33H40O21 0.002 17槲皮万寿菊素-3，6-二甲醚（axillarin） C17H14O8 0.000 30黄豆黄素（glycitein） C16H12O5 0.003 58吲哚及其衍生物 N6-顺式-p-古马罗（N6-cis-p-coumaroylserotonin） C19H18N2O3 0.008 71 3-吲哚乙酰胺（indole-3-acetamide） C10H10N2O 0.000 87有机酸及其衍生物 L-乳酸（L-lactic acid） C3H6O3 0.004 02邻羟基苯乙酸（2-hydroxyphenylacetic acid） C8H8O3 0.004 51酚酸类物质 D（-）-水杨苷（salicin） C13H18O7 0.008 25对香豆酸（P-coumaric acid） C9H8O3 0.000 12 4-甲基儿茶酚（4-methylcatechol） C7H8O2 0.000 84
由表2 可知，克巢中筛选出22 个与人体密切相关的化合物，代谢物分别归类到氨基酸及其衍生物（6个）、糖类（3 个）、生物碱（1 个）、黄酮类化合物（5 个）、吲哚及其衍生物（2 个）、有机酸及其衍生物（2 个）、酚酸类物质（3 个）共7 个分类。
以物质峰强度，P＜0.01、0.5≤两组数据之间的差异倍数≥2 和VIP＞1 作为筛选标准，HMDB 数据库中所筛选出崖黑巢活性物质情况如表3 所示。
表3 崖黑巢中的活性物质
Table 3 Active substances in the cliff black nest
代谢物种类 代谢物名称 化学式 P 值氨基酸及其衍生物 5-氨基戊酸（5-aminovaleric acid） C4H9NO2 0.000 16 L-苯丙氨酸（L-phenylalanine） C9H11NO2 0.004 32 N-异戊酰氨基乙酸（N-isovaleroylglycine） C7H13NO3 0.005 69水苏碱（stachydrine） C7H13NO2 0.000 46 L-半胱氨酸（L-cystein） C3H7NO2S 0.001 36 N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺（phenylacetyl-L-glutamine） C13H16N2O4 0.002 35苯乙酰甘氨酸（N-phenylacetylglycine） C10H11NO3 0.008 98糖类 乳糖（lactose） C12H22O11 0.002 43生物碱 5-羟基色醇（5-hydroxytryptophol） C10H11NO2 0.001 30哈尔酚（harmol） C12H10N2O 0.005 27黄酮类化合物 3，7-二-O-甲基槲皮素（3，7-di-O-methylquercetin） C17H14O7 0.000 19水仙苷（narcissin） C28H32O16 0.000 39吲哚及其衍生物 2-（1H-吲哚-3-基）乙腈氧化物[2-（1H-indol-3-yl）acetonitrile oxide] C10H8N2O 0.001 95 7-氯-L-色氨酸（7-chloro-L-tryptophan） C11H11ClN2O2 0.002 93辅酶和维生素类 烟酰胺（nicotinamide） C6H6N2O 0.003 78泛酸（pantothenate） C9H17NO5 0.000 50 D-生物（biotin） C10H16N2O3S 0.002 40维生素B1（thiamine） C12H17N4OS+ 0.005 72有机酸及其衍生物 叶酸（folic acid） C20H23N7O7 0.000 20衣康酸（itaconic acid） C5H6O4 0.000 11丁二酸（succinic acid） C4H6O4 0.000 15 3-甲基己二酸（3-methyladipic acid） C7H12O4 0.000 79酚酸类物质 水杨酸（salicylic acid） C7H6O3 0.002 71
由表3 可知，崖黑巢中筛选出23 个与人体密切相关的化合物，代谢物分别归类到氨基酸及其衍生物（7个）、糖类（1 个）、生物碱（2 个）、黄酮类化合物（2 个）、吲哚及其衍生物（2 个）、辅酶和维生素类（4 个）、有机酸及其衍生物（4 个）、酚酸类物质（1 个）共8 个分类。
克巢中黄酮类主要有4＇，6，7-三羟基异黄酮具有抗氧化性和抗癌活性[16]；甘草素具有抗癌、抗炎和治疗神经疾病活性[17]；山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷具有抗肥胖活性；槲皮万寿菊素-3，6-二甲醚具有抗炎活性[18]；黄豆黄素可以影响细胞凋亡和抗氧化活性。酚酸类物质主要有D（-）-水杨苷，具有抗癌抗炎活性[19]；4-羟基肉桂酸，具有抗肿瘤和抗诱变活性[20]；4-甲基儿茶酚具有抗氧化活性。
