雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种淡水单细胞藻类，隶属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属，普遍分布于自然界的淡水生境中[1]。在外界环境条件适宜时，微藻以游动状态存在，此时细胞呈卵圆形或椭圆形，依靠两条顶生、等长的鞭毛运动，这一阶段的细胞大多呈绿色，营养生长旺盛，生物量积累迅速。在受到环境胁迫时，雨生红球藻细胞以红色厚壁孢子形式存在，细胞鞭毛脱落，运动能力丧失，微藻细胞逐渐合成并积累虾青素，此阶段藻细胞内积累大量虾青素，雨生红球藻细胞内的虾青素含量可以占到细胞干重的1.5%～4.0%[2-3]，而且全部是高生物活性的3S、3S＇形态，因此，雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最佳“生物反应器”。虾青素是一种脂溶性的次级类胡萝卜素，属于菇烯类的不饱和化合物，虾青素是目前为止在自然界有机体中发现的抗氧化能力最强的物质[4]，其清除自由基和单线态氧淬灭的能力远远高于维生素E，比玉米黄质、番茄红素及β-胡萝卜素等常见抗氧化物质的抗氧化能力也要高10 倍以上。因其具有清除自由基、提高机体免疫力的作用，目前多被用作保健品辅料和食品添加剂[5-7]。虾青素的功能不仅如此，其还有良好的着色效果，可以进入生物体并贮存在组织中，例如农业农村部2003 年318 号公告中指定天然虾青素为水产动物唯一着色剂[8-9]。雨生红球藻不动孢子内积累大量虾青素，且均为具有高生物活性的3S、3S＇异构体，目前被公认为自然界中生产天然虾青素的最佳生物[10]。
然而自然条件下雨生红球藻合成虾青素的效率和对底物、能源的利用率都很低，基本无法支撑虾青素的工业化生产，因此使用外源化学物质进行人工诱导成为提高雨生红球藻生产虾青素能力的常用方法[11-17]。3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid，3-HB）通常被认为是生物体内关键的能量代谢中间产物之一[18]，它是分子量较小的高分子有机化合物，具有光学活性，纯态时可结晶，羟基基团能缔合，易溶于水、乙醇、乙醚、干蒸易分解等特点。目前，已有研究证实3-羟基丁酸具有一系列重要的生理活性，例如可以促进神经胶质细胞和成骨细胞生长，增强颗粒细胞和半颗粒细胞的体外吞噬作用，提高血细胞内溶菌（lysozyme，LZM）和血清酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）的活性[19]，除此外在临床医疗领域，3-羟基丁酸及其聚合物已被用来治疗出血性休克等多种疾病[20]。虽然3-羟基丁酸具备许多生理功能且具有重要的临床医疗价值，但是在诱导微藻积累次级代谢产物方面尚未得到应用，因此利用3-羟基丁酸研究雨生红球藻是一个创新性的试验，通过研究它对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响可以更进一步地寻找雨生红球藻更优的培养条件。本研究主要探索3-羟基丁酸对雨生红球藻光系统Ⅱ（pthotosystem Ⅱ，PSⅡ） 光化学活性与色素合成的影响，以期为藻源虾青素的生产提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雨生红球藻（H.pluvialis）：天津市水产生态及养殖重点试验室；3-羟基丁酸标准品（3CAS 300-85-6，纯度≥98%）：美国Sigma-Aldrich 公司；BBM 培养基配方试剂（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.2 仪器与设备
调制脉冲荧光仪（IMAGING-PAM）：德国WALZ有限公司；紫外-可见分光光度计（TU-1810）：北京普析通用仪器有限责任公司；超声波细胞破碎仪（JY92-Ⅱ）：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 试验设计
以BBM 培养基对H.pluvialis 进行培养（配方见表1），设置光照强度为55 μmol/（m2·s），光暗比为12 h：12 h，培养温度为（22±1）℃。每天摇动培养瓶6 次，防止细胞附壁或下沉。
表1 BBM 培养基配方
Table 1 BBM medium formula
