沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）为胡颓子科沙棘属的落叶性灌木或小乔木，又名沙枣、酸柳和黑刺等[1]。我国的沙棘面积占世界沙棘总面积的95%。研究表明，沙棘富含多种生理活性物质和营养成分[2-3]，具有抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗衰老、抗辐射和增强免疫力的作用[4]，在改善心脑血管系统和保护消化系统等方面均有较好的效果[5]。食用型酵素作为一种功能性食品，具有调节机体、预防疾病的作用，在良好的市场前景下，具有特殊保健功能的酵素产品研发潜力较大。故从食品安全性、功效以及经济效益综合考虑，沙棘是开发食用型酵素的优良植物资源之一[6-7]。目前，国内关于食用沙棘酵素的研究相对较少，现有研究主要集中于其体外抗氧化性方面[8]，而在沙棘酵素降脂活性方面的相关研究鲜有报道。
本研究以沙棘果实为主要原料，经过微生物自然发酵制备食用沙棘酵素，对得到的不同酵素产品与沙棘鲜果汁及市售沙棘原浆进行理化指标和抗氧化活性指标比较分析，并通过测定其脂肪酶活性、胆固醇酯酶活性抑制率和胆固醇胶束溶解度抑制率研究特种沙棘酵素的降脂性能，以期为相关沙棘酵素产品的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘：甘肃省兰州市新鲜浆果；橙子、红糖、玫瑰：市售；沙棘原浆：新疆金之源生物科技有限公司。
蒽酮（分析纯）：南京奥多福尼生物科技有限公司；考马斯亮蓝G250、牛磺胆酸钠（生化试剂）、胆固醇（分析纯）、橄榄油（化学纯）：国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：东京化成工业株式会社；对硝基苯基丁酸酯（生化试剂）：上海创赛科技有限公司；胆固醇酯酶（生物试剂）：南京都莱生物技术有限公司；总胆固醇试剂盒：厦门海菲生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
202-1A 型电热恒温干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；UV-2100 型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；HH-6 型数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；TGL-16G 型高速离心机：上海安亭科学仪器有限公司；iMark 型酶标仪：上海领成生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 沙棘酵素的制备
通过调整红糖、沙棘与水的质量比为1∶3∶10，利用微生物自然发酵6 个月，制备3 种不同配方的沙棘酵素。分别为纯沙棘酵素：沙棘果360 g；沙棘橙肉酵素：沙棘果180 g、橙肉90 g；沙棘玫瑰酵素：沙棘果180 g、玫瑰花瓣90 g。
1.3.2 总糖含量的测定
采用蒽酮比色法[9]测定总糖含量。试管中分别加入浓度为8、16、24、32、40、48、56、64、72 μg/mL 的葡萄糖溶液，再加入3 mL 蒽酮试剂，振荡摇匀后立刻沸水浴加热5 min，取出后放入冰水中迅速冷却（不断晃动），以1 mL 蒸馏水为空白重复上述操作。所得试管内溶液在640 nm 波长下测定吸光度。以葡萄糖含量（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=0.007 4x+0.002 9，相关系数R2=0.995 1。吸取酵素稀释液1 mL 于试管中，按照上述方法进行测定。将测得的吸光度代入标准曲线方程，算出每毫升酵素所含葡萄糖含量。
1.3.3 总蛋白含量的测定
分别精密移取牛血清蛋白标准溶液（0.1mg/mL）0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，补加蒸馏水至1.0mL 混匀，加入5.0 mL 考马斯亮蓝G250 溶液，摇匀后静置5 min，595 nm 波长下测定吸光度，以蛋白溶液浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=0.000 7x+0.011 1，相关系数R2=0.993 7。吸取5 组酵素稀释液1 mL，按照上述方法进行测定。读取吸光度，根据标准曲线方程计算得出浓度。
1.3.4 总还原力的测定