崖黒巢中黄酮类化合物主要有3，7-二-O-甲基槲皮素可增加血管舒张的活性功能；水仙苷具有抗氧化活性。酚酸类物质中含有的水杨酸具有抗炎活性和治疗免疫疾病活性[21]。有机酸及其衍生物主要有叶酸、衣康酸、丁二酸、3-甲基己二酸，是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。生物碱主要有5-羟基色醇、哈尔酚。辅酶和维生素类：烟酰胺可调节食欲、睡眠、情绪[22]；泛酸可抑制恶性疟原虫泛酸激酶活性并抑制疟原虫的增殖；D-生物素、维生素B1 可促进胃肠道蠕动和增加食欲[23]。
2.2 差异代谢物分析
2.2.1 主成分分析
PCA 是一种常用的无监督模式识别方法，反映了样本代谢物的相似程度，即在样品分组情况未明的前提下对数据进行分析，直接反映不同化学级别之间的差异，并找出异常值的分析方法[24]，样本之间重合距离越小，表示差异越小，反之差异越大[25]，通过对得到的PCA 模型图进行分析，从而得到不同蜜源的蜂巢中各类代谢物的简单分组分布情况。本研究PCA 得分情况如图2 所示。
图2 正、负离子模式下的主成分分析
Fig.2 Principal component analysis in cation and anion conditions
由图2 可知，图中所有点均分布于95%置信区间内，根据PCA 图可知，组内差异不明显，组间差异明显。表明样品组内代谢物差异小，组间代谢物差异明显[26]。此外PC1 为39.27%，PC2 为14.85%。结果表明该PCA 模型稳定可靠，可用于后续分析。
2.2.2 OPLS-DA 分析
OPLS-DA 是一种有监督模式识别方法，可以去除部分无关信息，保证模型的预测能力在保持不下降的前提之下，有效地减少模型的结构复杂性，放大各组之间的差异性[27]。通过使用有监督的OPLS-DA 分析，结合VIP 值，可以对代谢物进行筛选，控制适当的因素条件，检索不同蜂巢样品当中的差异代谢物。本研究的OPLS-DA 分析情况如图3 所示。
图3 OPLS-DA 得分图
Fig.3 OPLS-DA score plot of different honey combs
a.草药和米团花蜜源崖黑巢和百花蜜源崖黑巢；b.草药和米团花蜜源克巢和百花蜜源克巢。
由图3a 可知，草药和米团花蜜源崖黑巢和百花蜜源崖黑巢样品OPLS-DA 模型中共有两个主成分，第一个主成分的贡献值为52.2%，第二个主成分的贡献值为11.4%；由图3b 可知，草药和米团花蜜源克巢和百花蜜源克巢样品OPLS-DA 模型中共有两个主成分，第一个主成分的贡献值为37.6%，第二个主成分的贡献值为29%，各组样品之间区分效果非常明显，所建立的模型当中的Q2＞0.9，表明该模型数据稳定性和可靠性良好[28]。
2.2.3 不同蜜源蜂巢的差异代谢物
经数据质量控制步骤后，草药和米团花蜜源崖黑巢、百花蜜源崖黑巢、草药和米团花蜜源克巢、百花蜜源克巢的差异代谢物情况如图4 所示。
图4 正负离子模式下分组韦恩图
Fig.4 Venn in cation and anion conditions
A.草药和米团花蜜源崖黑巢与百花蜜源崖黑巢的差异代谢物；B.草药和米团花蜜源崖黑巢与草药和米团花蜜源克巢的差异代谢物；C.百花蜜源崖黑巢和草药与百花蜜源克巢的差异代谢物；D.草药和米团花蜜源克巢与草药和百花蜜源克巢的差异代谢物。
由图4 可知，数据集中分别保留了1 790、1 779、1 865、1 867 种差异代谢物，4 组样品共有1 268 种共有差异代谢物。两组崖黑巢有1 658 种共有差异代谢物，两组克巢有1 456 种共有差异代谢物，两组以草药和米团花为蜜源的蜂巢有1 433 种共有差异代谢物，两组百花蜜源蜂巢有1 673 种共有差异代谢物。
用T 检验和变异倍数可以对代谢物进行筛选。以P＜0.05，两组数据之间的差异倍数≥2 或两组数据之间的差异倍数≤0.5 为标准，进行差异代谢产物筛选工序，将数据进行可视化处理，绘制火山图，结果如图5所示。
图5 正、负离子合并差异代谢物火山图
Fig.5 Volcano map of differential metabolites in cation and anion conditions
A.不同蜜源崖黒巢蜂巢样本；B.不同蜜源克巢蜂巢样本；C.两组草药和米团花蜜源蜂巢样本；D.两组百花蜜源蜂巢样本。
由图5A 可知，不同蜜源崖黒巢共检索到的蜂巢差异代谢物总数为1 239 种，其中上调代谢物为327种，下调代谢物为125 种。由图5B 可知，不同蜜源克巢共检索到的蜂巢差异代谢物总数为1 456 种，其中上调代谢物为153 种，下调代谢物为139 种。由图5C可知，两组草药和米团花蜜源样品共检索到的蜂巢差异代谢物总数为1 433 种，其中上调代谢物为672 种，下调代谢物为724 种。由图5D 可知，两组百花蜜源共检索到的蜂巢差异代谢物总数为1 673 种，其中上调代谢物为672 种，下调代谢物为724 种。
对不同蜜源蜂巢的差异代谢物进行聚类分析，每行各代表一种差异代谢物，列代表一个蜂巢样本。结果如图6 所示。
图6 正、负离子模式下差异代谢物聚类分析
