玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa Linn.）又名洛神花、山茄、洛神葵等，在广东、福建等地分布广泛，被誉为“植物界的红宝石”[1]。玫瑰茄的花萼颜色鲜艳，香气突出，富含糖类、有机酸以及花青素等物质[2]，其香气是由多种化合物贡献的，带有明显的花香和果香，主要包括烃类、醇类、酮类、醛类、酯类等。
近年来，为减少非营养甜味剂对消费者感官上产生的负面影响，通过气味诱导滋味增强的方式实现“减糖增甜”已成为研究热点[3]。已有研究表明，香气的添加如香草香气、草莓香气和香蕉香气，能够显著增加甜味感知。Oliveira 等[4]研究发现在酸奶中添加0.2%的香草香气或草莓香气，减少25%的蔗糖使用量，不会影响酸奶甜度。Bertelsen 等[5]研究发现香草、蜂蜜和香蕉香气在低和中浓度蔗糖下有显著增甜效果。
香气增甜是极具应用价值的新型减糖方式。目前，国内外有关玫瑰茄的研究主要集中在玫瑰茄活性成分提取工艺[6-7]、生物活性及药用价值[8-9]、新产品开发[10-11]等方面，而对于玫瑰茄挥发性香气成分的挖掘、验证、应用有待研究。气相色谱嗅闻（gas chromatography/olfactometry-associated taste，GC/O-AT）技术[12-13]可用于5 种口味（甜、咸、苦、酸、鲜）的筛选鉴定。本文利用GC/O-AT 筛选玫瑰茄花萼中滋味感知相关的挥发性成分，由感官描述得知甜味感知相关的香气成分，结合气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 分析玫瑰茄中挥发性成分的种类及相对含量。以期为低糖、健康、美味食品的开发奠定基础，为食品工业发展提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玫瑰茄花萼：产自云南昆明，沧州市食品药品检验所提供。
11 种香气成分的标准品（正己醛、糠醛、癸醛、壬醛、香叶基丙酮、苯甲醛、辛醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、橙花叔醇、α-松油醇，均为色谱纯）：天津泰艾瑞科技有限公司；蔗糖（食品级）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BJ-800A 多功能粉碎机：杭州拜杰科技有限公司；ME204/02 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；81-2 型恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；GCMS-QP2010 气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）手动进样手柄、50/30UM DVB/CAR on PDMS 萃取头：上海安谱实验科技股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 香气成分萃取
将顶空瓶清洗干净、烘干备用，准确称量0.300 g粉碎过筛后的玫瑰茄花萼粉末，加入超纯水5 mL 至顶空瓶约1/3 处，加入磁力搅拌转子，封口，固定在装满水的烧杯中，于80 ℃恒温平衡15 min。将经老化处理后的萃取针插入预先扎孔的顶空瓶内，注意不能接触液面，于80 ℃恒温吸附30 min。取出富集香气成分的萃取针，立即将其插入到气相色谱仪的进样口中进行测样，样品解吸15 min 后拔出，程序运行50 min 后自动结束。
1.3.2 GC-MS 分析
色谱条件：Rtx-5MS 气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；在初始温度为40 ℃下保持1 min，以4 ℃/min的速度升温至182 ℃，保持时间为1 min，再以8 ℃/min的速度升温至250 ℃，保持时间为3 min；进样口温度为250 ℃，不分流进样；载气为He，流量为1.0 mL/min。
