福建平和蜜柚[Citrus maxima（Burm）Merr]是琯溪蜜柚的品种之一[1]，产量逐年上升，据统计年均产量已突破150 万t[2]，产值突破100亿元[3]。相较于逐年上升的产值，亟需解决的问题也越来越多。蜜柚食用或加工后的副产物果皮废弃物丢弃问题严重，造成固体废弃物的污染[4]，蜜柚果皮未得到充分利用。实际上蜜柚不仅果肉味美、鲜爽可口[5]，其果皮富含活性多糖、果胶、膳食纤维等成分，具有较高的营养价值和食用价值[6]。基于柚子皮潜在的活性成分与功能，柚子皮越来越受到研究者的关注。大量研究表明，柚子皮的主要成分之一活性多糖具有降血脂、降胆固醇和抑制菌体病毒生长等作用[7-10]。柚子皮粉能改善带鱼肌原纤维蛋白的凝胶特性，可作为改善鱼肉及其制品品质的添加剂[11]。此外，柚子皮还有止咳化痰的功效[12]，其大量的未知成分还有待开发利用[13]。但是对于柚子皮的综合利用开发还处在试验阶段，未形成产业化、规模化的生产。因此，开发利用柚皮资源，如提取多糖、香精油、果胶、黄酮等活性物质，获取蜜柚高附加值，将成为研究者的重要任务，这也是柚子产区柚子果品加工厂亟需解决的问题[6]。目前，关于对柚子皮中黄酮提取工艺的研究最多[14-15]，其次是柚子皮多糖的研究[16-17]，但选取的原料都是常山胡柚皮[16-17]，对于福建平和蜜柚的研究鲜见报道。本研究以福建平和蜜柚皮为原料，利用酶解提取柚子皮多糖，并通过响应面法确定福建蜜柚多糖提取的最佳工艺条件[18-21]。本研究将有利于解决福建蜜柚果皮造成的固体废弃物的问题，提高蜜柚的原料利用率，有利于福建地方经济的发展，以期为蜜柚皮废弃化利用的开发与研究提供参考。
1 试验材料与方法
1.1 材料与试剂
福建平和蜜柚：市售；果胶酶（30 000 U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；木瓜蛋白酶（＞50 万U/g）：北京奥博星生物技术有限公司；无水乙醇、95%乙醇（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；超纯水：湖南科尔顿水务有限公司。
1.2 仪器与设备
DK-S26 型恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；DHG-9245A 鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；RE-5205 旋转蒸发仪：上海昕仪仪器仪表有限公司；CTFD-10S 冷冻干燥机：青岛永合创信电子科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 试验方法
1.3.1 柚子皮多糖酶解提取工艺流程
称取自然风干的柚子皮10 g 置于锥形瓶中，加入液料比15∶1（mL/g）的95%乙醇在恒温水浴锅中处理2 h，经过滤、干燥备用。柚子皮与水按液料比混合，加入0.4%的果胶酶和0.1%的木瓜蛋白酶，置于55 ℃恒温水浴锅，提取液经80 ℃水浴灭活、活性炭沉淀（取物料质量的1%，80 ℃维持1 h）、旋转蒸发仪浓缩（真空度0.95 MPa，65 ℃）至20 mL 后，加入95%乙醇至占溶液体积分数为90%以上，析出粗多糖，4 ℃静置12 h，过滤，60 ℃干燥1 h，获得柚子皮多糖固体粉末。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 酶用量对柚子皮多糖得率的影响
在液料比15∶1（mL/g）、浸提时间2 h、浸提2 次的条件下，酶用量分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g，考察酶用量对柚子皮多糖得率的影响。每个试验2 组平行，每组重复3 次。
1.3.2.2 液料比对柚子皮多糖得率的影响
在酶用量0.9 g、浸提时间2 h、浸提2 次的条件下，液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），考察液料比对柚子皮多糖得率的影响。每个试验2 组平行，每组重复3 次。
1.3.2.3 浸提时间对柚子皮多糖得率的影响
在液料比20∶1（mL/g）、酶用量0.9 g、浸提2 次的条件下，浸提时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察不同浸提时间对柚子皮多糖得率的影响。每个试验2 组平行，每组重复3 次。
1.3.3 响应面优化试验设计
在单因素试验结果的基础上，根据响应面Box-Behnken 试验设计原理，选取酶用量A、液料比B、浸提时间C 3 个对柚子皮多糖提取影响显著的因子，以柚子皮多糖得率为响应值，采用三因素三水平响应面分析法设计试验水平因素表，见表1。