Fig.6 Cluster analysis of differential metabolites in cation and anion conditions
由图6 可知，不同研究组中平行样本都聚在同一簇内，表明聚类结果可信度较高，聚类热图分析的结果可靠[29]。共鉴定出75 种具有显著差异的代谢物，崖黑巢中有39 种成分相对含量高于克巢，36 种成分相对含量低于克巢。
崖黑巢中两种不同蜜源的代谢物如表4 所示。
表4 两种蜜源崖黑巢差异代谢物鉴定结果
Table 4 Identification results of differential metabolites in the black nest of two nectar cliffs
代谢物名称 化学式 P 值 类型2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4-vinylguaiacol） C9H10O2 0.000 44 下调3，7-二-O-甲基槲皮素 C17H14O7 0.002 70 下调（3，7-di-O-methylquercetin）阿魏酸（ferulic acid） C10H10O4 0.012 66 上调烟酰胺（nicotinamide） C6H6N2O 0.000 63 上调次黄嘌呤（hypoxanthine） C5H4N4O 0.001 15 上调紫杉醇（paclitaxel） C47H51NO14 0.013 15 上调氨磺丁脲（tolbutamide） C12H18N2O3S 0.000 20 上调松柏醇（coniferyl alcohol） C10H12O3 0.001 94 上调3-（甲硫基）丙酸 C4H8O2S 0.039 17 上调[3-（methylthio）propionic acid]2’-甲氧基腺苷（2’-O-methyladenosine） C11H15N5O4 0.012 67 上调
由表4 可知，两种蜜源崖黑巢差异代谢物鉴定结果为显著上调差异代谢物有阿魏酸、烟酰胺、次黄嘌呤、紫杉醇、氨磺丁脲、松柏醇、3-（甲硫基）丙酸、2＇-甲氧基腺苷（8 个），即以百花为蜜源的崖黒巢中上述化合物的含量显著高于以草药和米团花为蜜源的崖黒巢。下调物质有2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3，7-二-O-甲基槲皮（2 个）。即以草药和米团花为蜜源的崖黒巢中上述化合物的含量显著高于以百花为蜜源的崖黒巢。
克巢不同蜜源的差异代谢物如表5 所示。
表5 两种蜜源克巢差异代谢物鉴定结果
Table 5 Identification results of differential metabolites between two nectar sources of gram nest
代谢物名称 化学式 P 值 类型假荆芥属苷（nepetin 7-glucoside） C22H22O12 0.023 15 下调萘啶酮酸（nalidixic acid） C12H12N2O3 0.017 11 下调槲皮素（quercetin） C15H10O7 0.016 72 上调4＇，6，7-三羟基异黄酮 C15H10O5 0.027 37 上调（6-hydroxydaidzein）穗花杉双黄酮（amentoflavone） C30H18O10 0.033 15 上调奥昔嘌醇（oxypurinol） C5H4N4O2 0.001 43 上调4＇-O-甲基-d3 槲皮素（tamarixetin） C16H12O7 0.003 99 上调羟基芫花素（hydroxygenkwanin） C16H12O6 0.006 37 上调桑色素（morin） C15H10O7 0.015 99 上调
由表5 可知，两种蜜源克巢差异代谢物鉴定结果为显著上调差异代谢物有槲皮素、4＇，6，7-三羟基异黄酮、穗花杉双黄酮、奥昔嘌醇、4＇-O-甲基-d3 槲皮素、羟基芫花素、桑色素（7 个），即以百花为蜜源的克巢中上述化合物的含量显著高于以草药和米团花为蜜源的克巢。下调物质有假荆芥属苷、萘啶酮酸（2 个）。即以草药和米团花为蜜源的克巢中上述化合物的含量显著高于以百花为蜜源的克巢。可以看出在崖黑巢和克巢中，以草药和米团花为蜜源的样本比以百花为蜜源的样本中对人体有益的活性物质更丰富。
3 结论
近年来，蜂巢因其具有对人体有益的生物活性和广泛的入药案例而备受关注。本试验使用液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术可以有效地区分不同蜜源崖黑巢和克巢，不仅表现出了蜂巢的化学多样性，还丰富了蜂巢溯源识别的标志化合物群，其中黄酮与酚酸类化合物不仅是蜂巢中的活性组分群，还可作为蜂巢蜜源判别的差异标志物。本试验可以初步鉴定蜂巢中存在的对人体有益的活性物质，还可以为不同蜜源的蜂巢的质量评价建立有效方法，为蜂巢的品质分析与规范蜂产品市场作参考。
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