质谱条件：气相质谱离子源为电子电离离子源，离子源温度220 ℃，电子能量70 eV，接口温度220 ℃，质谱扫描范围为m/z 40～500。
1.3.3 GC/O-AT 分析
气相色谱毛细管柱的末端连接到一个分流器，将流出物分成两个相等的部分，即嗅探器端口和质谱检测器，并且在嗅觉端口处安装加湿器以避免鼻黏膜脱水，分析条件同1.3.2 的方法，同时有10 名相关研究经验的食品专业学生（5 男5 女，年龄在18～25 岁）进行嗅闻，要求筛选出与甜味感知相关的香气化合物。感官评审员描述嗅到的香气属性特征（如花香、果香和焦糖香等），并记录气味感知的强度，感知无气味划定为0、有微弱气味划定为1、有较明显的气味划定为2、有强烈气味划定为3。
1.3.4 感官评价
感官评审团由20 名有相关研究经验的食品专业学生（10 男10 女，年龄在18～25 岁）组成。感官评价员符合Xiao 等[14]的气味诱导甜味增强试验中的感官评定要求，以准确有代表性的描述玫瑰茄中香气成分的感官特征。结合GC-O/AT 选择11 种食品级香味剂在含有30 g/L 蔗糖的蒸馏水中稀释，以探索其增强甜度的感知能力。根据其嗅觉强度和预测试中的可接受性来选择香味剂的浓度，如表1 所示。
表1 11 种香气成分气味阈值以及蔗糖溶液中添加的选定浓度
Table 1 Odor threshold and concentration of eleven aroma components added in the sucrose solution
序号 香气成分 气味阈值/（μg/kg） 浓度/（μg/kg） 参考文献1 己醛 4.5 16～76 [15]2 糠醛 3 000 5 000 [16]3 苯甲醛 350 1 500 [15]4 1-辛烯-3-醇 1 9 [15]5 辛醛 0.7 5～45 [16]6 芳樟醇 6 380 [17]7 壬醛 1 6～12 [15]8 α-松油醇 330 970 [18]9 癸醛 1 7 [18]10 香叶基丙酮 60 430 [19]11 橙花叔醇 15 30 [17]
取每种溶液10 mL 置于50 mL 塑料杯中，所得样本使用随机3 位数字编号，并随机提供给感官评价员。对于每个样本，感官评价员都被要求先进行嗅闻后气味描述并将整个样本放入嘴中，舌尖旋转样本记录感知描述，感官评价员用酸、甜、苦、鲜、咸5 种味觉感知描述玫瑰茄的香气。样品间隔不低于90 s，蒸馏水漱口。
上述试验选出6 种与甜味感知相关的香气成分，其不仅在本试验样本中出现，而且广泛存在于玫瑰茄中。将筛选出的香气成分按照表1 浓度分别加入到30 g/L的蔗糖溶液中，并制备一份相同浓度的蔗糖溶液。用3 位随机数对提供样品进行编码，感官评价员采用0～10（0 表示没有，10 表示非常强烈）的线性范围来评定甜味的强度。在对随机提供样品品尝之前，感官评价员需要品尝参考溶液，其中30 g/L 的蔗糖溶液评分为3，80 g/L 的蔗糖溶液评分为10。在感官试验中，感官评价员被要求将10 mL 样品放入口中，在口腔内停留3～5 s 后吐出样品并评估感知味觉强度。试验过程中，样品温度维持在室温（23±1）℃范围内，每个样品之间需要停留2 min，期间呼吸新鲜空气并使用蒸馏水漱口，每个样品试验3 次，取平均值作为最终结果。感官结果表述为气味诱导甜味增强（odor induced sweetness enhancement，OISE），如式（1）所示为含气味成分的蔗糖溶液与含等量蔗糖的溶液之间的甜度差。
式中：Y 为OISE 值；R1 为含香气成分的蔗糖溶液的甜味强度；R2 为相同浓度的蔗糖溶液的甜味强度。
1.3.5 增甜验证试验
为探究不同浓度的蔗糖溶液对香气成分增甜效果的影响，将感官试验筛选出的香气成分分别加入到浓度为0、30、60、90 g/L 的蔗糖溶液中，采用相同的感官方法进行试验。