试剂 浓度/（mg/L） 试剂 浓度/（mg/L）NaNO3 250 FeSO4·7H2O 4.98 K2HPO4 75 H3BO3 11.42 MgSO4·7H2O 75 ZnSO4·7H2O 8.82 CaCl2·2H2O 25 MnCl2 1.44 KH2PO4 175 MoO3 0.71 NaCl 25 CuSO4·5H2O 1.57 EDTA 50 Co（NO3）2·6H2O 0.49 KOH 31
将培养至对数生长期的H.pluvialis 接种到250 mL三角瓶中，各试验组微藻初始密度均为5×105 cells/mL，培养体系体积控制在150 mL。试验设置的3-羟基丁酸浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10 μg/L，每个试验组均设置3 次平行。试验周期为30 d，每3 d 取样分析1 次。
1.3.2 H.pluvialis PSⅡ光化学活性测定
使用调制脉冲荧光仪测定PSⅡ光化学活性。向比色杯中依次加入3 mL 双蒸水和15 μL 藻液，混匀，将样品暗适应15 min，读取最大光能转化效率（Fv /Fm）、有效光能转化效率（Yield）和表观电子传递速率（electron transfer rate，ETR）的数值。
1.3.3 H.pluvialis 叶绿素a 含量测定
吸取2 mL 藻液置于离心管中，4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，用移液枪吸去上清液，加入80%丙酮对藻泥进行再悬浮，然后用锡箔完全包裹离心管，在暗处置于55 ℃水浴中30 min，再于4 ℃下以12 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至10 mL 离心管中，并用80%丙酮定容至5 mL，使用紫外-可见分光光度计测定663 nm 处吸光值（A663），然后根据下列公式计算叶绿素a 含量（Y，mg/L）[21]。
1.3.4 H.pluvialis 虾青素含量测定
取5 mL 藻液进行离心，去上清液，向沉淀加入5 mL双蒸水，重复此过程2 次。加入5% KOH+30%甲醇混合液去除叶绿素。再次离心后加入5 滴乙酸降低pH值，收集藻泥后加入2 mL 丙酮，用细胞破碎仪处理10 min，然后用二甲基亚砜抽提至藻团呈白色。用紫外可见分光光度计测定抽提液在490 nm 下的吸光度A490[22]。虾青素含量（X，mg/L）参照如下公式计算。
X=4.5×A490×VA×VB
式中：VA 为二甲基亚砜体积，mL；VB 为藻液体积，mL。
1.4 数据统计与分析
各试验组数据均以平均值±标准差表示。使用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，并且采用Duncan 方法进行多重比较，显著性水平P=0.05。
2 结果与分析
2.1 3-羟基丁酸对H.pluvialis PSⅡ光化学活性的影响
2.1.1 3-羟基丁酸对H.pluvialis Fv/Fm 的影响
3-羟基丁酸对H.pluvialis 最大光能转化效率的影响如图1 所示。
图1 3-羟基丁酸对H.pluvialis Fv/Fm 的影响
Fig.1 Effect of 3-hydroxybutyric acid on Fv/Fm in H.pluvialis
不同字母表示同一时间各处理组间差异显著（P＜0.05）。
Fv/Fm 为最大光能转化效率，反映了植物PS II 的潜在最大光合能力，环境条件改变时微藻Fv/Fm 会发生显著变化。整体来看，3-羟基丁酸处理组的雨生红球藻Fv/Fm 从试验开始至第18 天有缓慢下降趋势，此后有一定程度上升，说明雨生红球藻的PS II 反应中心经过一段时间后对3-羟基丁酸产生了一定的抗性，然而随着时间的延长藻受到的损害更加严重，从第21 天开始Fv/Fm 值又呈现逐渐下降趋势。试验期间，浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.10 μg/L 的雨生红球藻Fv/Fm 较初始状态分别降低了9.7%、13.6%、13.6%、25.7%，在大多数时间，3-羟基丁酸处理组的微藻Fv/Fm 均显著低于对照组的微藻Fv/Fm（P＜0.05）。结果表明在缺氮条件下3-羟基丁酸处理组对雨生红球藻加强了胁迫作用，并且在0.01 μg/L 的处理组时Fv/Fm 值下降幅度最大。
2.1.2 3-羟基丁酸对H.pluvialis 实际光化学量子产量的影响
3-羟基丁酸对H.pluvialis 实际光能转化效率的影响如图2 所示。
