沙芥[Pugionium cornutum（L.）Gacrtn.]，十字花科植物，又名沙萝卜、沙盖，二年生植物。蒙药中沙芥以根入药，茎叶无明确利用方式，但是沙芥茎叶占总株比例较大，占全株的2/3，茎叶一年可多次刈割，产量大，成本低。随着内蒙古地区蒙药植物种植规模化发展，对茎叶的利用不足不仅会导致其生物活性资源浪费，还会降低当地农牧民种植沙芥的积极性。沙芥防风固沙能力强，能改善当地的生态系统，被称作“沙漠英雄”。
沙芥具有镇痛止咳、消食解毒、提高机体免疫力等功效[1-3]，被广泛应用于蒙药中。沙芥具有很高的价值[4-5]，既可以当做日常食品来食用，也可以作为中药材达到防病治病的目的，是沙区牧民的重要蔬菜之一。沙芥不仅具有丰富的营养物质，还含有黄酮、生物碱、甾醇等化学物质[6-8]，多数在草原地带与沙区地带生长[9]。内蒙古沙漠戈壁地区分布较多，少水多干旱、植被覆盖较少、不适宜居住和畜牧，在沙漠中少有植物生长，而沙芥属于其中分布最广的植物之一[10]。
益生菌是一种能改善和增强人体肠道菌群平衡的活性微生物，对人体整体健康和生理机制的发展具有良好的影响和促进作用[11]。使用益生菌等生物发酵技术开发营养和多功能发酵果蔬汁饮料，不仅可以延长果蔬汁的保质期还能抑制其他真菌的生长，也能使饮料获得更好的发酵风味和较高的营养价值[12]。同时，利用益生菌乳酸菌微生物发酵技术，不仅可以优化果蔬汁的风味，还具有改良果蔬汁风味[13-16]、促进人体消化系统健康、提高果蔬汁营养价值、增强机体免疫力等作用[17-20]。本文利用3 种乳酸菌发酵沙芥，改善沙芥辛辣的口味，以期为沙芥生产加工提供思路以及理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙芥：来自内蒙古乌审旗农牧民家；乳酸菌（植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）：保藏于内蒙古自治区农牧业科学院实验室。
1.2 仪器与设备
JL-CJ-H1B 超净工作台：上海靳澜仪器制造有限公司；YXQ-50A 立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；UV-1800 紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；XK96-A 快速混匀器：姜堰市新康医疗器械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 沙芥青汁的制备
首先挑选无病虫害的沙芥，用清水清洗去掉表面污垢之后，用90 ℃以上的蒸馏水漂烫5 min，起到破酶作用。将破酶的沙芥放入冷水降温，切段后打浆榨汁，按照沙芥浆∶水=1∶4（体积比）的比例进行稀释后用两层纱布过滤，获得沙芥青汁。
1.3.2 灭菌、接种发酵
经115 ℃灭菌15min 后的沙芥青汁，冷却至40 ℃，在无菌条件下，接种已经活化好的植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌3 种菌种，放入恒温培养箱中培养，发酵后于4 ℃冰箱中保存。
1.3.3 复合乳酸菌组成比例确定
将制备好且传代至少3 代，活化后的3 种菌。植物乳杆菌（记为a 菌）、嗜热链球菌（记为b 菌）、保加利亚乳杆菌（记为c 菌）按照2%的接种量分别接种到液体MRS 培养基中，每隔2 h，测定3 种菌的OD 值、酸度以及活菌数，以1%～7%的接种量分别接入到沙芥汁中，36 ℃条件下，培养16 h，测定活菌数与酸度，研究不同接种量对发酵的影响。根据单菌发酵结果，以活菌数为主要指标，酸度为次要指标，得出最佳的菌株添加量，以最佳条件相邻两水平进行三因素三水平正交试验，通过正交试验与验证试验测定发酵液活菌数与酸度，以此得到沙芥汁发酵的最佳乳酸菌添加比例。
1.3.4 工艺优化试验设计
取适量沙芥青汁于锥形瓶，60 ℃杀菌30 min 后放置至室温，以沙芥青汁发酵液中的活菌数与酸度作为考察指标，进行单因素试验。单因素条件包括复合乳酸菌接种量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，发酵温度33、36、39、42、45 ℃，发酵时间0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h，蔗糖添加量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%。
根据单因素试验结果，选取发酵时间、发酵温度、复合接种量为考察因素，以酸度和活菌数为指标，采用L9（33）正交试验设计，研究沙芥汁发酵的最优工艺条件。
1.3.5 感官评价