1.3.6 香气成分定性定量分析
经GC-MS 分析检测得到玫瑰茄的总离子流图，将其与NTST 17 质谱库中的标准图谱进行对比，结合文献共同确定挥发性成分的种类。采用峰面积归一化法计算出玫瑰茄花萼香气成分的相对含量[20-21]。
1.4 数据分析
采用GC-MS 再解析对玫瑰茄香气成分进行定性定量分析；使用Excel 2019、SPSS（21 版）、Origin 2021进行数据统计处理并绘制图形；OISE 采用单样本t 检验[22]，以评估均值是否不为0，即是否具有增甜效果。当p＜0.05 时，认为差异显著，p＜0.01 时，认为差异极显著，p＜0.001 时，认为差异高度显著。
2 结果与分析
2.1 与甜味相关的香气成分选择
采用GC/O-AT 技术选择出与甜味相关的香气成分，感官评价员进行气味的描述和鼻后气味强度的评定，结果见表2。
表2 GC/O-AT 选择出的与甜味相关的香气成分
Table 2 Sweet taste-related aroma components screened by GC/O-AT
序号 香气成分 气味描述 鼻后气息强度1己醛 水果香 2.31 2糠醛 焦糖香 1.62 3苯甲醛 花香 2.00 4 1-辛烯-3-醇 柑橘香 2.92 5辛醛 玫瑰香 2.00 6芳樟醇 茉莉香 2.31 7壬醛 苹果香 2.61 8 α-松油醇 水果香 2.07 9癸醛 橙皮香 1.38 10 香叶基丙酮 甜橙香 1.46 11 橙花叔醇 花香 1.15
由表2 可知，若将“柑橘香”、“苹果香”、“甜橙香”、“橙皮香”归为“水果香”，将“玫瑰香”、“茉莉香”归为“花香”，这些香气成分的气味描述可分为3 大类，即“水果香”、“焦糖香”、“花香”，这3 类香型在已有文献中被称为“甜香”，往往与“甜”味觉感知相关联，但是11 种香气成分对味觉作用的增强不仅仅受香气化合物的影响，具体味觉感知的影响还需要通过感官评价进行分析验证。
2.2 感官评价试验结果
结合描述性感官分析确定玫瑰茄中香气成分的风味属性及感知强度，包括嗅觉（“花香”、“果香”、“焦糖香”、“青草香”等）和味觉（酸、甜、苦、咸、鲜）。最终筛选出6 种与甜味感知相关的物质，包括3 种醛、2 种醇、1 种酮，结果如表3 所示。
表3 11 种香气成分的感官评价结果
Table 3 Sensory evaluation results of eleven aroma components
序号 香气成分 气味描述 味觉感知1 己醛 木质香、油脂味等 苦30%、酸30%2 糠醛 焦糖味、土豆味等 甜60%、咸20%3 苯甲醛 糖果味、杏仁气味等 甜40%、苦20%4 1-辛烯-3-醇 菌菇味、海鲜味等 鲜50%、咸30%5 辛醛 油脂味、苹果味等 鲜40%、咸20%6 芳樟醇 水果香、花香等 甜70%、酸20%7 壬醛 生鱼味、烧焦味等 苦60%、鲜20%8 α-松油醇 药味 苦60%、甜10%9 癸醛 花香、柑橘香等 甜40%、酸30%10 香叶基丙酮 清甜香、玫瑰香等 甜70%、苦10%11 橙花叔醇 香草香气、甜橙香等 甜50%、苦20%
由表3 可知，在这些化合物中，60%的感官评价员认为具有“焦糖味、土豆味等”的糠醛是甜味。苯甲醛被描述为“糖果味、杏仁气味等”，有40%的感官评价员认为其对甜味感知有影响。香叶基丙酮和芳樟醇分别具有“清甜香、玫瑰香等”和“水果香、花香等”，被70%的感官评价员描述为甜。呈现“花香、柑橘香等”的癸醛和 “香草香气、甜橙香等” 的橙花叔醇分别被40%、50%的感官评价员描述为“甜味”。己醛除了被描述为“木质香”、“油脂味”，还被部分感官评价员描述为“青草味”、“果香”、“甘草香”、“瓜子气息”，气味描述复杂多样，味觉感知亦是如此。与鲜味和咸味相关的化合物1-辛烯-3-醇，被描述为“菌菇味、海鲜味等”。辛醛被40%的感官评价员描述为鲜，20%的感官评价员描述为咸，具有“油脂味、苹果味等”气味。壬醛和α-松油醇分别被描述为“生鱼味、烧焦味等”和“药味”，60%感官评价员味觉感知为“苦”。杨婷等[23]在分析红糖挥发性成分时将辛醛描述为“油脂味”、苯甲醛被描述为“坚果味”、1-辛烯-3-醇被描述为“青草味和蘑菇味”等，这与本试验感官评价员描述基本一致。