表1 试验因素水平设计
Table 1 Levels of test factors
水平 因素A 酶用量/g B 液料比/（mL/g） C 浸提时间/h-1 0.7 15∶1 1.5 0 0.9 20∶1 2.0 1 1.1 25∶1 2.5
1.3.4 柚子皮多糖得率计算
柚子皮多糖得率的计算公式如下。
W=M1/M0×100
式中：W 为柚子皮多糖得率，%；M1 为干燥后多糖固体粉末的质量，g；M0 为柚子皮质量，g。
1.4 数据处理
数据分析采用SPSS 19.0 进行单因素试验结果分析，采用Design Expert 10.0 进行响应面试验结果分析，图表绘制采用Origin 8.0 进行制图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶用量对柚子皮多糖得率的影响
酶用量对柚子皮多糖得率的影响如图1 所示。
图1 酶用量对柚子皮多糖得率的影响
Fig.1 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，柚子皮多糖得率随酶用量的增加而先升高后降低。酶用量为0.9 g 时，多糖得率最高为2.13%。此后随着酶用量增加，柚子皮多糖得率反而下降。在溶液反应过程中，果胶酶与底物进行特异性结合，分解果胶内部结构，破坏植物细胞壁释放多糖[22]。同时酶用量在0.1～0.9 g 时，有利于蛋白质的降解，可提高多糖得率。但酶用量过多，会大大阻碍酶与底物的定向反应，导致酶的催化效率降低，致使多糖得率下降[23]。因此，酶用量的最佳选用范围为0.7～1.1 g。
2.1.2 液料比对柚子皮多糖得率的影响
液料比对柚子皮多糖得率的影响如图2 所示。
图2 液料比对柚子皮多糖得率的影响
Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2 可知，柚子皮多糖得率随着液料比的增加而提高。液料比20∶1（mL/g）时，多糖得率最高2.77%。柚子皮液料比小于20∶1（mL/g）时，柚子皮与酶溶剂的接触面积和接触机会也相对变大，能够使多糖更多的与水分子接触，更好地溶解在水中[24]。液料比在20∶1～30∶1（mL/g）时，柚子皮多糖得率保持稳定，多糖溶解度一定时，液料比超过一定范围后，对可溶性多糖的溶解影响减弱。溶剂体积的变化也会造成后续浓缩能耗的增加，因此，液料比的最佳选用范围为15∶1～25∶1（mL/g）。
2.1.3 浸提时间对柚子皮多糖得率的影响
浸提时间对柚子皮多糖得率的影响如图3 所示。
图3 浸提时间对柚子皮多糖得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，在浸提时间0.5～2.0 h 时柚子皮多糖得率随浸提时间延长而提高。浸提时间2.0 h 时，多糖得率最高为2.73%。在一定时间范围内，浸提时间越长，多糖的溶解越多，呈现平衡状态[25]。浸提时间为2.0～3.0 h 时，对多糖得率影响变小，可能是底物与酶完全反应，多糖得率逐渐趋于稳定[26]。因此，浸提时间的最佳选用范围为1.5～2.5 h。
2.2 响应面优化试验
2.2.1 响应面试验分析
在单因素试验基础上，采用响应面分析法设计综合优化试验。以柚子皮多糖得率为响应值，以A 酶用量（g）、B 液料比（mL/g）、C 浸提时间（h）3 个因素为因子，设计三因素三水平的中心组合试验设计，响应面试验设计结果见表2。
表2 响应面试验设计结果
Table 2 Response surface design of experiments and results
组号A 酶用量/g B 液料比/（mL/g） C 浸提时间/h Y 多糖得率/%1 1.1 20 2.5 2.35 2 0.9 20 2.0 2.75 3 0.7 25 2.0 2.23 4 0.7 15 2.0 2.11 5 0.9 20 2.0 2.71 6 0.7 20 2.5 2.27 7 0.9 15 1.5 2.08 8 0.9 20 2.0 2.69 9 0.9 25 2.5 2.51 10 0.9 15 2.5 2.27 11 0.9 20 2.0 2.76 12 0.9 25 1.5 2.29 13 0.7 20 1.5 2.01 14 1.1 25 2.0 2.39 15 0.9 20 2.0 2.65 16 1.1 20 1.5 1.91 17 1.1 15 2.0 2.02
2.2.2 回归方程建立与分析
以柚子皮多糖得率为响应值，利用DesignExpert10.0软件对表2 试验结果进行分析，得到提取条件与多糖得率之间的二次多项式回归模型：Y=2.71+0.006 25A+0.12B+0.14C+0.063AB+0.045AC+0.007 5BC-0.34A2-0.19B2-0.24C2。