根据上述最佳工艺条件制备沙芥乳酸菌发酵饮料，进行成品品质测定。选择10 位农科院研发专员，其中5名男性，5 名女性，年龄为25～45 岁，评价标准见表1。
表1 沙芥乳酸菌发酵饮料的感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standard for fermented beverages made of Pugionium cornutum lactic acid bacteria
类别 状态 分值组织状态 有明显分层，有沉淀 1～＜4质地稍差，有少量沉淀 4～＜8组织状态均匀，无沉淀 8～10色泽 色泽发黑或呈黄褐色 1～＜4呈绿色或发黄 4～＜8颜色均匀，呈鲜绿色 8～10气味 无香味或有不适香味 1～＜4有少量香味 4～＜8有产品固有香味，清香味 8～10口感 有不适口，过酸或过甜 1～＜4口感一般，微酸或微甜 4～＜8酸甜适中 8～10
1.4 数据处理
将每次试验重复3 次，数据均以平均值表示。试验数据采用SPSS22.0 进行处理。
2 结果与分析
2.1 复合发酵菌配比
2.1.1 3 种菌的生长曲线
不同发酵时间条件下3 种菌菌浓度的变化情况见图1。不同发酵时间条件下3 种菌活菌数的变化情况见图2。
图1 不同发酵时间3 种菌菌浓度的变化
Fig.1 Changes in the concentrations of three kinds of bacteria at different time
图2 不同发酵时间3 种菌活菌数的变化
Fig.2 Changes in the viable bacteria counts of three kinds of bacteria at different time
由图1～图2 可知，3 种菌符合微生物的生长规律。通过对3 种菌OD 值以及菌浓度的分析，明确了3 种菌在不同时期的不同发酵特性，3 种菌在16 h 时均处于稳定期，初步可以拟定稳定的发酵时间为16 h。b 菌OD 值在12 h 后基本趋于稳定，但是活菌数在相同发酵时间却呈下降趋势，这说明菌浓度虽然小幅度增大或者基本不变，但其中一部分菌已经失去活性，导致活菌数呈下降的趋势。
不同发酵时间条件下3 种菌pH 值与酸度的变化见图3～图4。
图3 不同发酵时间3 种菌pH 值的变化
Fig.3 Changes of pH of three kinds of bacteria at different time
图4 不同发酵时间3 种菌酸度的变化
Fig.4 Changes of acidity of three kinds of bacteria at different time
由图3 和图4 可知，可以看出3 种菌pH 值与酸度变化的趋势整体相似，随着发酵时间增长，酸度上升，上升到一定程度后保持稳定。且a 菌和c 菌在培养液为发酵条件的基础上，发酵能力均高于b 菌。根据试验结果可知，3 种菌在发酵时间14～18 h 内产酸能力，活菌数较高，说明这个发酵时间段内，a、b、c 3 种菌的发酵能力较强。
2.1.2 单菌不同接种量对发酵的影响
将活化后的3 种乳酸菌在无菌条件下以不同接种量（1%～7%）接种到沙芥青汁中，发酵温度36 ℃于培养箱中培养16 h，测定活菌数与酸度，结果如图5 所示。
图5 3 种菌在不同接种量条件下对活菌数与酸度的影响
Fig.5 Effect of three types of bacteria on the number of viable bacteria and acidity under different inoculation conditions
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为a 菌、b 菌、c 菌。不同字母表示差异显著，P＜0.05。
一般条件下，益生菌活菌数越多，发酵能力越强。适量地增加接种量会加快乳酸菌的生长，节省发酵时间，但是当接种量过大，又会抑制乳酸菌的生长，导致活菌数数量下降。由图5 可知，当3 种菌在接种量为3%～5%时，活菌数和酸度表现较好。选取接种量3%、4%、5%3 个水平参加正交试验，从而确定3 种菌复合的比例。
2.1.3 复合菌发酵试验
2.1.3.1 复合乳酸菌接种比例的确定
复合乳酸菌接种比例的正交试验设计与结果如表2 所示。
表2 复合乳酸菌接种比例的正交试验设计与结果
Table 2 Orthogonal experimental design and results of the inoculation ratio of composite lactic acid bacteria