图2 3-羟基丁酸对H.pluvialis 实际光化学量子产量的影响
Fig.2 Effect of 3-hydroxybutyric acid on Yield in H.pluvialis
不同字母表示同一时间各处理组间差异显著（P＜0.05）。
Yeild 为实际光能转化效率，反映植物PS II 在部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率。由图2 可知，3-羟基丁酸处理组的Yield 参数在3 d 时，除0.02 μg/L组外，其他各3-羟基丁酸处理组的Yield 参数显著低于对照组的参数（P＜0.05）；在6、9、21、24 d 时，0.10 μg/L 组的Yield 参数均低于对照组（P＜0.05）；在18 d 时，各处理组的Yield 参数均显著低于对照组（P＜0.05）。至试验第27 天时，0.02 μg/L 和0.10 μg/L 浓度组的雨生红球藻Yield 参数下降幅度最明显，相比较初始阶段分别降低了25%和16%，而其他浓度组的微藻Yield 数值下降幅度均未超过10%。说明3-羟基丁酸降低了雨生红球藻PSⅡ的实际光合能力。
2.1.3 3-羟基丁酸对H.pluvialis 光合电子传递速率的影响
3-羟基丁酸对H.pluvialis 表观光合电子传递速率的影响如图3 所示。
图3 3-羟基丁酸对H.pluvialis ETR 的影响
Fig.3 The effect of 3-hydroxybutyric acid on ETR in H.pluvialis
表观光合电子传递速率（electrontransportrate，ETR）是反映植物PS II 反应中心活性与光合电子传递效率强弱的一个重要指标，其数值影响因素较多，主要与光强、植物吸收入射光和能量分布比例以及光子通量密度有关。由图3 可知，3-羟基丁酸处理组的雨生红球藻ETR 参数在第3 天时，除0.02 μg/L 组外，其余各处理组的雨生红球藻ETR 均显著低于对照组（P＜0.05）；在6、9 d 时，0.01μg/L 组和0.10 μg/L 组雨生红球藻ETR 低于对照组；在24、27 d 时，0.1 μg/L 组的雨生红球藻ETR显著低于对照组；在第30天各3-羟基丁酸处理组的雨生红球藻ETR 显著低于对照组的ETR 参数值（P＜0.05），说明3-羟基丁酸降低了雨生红球藻PSⅡ的实际光和能力。直至试验结束时，0.02 μg/L 组和0.10 μg/L 组的雨生红球藻ETR 参数下降幅度最大，分别较初始阶段降低了12.5%和32.9%，说明0.02 μg/L 和0.10 μg/L 浓度的3-羟基丁酸对于降低光合电子传递效率更加明显。
2.2 3-羟基丁酸对H.pluvialis 色素合成的影响
3-羟基丁酸处理条件下，微藻资源在光合作用与抗逆合成之间权衡分配的情况，通过构建雨生红球藻细胞内虾青素与叶绿素a 含量比值这一指标来反映，如图4 所示。
图4 3-羟基丁酸对H.pluvialis 虾青素与叶绿素a 含量比值的影响
Fig.4 Effect of 3-hydroxybutyric acid on the content ratio of astaxanthin to chlorophyll a in H.pluvialis
* 表示显著低于对照组（P＜0.05）。
试验期间，雨生红球藻的虾青素与叶绿素a 含量的比值呈现波动变化，其中在第6、12、27 天出现极大值，在第9 天和第21 天出现极小值，从第27 天后又开始呈逐渐降低的趋势。3-羟基丁酸处理对雨生红球藻虾青素与叶绿素a 含量比值的影响明显高于对照组的含量比值，其中6、12、15、18、24、27、30 d 时，0.01 μg/L 组的数值显著高于其他浓度组（P＜0.05），这与Ding 等[23]使用叔丁基羟基茴香醚作为诱导物的结果相类似。试验结果说明3-羟基丁酸影响了雨生红球藻自身资源在光合作用与抗逆合成之间的权衡分配，而低浓度的影响作用更强。
2.2.1 3-羟基丁酸对H.pluvialis 叶绿素a 合成的影响
随着试验逐步进行，不同浓度的3-羟基丁酸对雨生红球藻进行胁迫处理，雨生红球藻细胞内的叶绿素a 含量呈波动变化趋势如图5 所示。
图5 3-羟基丁酸对H.pluvialis 叶绿素a 合成的影响
Fig.5 Effect of 3-hydroxybutyric acid on chlorophyll a synthesis in H.pluvialis