对数据进行方差分析，结果见表3。
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
注：** 表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 1.25 9 0.14 49.09 ＜0.000 1 **A 酶用量3.125×10-4 1 3.13×10-4 0.11 0.749 4 B 液料比 0.11 1 0.11 39.04 0.000 4 **C 浸提时间 0.15 1 0.15 54.44 0.000 2 **AB 0.016 1 0.016 5.52 0.051 1 AC 8.1×10-3 1 8.1×10-3 2.86 0.134 5 BC 2.25×10-4 1 2.25×10-4 0.08 0.786 1 A2 0.48 1 0.48 170.52 ＜0.000 1 **B2 0.15 1 0.15 51.49 0.000 2 **C2 0.24 1 0.24 84.65 ＜0.000 1 **残差 0.020 7 2.829×10-3失拟项 0.012 3 3.908×10-3 1.93 0.265 7净误差 8.08×10-3 4 2.02×10-3总离差 1.27 16
由表3 可知，回归模型具有高度显著性（P＜0.01），证明此模型已达到极显著水平；失拟项P 值为0.265 7，差异不显著（P＞0.05）。决定系数R2=0.984 4 说明响应值柚子皮多糖得率与预测值之间拟合较好。校正系数RAdj2=0.964 3，说明模型能解释96.43%的响应值变化。回归方程各项方差分析表明，B、C、A2、B2、C2 对多糖得率有极其显著的影响（P＜0.01），A、AB、AC、BC 对多糖得率影响不显著（P＞0.05）。各因子对多糖得率的影响显著性依次是C（浸提时间）＞B（液料比）＞A（酶用量）。
2.2.3 两因子间交互作用分析
响应曲面图及等高线图可明晰各因素间的交互作用及确定最佳点。因素影响显著则3D 曲面图的曲面坡度越陡峭，平坦则影响不显著[27]。疏离的椭圆形等高线代表两因素交互作用显著，反之，密集的圆形等高线代表交互作用不显著[28]。各因素的交互作用对柚子皮多糖得率的影响效果如图4 所示。
图4 任意两变量对多糖得率影响的响应曲面图
Fig.4 Response surface plots of the effects of interactions between any two variables on polysaccharide yield
由图4 可知，固定浸提时间2 h，液料比和酶用量两因素的响应面倾斜程度较小，等高线呈现近似圆形，说明两因素交互作用不显著。响应曲面图开口向下，说明在试验所选范围内存在极大值，液料比19∶1～21∶1（mL/g）、酶用量0.9～1.0 g 为最佳水平范围。
固定液料比20:1（mL/g），酶用量和浸提时间两因素的响应面倾斜程度较小，等高线呈现圆形，说明两因素交互作用不显著。响应曲面图开口向下，在试验所选范围内存在极大值，酶用量0.9～1.0 g、浸提时间1.9～2.1 h 为最佳水平范围。
固定酶用量0.9 g，液料比和浸提时间两因素的响应面倾斜程度非常小，等高线为圆形，说明两因素交互作用不显著。响应曲面图开口向下，说明在试验所选范围内存在极大值，液料比19∶1～21∶1（mL/g）、浸提时间1.9～2.1 h 为最佳水平范围。
2.2.4 最佳条件的预测及验证
通过回归模型的预测，酶解提取柚子皮多糖的最佳工艺参数：酶用量1.039 g、液料比22.195∶1（mL/g）、浸提时间2.181 h，此时多糖得率的理论最大得率为2.79%。考虑到实际生产需求，将工艺参数调整为酶用量1.0 g、液料比20∶1（mL/g）、浸提时间2 h。在此条件下进行3 次平行试验进行验证，柚子皮多糖的平均得率为（2.73±0.21）%，与理论预测值误差值仅为0.06%，证实了该模型的有效性。
3 结论
本研究采用酶解辅助提取了福建平和蜜柚皮多糖。以酶用量、液料比和浸提时间3 个因素为变量，以多糖得率为响应值，利用Box-Behnken 设计原理，成功建立了多糖得率的二次多项式模型。综合考虑模型预测数据和试验验证结果，最终确定了酶解提取蜜柚皮多糖的最佳工艺条件：酶用量1.0 g、液料比20∶1（mL/g）、浸提时间2 h，在此条件下蜜柚皮多糖得率可达到（2.73±0.21）%。本研究获得了福建平和蜜柚皮多糖，提高了柚皮的利用率，为果蔬的废弃资源再利用提供参考依据，也为福建蜜柚皮多糖的开发研究提供理论基础。
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