分别吸取5 组样品溶液1 mL 于试管中，加入1 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L、pH6.6）和1 mL 质量浓度为1%的铁氰化钾溶液，混匀后置于50 ℃水浴中反应20 min，用1 mL质量浓度为10%的三氯乙酸终止反应，3 000 r/min 离心10 min。取2 mL 上清液，加入2 mL 蒸馏水和0.4 mL FeCl3，混匀反应10 min，紫外可见分光光度计700 nm 波长下检测，平行3 次试验，取其平均值。吸光度越大，表示样品还原能力越强。
1.3.5 DPPH·清除率的测定
于试管中分别加入1 mL 样品溶液，2 mL DPPH 溶液（0.04 mg/mL），混匀，室温静置30 min 后，5 000 r/min离心10 min。取上清液于517 nm 波长下测吸光度。按式（1）计算DPPH·清除率。
式中：R 为DPPH·清除率，%；A0 为1 mL 无水乙醇+2 mL DPPH 溶液的吸光度；A1 为1 mL 样品溶液+2 mL DPPH 溶液的吸光度；A2 为1 mL 样品溶液+2 mL无水乙醇的吸光度。
1.3.6 脂肪酶活性的测定
取若干个锥形瓶，加入1 mL 橄榄油与5 mL 磷酸缓冲液（0.025 mol/L、pH7.5），以不含橄榄油为空白，40 ℃水浴5 min。将1 mL 稀释后的酵素加入锥形瓶中，摇匀计时5 min 后立即加入15 mL 95%乙醇，使酶反应终止。在每个锥形瓶中加入2 滴酚酞指示剂，用0.05 mol/L 氢氧化钠溶液滴定，记录消耗的NaOH 体积。按式（2）计算脂肪酶活性。
式中：P 为脂肪酶活性，U/mL；V 为滴定样品时消耗NaOH 的体积，mL；V0 为空白试验消耗NaOH 的体积，mL；50 为1 mL 0.05 mol/L NaOH 溶液相当于脂肪酸50 μmol；n 为酵素稀释倍数；15 为反应时间15 min。
1.3.7 胆固醇酯酶活性抑制率的测定
准确称取2.77 g 牛磺胆酸钠与5.844 g 氯化钠，用磷酸钠缓冲液（0.1 mol/L、pH7.0）定容至100 mL，作为整个反应体系的缓冲液。对硝基苯基丁酸酯预先溶解在乙腈中，胆固醇酯酶预先溶解于无菌水中（1 U/μL）。胆固醇酯酶加入后反应开始，室温反应5 min，于酶标仪中415 nm 波长下测定吸光度。胆固醇酯酶活性测定反应体系见表1。
表1 胆固醇酯酶活性测定反应体系
Table 1 Reaction system for determination of cholesterol esterase activity μL
注：-表示加入等体积蒸馏水。
项目 酶液 酵素稀释液 对硝基苯基丁酸酯 缓冲液空白管 5-2 150空白对照管--2 150抑制管 5 5 2 150背景对照管-5 2 150
按式（3）计算胆固醇酯酶活性抑制率。
式中：W 为胆固醇酯酶活性抑制率，%；A 为空白管溶液的吸光度；B 为空白对照管溶液的吸光度；C 为抑制管溶液的吸光度；D 为背景对照管溶液的吸光度。
1.3.8 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定
分别准确称取0.537 g 牛磺胆酸钠、0.077 g 胆固醇、0.141 g 油酸以及0.771 g 氯化钠，用磷酸缓冲液（pH7.4）定容至100 mL，利用超声波均质，37 ℃静置12 h。
将空白对照、100 μL 的酵素分别加入到4 mL 胶束溶液中，37 ℃培养2 h，并在16 000 r/min 下离心20 min，收集上清液用总胆固醇试剂盒测定胶束中胆固醇含量[10]。试验所用胆固醇酯酶活性为1 U/μL，抑制剂（酵素、果汁、原浆）稀释10 倍进行测定，即所得抑制率为不同样品对10 U/μL 的胆固醇酯酶的抑制率。按式（4）计算胆固醇胶束溶解度抑制率。
式中：K 为胆固醇胶束溶解度抑制率，%；A 为空白溶液的胆固醇溶解度；B 为样品溶液的胆固醇溶解度。
1.3.9 食用玫瑰沙棘酵素饮料指标的测定
将制备的玫瑰沙棘酵素用纯净水稀释10 倍，按常规饮料相关指标送样测定，由青岛拜恩检测技术服务有限公司实施。测定指标及方法：感官（色泽、气味）按照青岛拜恩检测技术服务有限公司实验室方法测定。