从图5 中可以看出，随着试验时间的不断延长，雨生红球藻合成叶绿素a 含量变化呈不规律情况。微藻细胞内的叶绿素a 含量在试验3、9、21 d 出现极大值，在6 d 和12 d 出现极小值，从21 d 开始又逐渐降低。试验期间，雨生红球藻中的叶绿素a 含量最高超过0.6 mg/L（21 d）。
2.2.2 3-羟基丁酸对H.pluvialis 虾青素合成的影响
3-羟基丁酸对H.pluvialis 虾青素合成的影响如图6 所示。
图6 3-羟基丁酸对H.pluvialis 虾青素合成的影响
Fig.6 Effect of 3-hydroxybutyric acid on astaxanthin synthesis in H.pluvialis
从图6 中可以看出随着试验时间的延长，雨生红球累积虾青素含量逐渐缓慢呈现上升趋势，从试验开始至第24 天各试验组的虾青素水平呈缓慢上升趋势，从第24 天开始藻细胞虾青素含量积累出现大幅快速增长，且在第27 天虾青素含量的积累达到了最高峰，此时0.01 μg/L 组的虾青素含量最高达到7.57 mg/L，是对照组的1.67 倍，由此可知，3-羟基丁酸对微藻的生长虽然没有促进作用。此后各试验组的虾青素水平出现迅速回落。
3 讨论
3.1 3-羟基丁酸对H.pluvialis PSⅡ光化学活性的影响
叶绿素a 是微藻光合作用时需要的主要色素，是绿色叶片进行光合作用时捕获光能的重要物质，其含量的高低在一定程度上反映了微藻光合能力的强弱[24]。当微藻受到环境胁迫时，光合作用同时受到抑制，导致光合效率降低，藻细胞吸收的部分光能通过热量和荧光形式散发出来，因此通过测定叶绿素荧光参数可以了解微藻光合机构受胁迫而损伤的程度[25]。并且有研究证实，环境胁迫会使藻类的PSⅡ反应中心的受损，降低PSⅡ反应中心活性、电子传递效率和光能的转化效率。在本研究中，通过用3-羟基丁酸处理，结果造成雨生红球藻细胞PSⅡ光化学参数Fv /Fm、Yield 和ETR 均出现不同程度降低，说明3-羟基丁酸是雨生红球藻生长的胁迫因子，而试验中Yield 和ETR 之间的变化趋势更为接近，发现它们之间具有较强相关的联系。
3.2 3-羟基丁酸对H.pluvialis 色素合成的影响
本研究主要考察了雨生红球藻细胞内的叶绿素a 和虾青素的含量变化，叶绿素a 含量反映微藻的光合能力，虾青素含量反映微藻的抗逆水平。在本试验中雨生红球藻细胞内的叶绿素a 含量随时间延长呈波动变化趋势，而3-羟基丁酸加剧了这种变化波动，这可能是微藻的光合机构在胁迫抑制和损伤修复共同作用下的结果。在试验后期（27～30 d）雨生红球藻的叶绿素a 含量出现极小值，说明3-羟基丁酸对微藻的胁迫超出了其修复作用的限度，这也得到了微藻3 种PSⅡ光化学参数均出现不同程度降低现象的同步印证。本研究结果表明，虽然3-羟基丁酸对雨生红球藻的光合能力造成抑制，却能够提高微藻合成与积累虾青素的能力，这与岳陈陈等[26]使用褪黑素作为诱导物的研究结果类似。此外，本试验还发现较低浓度（0.01 μg/L） 的3-羟基丁酸有利于雨生红球藻合成虾青素，但当浓度较高时虾青素的积累反而受到抑制，此现象说明0.01 μg/L 适合作为3-羟基丁酸诱导雨生红球藻积累虾青素的使用浓度，而高浓度3-羟基丁酸对雨生红球藻施加的胁迫可能已经超出了其抗逆能力的限度。3-羟基丁酸对雨生红球藻具有双重作用，不仅具有抑制叶绿素a 合成的作用，还具有促进虾青素积累的作用。因此，雨生红球藻的生长和虾青素的积累与其所处的环境胁迫有着密切关系，由于雨生红球藻在逆境条件下积累虾青素的自我保护机制，所以适宜胁迫条件下会增加雨生红球藻积累虾青素的含量。
4 结论
3-羟基丁酸对雨生红球藻PSⅡ光反应中心造成了胁迫损伤，在胁迫条件下雨生红球藻的光合结构和功能都受到了一定的伤害。微藻细胞PSⅡ光化学参数Fv/Fm、Yield 和ETR 均出现不同程度降低，其中0.02、0.10 μg/L 组的作用最明显，降低的数值显著高于其他组，并且通过虾青素与叶绿素比值的分析同样证明0.01 μg/L 浓度对雨生红球藻积累虾青素为最好的浓度。3-羟基丁酸造成雨生红球藻叶绿素a 含量波动变化并最终下降至较低水平；3-羟基丁酸能够促进雨生红球藻合成并积累虾青素，其中3-羟基丁酸的浓度为0.01 μg/L 时，雨生红球藻积累虾青素效果优于其他组，在到达积累峰值时最高积累量为7.57 mg/L，是对照组的1.67 倍。3-羟基丁酸会对雨生红球藻的光合作用产生影响，同时会干涉雨生红球藻自身资源在光合作用与抗逆合成之间的权衡分配。
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