2.3 味觉增强作用的结果分析
糠醛、苯甲醛、芳樟醇、癸醛、香叶基丙酮、橙花叔醇6 种香气化合物对30 g/L 的蔗糖溶液的甜度的影响结果如图1 所示。
图1 6 种香气成分在30 g/L 蔗糖溶液中的增甜效果
Fig.1 Sweetness enhancement effects of six aroma components in 30 g/L sucrose solution
* 表示影响显著（p＜0.05）；** 表示影响极显著（p＜0.01）。
由图1 可知，与30 g/L 蔗糖溶液相比较，糠醛、苯甲醛、芳樟醇、香叶基丙酮、橙花叔醇5 种香气化合物可显著增强30 g/L 的蔗糖溶液的甜度（p＜0.05），其中芳樟醇、香叶基丙酮、橙花叔醇的影响极显著（p＜0.01）。癸醛具有与甜味感知相关的果味和花香味，但是其对30 g/L 蔗糖溶液甜度的增强没有显著性影响（p＞0.05），可能是气味与滋味互作过程中嗅觉占主导作用。有研究证实糠醛具有焦糖气味，可以一定程度增加蔗糖溶液甜度[24]，苯甲醛可增强奶油蛋糕甜点的甜度[25]。芳樟醇在30 g/L 蔗糖溶液中的增甜效果最好，与芳樟醇相比，香叶基丙酮和橙花叔醇对30 g/L 蔗糖溶液的甜度提高较少，可能由于其感官描述分别被10%和20%的感官评价员描述为苦，影响了其增甜效果。
感官评价员由添加等量的甜味剂的低浓度蔗糖到高浓度蔗糖依次进行感官评价，图2 为芳樟醇、香叶基丙酮和橙花叔醇3 种甜味剂加入到不同浓度的蔗糖溶液中增甜的效果。
图2 香气成分在不同浓度蔗糖溶液中的增甜效果
Fig.2 Sweetness enhancement effects of aroma components in different concentrations of sucrose solutions
a.芳樟醇；b.香叶基丙酮；c.橙花叔醇。与未添加甜味剂组比较，* 表示差异显著（p＜0.05）；** 表示差异极显著（p＜0.01）；*** 表示差异高度显著（p＜0.001）。
由图2a 和2b 可知，芳樟醇、香叶基丙酮在0、30、60 g/L 的蔗糖溶液中能显著提高甜味，其中芳樟醇在30 g/L 的蔗糖溶液中增甜效果最好，香叶基丙酮在60 g/L 的蔗糖溶液中增甜效果最好，但在90 g/L 的高浓度蔗糖溶液中都不能显著提高甜味。由图2c 可知，橙花叔醇在0、30、60、90 g/L 的蔗糖溶液中均能显著提高甜味且OISE 差值小，说明不同浓度蔗糖溶液对橙花叔醇增甜效果影响较小，实际生产过程中可选择低浓度的糖溶液，减少糖的使用量同时发挥较好的增甜效果。有研究指出，蔗糖浓度的增加会提高挥发性香气的释放率，糖浓度持续增加会导致溶液中的黏度增加，可能促使挥发性香气与蔗糖相结合，从而抑制香气释放[26]。有研究表明，挥发性香气可与寡糖类化合物相结合形成糖苷类香气前体，抑制挥发性香气的持续释放[27]。综上所述，相关香气成分在30 g/L 或60 g/L 中对甜味感知影响最佳，增加至90 g/L 后有所下降，说明在高浓度的蔗糖溶液中的释放率受到很大抑制，在低和中浓度的蔗糖溶液下增甜最佳，差异极显著（p＜0.01）。
2.4 玫瑰茄挥发性成分定性定量分析结果
应用顶空固相微萃取技术对玫瑰茄样品进行前处理，利用GC-MS 分析得到玫瑰茄的总离子流图见图3，玫瑰茄挥发性物质成分及含量见表4。
图3 玫瑰茄挥发性成分GC-MS 的总离子色谱图
Fig.3 Total ion chromatogram of the volatile components of roselle
1.己醛；2.糠醛；3.苯甲醛；4.1-辛烯-3-醇；5.辛醛；6.芳樟醇；7.壬醛；8.α-松油醇；9.癸醛；10.香叶基丙酮；11.橙花叔醇。