能量、碳水化合物参照GB/Z 21922—2008《食品营养成分基本术语》[11]测定；蛋白质参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[12]测定；脂肪参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定；维生素C 参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》测定；维生素E 参照GB 5009.82—2016《食品安全国家标准食品中维生素A、D、E 的测定》；钠参照GB 5009.91—2017《食品安全国家标准食品中钾、钠的测定》[13]测定；微量元素钾、钙、镁、铁、铜、锌、锰、硒参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》[14]测定；菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[15]测定；大肠菌群参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定；金黄色葡萄球菌参照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》测定；沙门氏菌参照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》测定。
1.4 数据处理
所有试验设定均为3 个平行，数据处理与作图均采用Excel 2010。
2 结果与分析
2.1 沙棘酵素与沙棘果汁、沙棘原浆产品的总糖含量、总蛋白含量及抗氧化能力对比分析
对纯沙棘酵素、沙棘橙肉酵素、沙棘玫瑰酵素、沙棘果汁和市售沙棘原浆产品的总糖含量、总蛋白含量、总还原力及DPPH·清除率进行分析测定，结果如图1 所示。
图1 不同沙棘酵素与沙棘果汁及市售沙棘原浆的总糖含量、总蛋白含量、总还原力、DPPH·清除率
Fig.1 Comparison of total sugar，total protein content，total reducing power，and DPPH·scavenging rate of seabuckthorn Jiaosu products，seabuckthorn juice，and commercially available seabuckthorn raw pulp
a.总糖含量；b.总蛋白含量；c.总还原力；d.DPPH·清除率。
沙棘经发酵后，糖类被乳酸菌等微生物作为碳源利用，用于合成和分解代谢[16]，总糖浓度下降。由图1a可知，纯沙棘酵素、沙棘橙肉酵素、沙棘玫瑰酵素的总糖含量均低于沙棘果汁、市售沙棘原浆，沙棘玫瑰酵素的总糖含量最低，这可能是因为沙棘果汁、市售沙棘原浆制作时经过了浓缩处理，去除水分，且未经过发酵处理，因此糖分相对较高，而玫瑰中本身总糖含量就不高，占总物料的1/4，经自然发酵后，可发酵性糖消耗殆尽，因此总糖含量最低。蛋白质是维持人体正常机能的重要存在[17]，由图1b 可知，沙棘果汁、市售沙棘原浆及沙棘橙肉的总蛋白含量低于纯沙棘酵素和沙棘玫瑰酵素，可能与沙棘果及食用玫瑰中含有种类丰富的氨基酸有关[18]，同时经过发酵的沙棘酵素增加了一些微生物酶的含量。蒋增良[19]通过研究树莓发酵过程中蛋白质的含量变化发现，发酵前期，蛋白质含量一直呈现上升趋势。后期由于微生物对糖类物质的利用和次级代谢产物的积累导致部分微生物和细胞分解成小分子物质，蛋白质含量下降。110 d 后，发酵液中的蛋白质含量轻微上升，可能是微生物对原料本身进行分解，导致原料蛋白质逐渐溶出或菌体自溶所致[20]。
物质的总还原力大小能够反映其抗氧化活性[21]，且还原能力与吸光度呈正相关，吸光度越大即酵素还原力越强[22-23]。由图1c 可知，沙棘玫瑰酵素的总还原力最高，这与玫瑰中含量丰富的槲皮素、原花青素等有关[24-25]。DPPH·清除率是一种常用于评估酵素体外抗氧化活性的另一指标。由图1d 可知，沙棘果汁和市售沙棘原浆的DPPH·清除率较高于纯沙棘酵素、沙棘橙肉酵素及沙棘玫瑰酵素的DPPH·清除率，这可能是因为沙棘果汁和市售沙棘原浆中含有更多的抗氧化活性物质，如维生素C、多酚类化合物等。
由此可见，沙棘酵素中营养成分和生物活性成分的含量与发酵原料本身特性有关，经发酵能够较好地保留沙棘中的有益成分，甚至可以在一定程度上强化其生物活性。
2.2 特种沙棘酵素降脂试验结果分析
2.2.1 脂肪酶活性测定
不同样品的脂肪酶活性对比见图2。
图2 不同样品的脂肪酶活性对比
Fig.2 Comparison of lipase activity among different samples
由图2 可知，市售沙棘原浆中的脂肪酶活性最低，为26 U/mL；纯沙棘酵素与沙棘橙肉酵素的脂肪酶活性相差不大，分别为67 U/mL 和63 U/mL，略高于沙棘果汁；沙棘玫瑰酵素脂肪酶活性最高，为147 U/mL。
脂肪酶的本质是蛋白质，市售沙棘原浆中的脂肪酶活性低应与其加工过程有关，市售产品要经过高温杀菌工艺，而脂肪酶的活性范围一般在80 ℃以下，当温度在100 ℃以上时，脂肪酶结构遭到不可逆的破坏，催化活性消失。另外，pH 值对脂肪酶活性产生重要影响，过酸或过碱的环境下酶易失活，酵素的pH 值普遍较低，这也可能是测得脂肪酶活性不高的原因。食用玫瑰中含量丰富的原花青素能够提高脂肪酶活性，因此沙棘玫瑰酵素脂肪酶活性较为突出。