序号 a 菌接种量/%酸度/°T 活菌数（×107 CFU/mL）1 1（3） 1（3） 1（3） 0.90 66 2 1 2（4） 2（4） 0.86 44 3 1 3（5） 3（5） 0.77 33 4 2（4） 1 2 0.86 14 5 2 2 3 0.94 35 6 2 3 1 1.07 14 7 3（5） 1 3 0.73 10 8 3 2 1 1.20 13 9 3 3 2 0.81 13酸度k1 0.84 0.83 1.05 k2 0.95 0.10 0.84 k3 0.91 0.88 0.81 R 0.11 0.17 0.19活菌数k1 47.00 30.00 31.00 k2 21.00 30.60 23.60 k3 12.00 20.00 26.00 R 35.00 10.60 7.40 b 菌接种量/%c 菌接种量/%
由表2 可知，以活菌数为指标时，3 种乳酸菌对于沙芥汁发酵的影响大小分别为a＞b＞c，即影响活菌数的主要因素为a 菌，其次是b 菌和c 菌，3 种菌复合的最佳比例为a1b1c1，从另一辅助指标酸度来看，根据正交试验进行极差分析，3 种乳酸菌对于酸度的影响大小分别为c＞b＞a，即影响酸度的主要因素为c 菌，其他次要因素为b 菌和a 菌，综合分析，选取3 种菌复合的比例a2b3c1 为最佳。
根据人体胃酸环境要求，选取3 个组合进行验证试验，结果见表3。
表3 验证试验
Table 3 Validation experiment
组合 活菌数/（×107 CFU/mL） 酸度/°T a1b2c1 90.5 0.56 a1b1c2 71.0 0.51 a2b2c1 116.5 0.73
根据验证试验数据分析，根据试验主要指标为活菌数来看，a2b2c1 活菌数最高，且酸度最高。因此3 种菌复合的最佳比例确定为a 菌∶b 菌∶c 菌=4∶4∶3（质量比）。
2.1.3.2 复合乳酸菌接种量的确定
复合菌接种量对活菌数和酸度的影响见图6。
图6 复合菌接种量对活菌数和酸度的影响
Fig.6 Effect of compound bacteria inoculation amount on the number of viable bacteria and acidity
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图6 可知，不同接种量的复合乳酸菌在相同的发酵条件下，沙芥汁发酵液的活菌数随着接种量的增加而增加，在接种量达到5%时，酸度与活菌数均达到最高，此时，酸度为0.87 °T，活菌数为1.26×109 CFU/mL；当接种量为5%时，活菌数与其他组有明显差异，酸度与其他组差异不大；当继续增加接种量，活菌数和酸度开始下降，说明当接种量达到了一定程度，反而不利于乳酸菌的发酵，抑制了乳酸菌的发酵。由试验数据分析，选择最佳条件相邻两水平，即复合菌接种量为4%、5%、6% 3 个水平进行后续正交试验。
2.2 沙芥青汁发酵条件的优化
2.2.1 发酵温度对沙芥汁发酵的影响
不同发酵温度对活菌数和酸度的影响见图7。
图7 不同发酵温度对对活菌数和酸度的影响
Fig.7 Effect of different fermentation temperatures on the number of viable bacteria and acidity
不同字母表示差异显著，P<0.05。
适宜的发酵温度可以促进乳酸菌的发酵，过高或者过低的发酵温度都会抑制乳酸菌的发酵活性。由图7 可知，发酵温度为33、36、39 ℃时，酸度变化不大，无明显差异，39 ℃时，酸度达到最高，为0.79°T，活菌数随着发酵温度递增而增加，39 ℃达到最高，为0.94×109 CFU/mL。当发酵温度超过39 ℃，达到42 ℃及以上时，活菌数急速下降，说明发酵温度过高，抑制了乳酸菌的发酵，导致活菌数小于1×107 CFU/mL。同样地，酸度也有明显下降。发酵温度过高，不仅影响乳酸菌的发酵活菌数，也同样影响沙芥发酵液的酸度，从而改变了乳酸菌的发酵环境，使得沙芥发酵液活菌数急剧减少。分析数据可知，33、36、39 ℃时，活菌数均大于108 CFU/mL。根据试验结果，选取33、36、39 ℃3 个发酵温度参与后续正交试验。
2.2.2 发酵时间对沙芥汁发酵的影响
不同发酵时间对活菌数和酸度的影响见图8。
图8 不同发酵时间对活菌数和酸度的影响
Fig.8 Effect of different fermentation time on the number of viable bacteria and acidity
乳酸菌的发酵过程是利用原料产生乳酸等产物的过程，在不同的发酵时间内，沙芥汁发酵液产生的乳酸产物量不同，随着发酵时间的增长，乳酸产物会不断积累，从而影响沙芥青汁中乳酸菌的发酵。由图8可知，在14、16、18 h 时，活菌数以及酸度结果较好。16 h 为最佳发酵时间。