表4 玫瑰茄挥发性成分定性定量分析
Table 4 Qualitative and quantitative analysis of volatile components of roselle
序号相信度/%分子式 CAS 号 化合物 相对含量/% 序号相信度/% 分子式 CAS 号 化合物 相对含量/%1 99C5H4O2 98-01-1 糠醛 12.64 29 95 C9H18O2 112-05-0 壬酸 0.86 296C9H18O 124-19-6 壬醛 7.32 3097C2H4O2 64-19-7 乙酸 0.37 3 96 C10H20O 112-31-2 癸醛 4.10 31 96 C10H18O 10482-56-1 α-松油醇 2.30 4 96 C6H12O 66-25-1 己醛 3.85 32 94 C10H18O 78-70-6 芳樟醇 1.75 5 97 C8H16O 124-13-0 辛醛 3.05 33 96 C15H26O 7212-44-4 橙花叔醇 1.01 6 91 C9H16O 18829-56-6 反式-2-壬烯醛 2.36 34 94 C9H20O 143-08-8 壬醇 0.61 7 93 C7H6O 100-52-7 苯甲醛 1.69 35 97 C8H16O 3391-86-4 1-辛烯-3-醇 0.54 8 94 C8H14O 2548-87-0 反式-2-辛烯醛 1.63 36 85 C10H18O2 34995-77-2 （E）-氧化芳樟醇 0.53 9 91 C7H12O 18829-55-5 反式-2-庚烯醛 1.18 37 90 C11H22O 75039-84-8 反-2-十一烯醇 0.34 10 94 C10H18O 3913-81-3 反式-2-癸烯醛 1.10 38 87 C10H18O 138-87-4 β-松油醇 0.34 11 93 C11H20O 2463-77-6 2-十一烯醛 0.73 39 91 C10H18O 562-74-3 4-萜烯醇 0.06 12 93 C9H14O 5910-87-2（E，E）-2，4-壬二烯醛 0.69 40 80 C15H26O 77-53-2 柏木脑 0.21 13 89 C8H8O 122-78-1 苯乙醛 0.62 41 95 C17H34O2 112-39-0 棕榈酸甲酯 1.97 14 96 C7H14O 111-71-7 庚醛 0.58 42 96 C19H34O2 112-63-0 亚油酸甲酯 0.63 15 82 C12H24O 112-54-9 十二醛 0.27 43 81 C13H22O2 105-90-8 丙酸香叶酯 0.39 16 91 C15H30O 2765-11-9 十五醛 0.22 44 81 C12H24O2 110-38-3 癸酸乙酯 0.35 17 95 C11H22O 112-44-7 十一醛 0.18 45 84 C19H32O2 301-00-8 亚麻酸甲酯 0.26 18 97 C15H24 87-44-5 β-石竹烯 13.54 46 83 C9H18O2 112-32-3 甲酸辛酯 0.20 19 91 C15H24 475-20-7 长叶烯 5.90 47 93 C16H22O4 84-74-2 邻苯二甲酸二丁酯 0.19 20 91 C15H24 483-76-1 Δ-杜松烯 5.78 48 88 C12H20O2 141-12-8 乙酸橙花酯 0.14 21 96 C15H24 6753-98-6 α-石竹烯 5.39 49 86 C13H22O 3796-70-1 香叶基丙酮 1.36 22 95 C15H24 3856-25-5 （-）-Alpha-蒎烯 2.49 50 94 C18H36O 502-69-2 植酮 1.10 23 95 C15H24 39029-41-9 γ-杜松烯 0.89 51 