2.2.2 胆固醇酯酶活性抑制率测定分析
胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶，其抑制可以由多种物质产生，包括蛋白质、多糖和其他化合物。这些物质可能通过多种机制（如竞争性抑制、非竞争性抑制和混合性抑制等）来抑制胆固醇酯酶的活性从而减少部分胆固醇的生成，降低其生物利用度。不同样品的胆固醇酯酶活性抑制率对比结果见图3。
图3 不同样品的胆固醇酯酶活性抑制率对比
Fig.3 Comparison of cholesterol esterase inhibition rate among different samples
由图3 可知，不同样品的胆固醇酯酶活性抑制率排序为沙棘玫瑰酵素＞纯沙棘酵素＞沙棘橙肉酵素＞沙棘果汁＞沙棘原浆，分别为62%、60%、51%、49%、45%。沙棘玫瑰酵素具有更强的抑制胆固醇酯酶活性的能力，可能对降低血液中的胆固醇水平有益。文献资料表明，沙棘中丰富的活性物质具有一定的降脂效果。王文娟[26]用沙棘蛋白对小鼠进行灌胃处理4 周，2 型糖尿病小鼠的高血脂得到了显著的改善，其血清总甘油三酯、总胆固醇显著降低。另外沙棘花青素和沙棘多糖的效果也与沙棘蛋白的效果类似。本研究得出纯沙棘酵素的胆固醇酯酶活性抑制率高于沙棘果汁和沙棘原浆，可能是因为在发酵过程中，发酵基质原有的能够抑制胆固醇酯酶活性的物质充分溶出，并产生了新的生物活性物质，其对胆固醇酯酶具有一定的抑制作用。苏建辉等[27]通过比较9 种功能因子对胆固醇酯酶活性的抑制效果，发现槲皮素具有最强抑制作用，而本试验所选用的食用玫瑰和橙子中槲皮素含量均较高，因此混合酵素的抑制率也较高[28-29]。
2.2.3 胆固醇胶束溶解度抑制率测定分析
进入人体肠道内的胆固醇需要溶解于胆固醇胶束内才能被吸收，抑制胆固醇胶束溶解度就能有效抑制胆固醇的吸收、降低血液中胆固醇含量。不同样品的胆固醇胶束溶解度抑制率测定结果见图4。
图4 不同样品的胆固醇胶束溶解度抑制率对比
Fig.4 Comparison of cholesterol micelle solubility inhibition rate among different samples
由图4 可知，不同样品的胆固醇胶束溶解度抑制率大小为沙棘玫瑰酵素＞沙棘果汁＞沙棘原浆＞纯沙棘酵素＞沙棘橙肉酵素，分别为51%、43%、40%、38%、34%。
试验样品测得的不同的胆固醇胶束溶解度抑制率，是多种物质共同作用的结果，如植物甾醇能够有效抑制胆固醇胶束溶解度，槲皮素也具有一定抑制作用。图2～图4 的测定结果均表明沙棘酵素具有一定的降脂效果，其中添加了食用玫瑰的混合酵素降脂性能优于纯沙棘酵素、沙棘橙肉酵素、沙棘果汁及市售沙棘原浆。
2.3 玫瑰沙棘酵素饮料测定结果分析
玫瑰沙棘酵素相关指标检测结果为感官（色泽、气味）淡黄色、半透明、无杂质，有沙棘特有的果香；钾、钙、镁、铁、锌、锰、硒含量分别为113.4、5.9、8.9、2.0、0.4、0.1、0.3 mg/kg，铜未检出（＜0.1 mg/kg）；微生物中菌落总数＜10 CFU/mL，大肠菌群＜10 CFU/mL，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均未检出；营养成分中能量及蛋白质、脂肪、碳水化合物、钠、维生素C、维生素E 含量均为0。
由上述检测结果可看出，玫瑰沙棘酵素饮料中的钾、钙、镁、铁元素含量相对较高，还含有少量的锌、锰、硒元素。有研究表明，玫瑰花的花瓣、枝条、叶片中均含有较大量的Ca、Mg、Fe 元素及少量的Cu、Mn 元素[30]，且沙棘果汁中也富含微量元素Fe、Zn、Mn、Cu。因此，玫瑰沙棘饮料中丰富的微量元素与原料本身的特性有关，该酵素饮料可以补充人体所缺乏的K、Ca、Mg、Fe、Zn 等元素。
3 结论
通过对特种沙棘酵素中的活性成分进行测定与分析，发现沙棘酵素能够较好地保留沙棘的营养成分和活性功能，甚至在降脂活性方面优于沙棘；在发酵原料浓度几乎一致的情况下，酵素中生物活性成分的含量与发酵原料本身的特性有关。降脂试验表明，混合沙棘酵素具有较好的降脂作用，尤其添加了食用玫瑰的混合酵素降脂效果更为明显，其脂肪酶活性为147 U/mL，胆固醇酯酶活性抑制率为62%，胆固醇胶束溶解度抑制率为51%。进一步对玫瑰沙棘酵素饮料测定，发现其含有较多的钾、钙、镁、铁元素，还含有少量的锌、锰、硒元素，表明该酵素除了具有较好的降脂作用，还可适当补充人体所缺乏的一些元素。本研究为玫瑰沙棘酵素的制备提供了理论基础，为相关产品开发提供可行性方案。
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