2.2.3 蔗糖添加量对沙芥发酵液的影响
不同蔗糖添加量对发酵的影响图9 所示。
图9 不同蔗糖添加量对活菌数和酸度的影响
Fig.9 Effect of different sucrose addition levels on the number of viable bacteria and acidity
不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图9 可知，以活菌数为评价指标，随着蔗糖添加量的增加，活菌数变化不显著（p＞0.05），以酸度为评价指标酸度变化同样不显著（p＞0.05）。说明蔗糖添加量在沙芥青汁的发酵过程中对活菌数与酸度均无显著影响，因此，在后续正交试验中，不考虑此因素。
2.2.4 最佳工艺正交试验
在单因素的基础上，以发酵时间、发酵温度、接种量3 个因素，以活菌数作为主要评价指标，酸度作为次要评价指标，选用L9（33）正交试验表，根据试验结果，筛选出最佳发酵条件，正交试验结果见表4。
表4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal experiments
序号 A 发酵时间/h % 酸度/°T 活菌数/（×107 CFU/mL）1 1（14） 1（33） 1（4） 0.60 52.50 2 1 2（36） 2（5） 0.68 28.50 3 1 3（39） 3（6） 0.64 33.50 4 2（16） 1 2 0.60 39.50 5 2 2 3 0.86 52.00 6 2 3 1 0.77 29.00 7 3（18） 1 3 0.90 21.50 8 3 2 1 0.86 46.50 9 3 3 2 0.77 42.00 B 发酵温度/℃C 接种量/
续表4 正交试验结果
Continue table 4 Results of orthogonal experiments
% 酸度/°T 活菌数/（×107 CFU/mL）酸度k1 0.64 0.70 0.74 k2 0.74 0.80 0.68 k3 0.84 0.73 0.80 R1 0.20 0.10 0.12活菌数k1 38.17 37.83 42.67 k2 40.17 42.30 36.67 k3 36.67 34.83 35.67 R2 3.50 7.47 7.00序号 A 发酵时间/h B 发酵温度/℃C 接种量/
由正交结果数据可知，以酸度为评价指标，影响的主次因素为A＞C＞B，说明在沙芥发酵过程中，发酵时间和发酵温度对发酵液酸度影响较大，其次是菌种接种量，最优水平为A3B2C3，但在试验组中，酸度最高的组别是A3B1C3，酸度达到了0.90 °T。以沙芥发酵液中所含的活菌数为评价指标，比较R 值大小可知，发酵温度和接种量为沙芥发酵液所含活菌数的主要影响因素，发酵时间为次要影响因素，即发酵温度与接种量对沙芥发酵液的活菌数产酸影响大。根据正交得出最优水平为A2B2C1，但是试验组活菌数最多的组别为A1B1C1。
验证试验结果如表5 所示。
表5 验证试验
Table 5 Validation test
组合 活菌数/（×107 CFU/mL） 酸度/°T A2B2C3 53 0.86 A2B1C3 52.5 0.77 A2B2C1 53.5 0.69 A1B1C1 60.5 0.72
根据活菌数指标来看，A1B1C1 活菌数最高，根据酸度指标来看，变化不明显，所以选择A1B1C1 作为发酵的最优工艺。即发酵14 h，发酵温度33 ℃，接种量4%。
2.2.5 感官评价
对A1B1C1 制备的饮料进行了感官评价，评价结果见表6。
表6 感官评价结果
Table 6 Sensory evaluation results
工艺 组织状态A1B1C1 7.8±0.8色泽7.6±1.1气味 口感9.3±0.8 7.4±1.3
由表6 可知，沙芥饮料组织状态均匀，无沉淀，色泽呈绿色，具有沙芥固有的清香气味，微酸，微甜，口感较好。
3 结论
本研究以沙芥为单一原料，采用植物乳杆菌、嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌的复合菌发酵沙芥汁制成乳酸菌饮料，以乳酸菌活菌数和酸度含量作为评价指标，通过单因素试验和正交试验确定了复合菌的体积比为：植物乳杆菌∶嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=4∶4∶3（质量比）；最佳发酵工艺为发酵温度33 ℃、发酵时间14 h、接种量4%；此研究所用原料独特、风味独特、制备工艺简单，为沙芥乳酸菌发酵饮料的生产和加工提供了一定的理论基础和试验支撑。
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