89 C13H20O 14901-07-6 β-紫罗兰酮 0.16 24 84 C10H16 586-62-9 萜品油烯 0.51 52 91 C8H14O 4312-99-6 1-辛烯-3-酮 0.09 25 80 C15H24 502-61-4 α-法呢烯 0.36 53 86 C9H14O 3777-69-3 2-戊基呋喃 1.56 26 80 C10H16 123-35-3 β-月桂烯 0.15 54 96 C10H12O2 97-53-0 丁香酚 1.18 27 90 C10H14 99-87-6 伞花烃 0.28 55 92 C10H18O 470-82-6 1，8-桉叶素 1.04 28 93 C15H30O2 1002-84-2 正十五酸 2.70 56 91 C14H22O 96-76-4 2，4-二叔丁基苯酚 0.24
由图3 和表4 可知，经定性分析可知总离子色谱图中共有78 个吸收峰，其中包括受仪器和萃取头材质的影响而出现的杂峰和一些相似度很低的不确定峰，通过筛选共鉴定出56 种化合物，包括醛类17 种（占总挥发性成分含量的40.26%）、碳氢化合物10 种（占总挥发性成分含量的33.66%）、醇类10 种（占总挥发性成分含量的7.35%）、酯类8 种（占总挥发性成分含量的3.95%）、酸类3 种（占总挥发性成分含量的3.75%）、酮类4 种（占总挥发性成分含量的2.59%）、其他化合物4 种（占总挥发性成分含量的3.95%）。蔡贤坤等[28]鉴别出玫瑰茄中的石竹烯、己醛、糠醛、庚醛、反式-2-庚烯醛、芳樟醇、壬醛、癸醛、2-戊基呋喃、香叶基丙酮、橙花叔醇等30 种香气成分与本试验结果一致，其中芳樟醇、α-松油醇作为玫瑰茄的特征性香气也测定出较高含量。由于本研究原料为干燥后的玫瑰茄，因此其糠醛、辛醛等醛类化合物种类多样，含量较高。Avalos-Martínez 等[29]研究表明玫瑰茄热饮中含有乙酸、己醛、苯甲醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、壬醛等挥发性成分，这与本研究结论一致。
本研究筛选出的与甜味感知相关的香气成分糠醛（12.64%）、苯甲醛（1.69%）、芳樟醇（1.75%）、癸醛（4.10%）、香叶基丙酮（1.36%）以及橙花叔醇（1.01%），其相对含量均高于1%，且Zannou 等[30]试验结果可知，玫瑰茄中醛类化合物与醇类化合物被确定为主要特征香气，因此该结果验证了GC/O-AT 试验结合甜味增强试验筛选出的除癸醛外5 种香气化合物能够有代表性的展现玫瑰茄良好的风味特征，同时为未来食品提供减糖新思路。
3 结论与展望
该研究结合气相色谱嗅闻技术，由嗅觉与味觉相互作用一致性原则，选出具有“花香”、“焦糖香”、“水果香”等风味属性的己醛、糠醛、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、辛醛、芳樟醇、壬醛、α-松油醇、癸醛、香叶基丙酮和橙花叔醇，共11 种香气化合物。根据感官描述可知，玫瑰茄中增甜成分有6 种，其中香叶基丙酮、糠醛、苯甲醛、芳樟醇、α-松油醇均能显著提高蔗糖溶液（30 g/L）的甜度，且芳樟醇的影响效果最佳。此外，由定量定性分析得到玫瑰茄中有56 种香气化合物，其中增甜成分的含量均高于1%。
本研究筛选出玫瑰茄中具有增甜效果的香气化合物，而酸味和甜味的协同表达才能带来味蕾极致的体验，因此其与酸味及其它滋味的相互作用产生的效果值得继续研究。其次，本研究以蔗糖溶液代替食物基质探究香气化合物的增甜效果，后续相关研究可以验证其在果汁、牛奶基质或复配物质下对风味感知的影响。最后，本研究对产自云南昆明的干玫瑰茄中香气成分进行定性定量分析，后续研究可从不同产地和干燥方式等方面扩大样本量，探究来自不同产地、经过不同干燥方式干燥的玫瑰茄中香气成分的变化。
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