茶条槭（Acer ginnala Maxim.）属槭树科槭树属落叶灌木或小乔木植物[1]，主要分布在我国华北、东北和西北等地区，多呈灌丛状，适应性强，耐寒[2]。茶条槭叶形柔美，其嫩叶可食用，也可制成茶叶，具有清热明目，生津止咳的功效，茶条槭在观赏和药用方面都具有重要价值[3]。茶条槭叶中含有多酚类、黄酮类、挥发油类化合物等化学物质[4-7]。其中，没食子酸是茶条槭叶中的重要有效成分，是可水解单宁的组成部分，含量高达20%[8]，没食子酸具有较强的抗氧化性以及抑菌、抗肿瘤、抗炎、降血糖等生物活性[9-13]，被广泛应用于化工、医药和食品等领域中。
目前，没食子酸的提取方法主要有酶法[14]、索氏提取法、酸水解法等[15]。酶法和索氏提取法提取效率较高，但存在耗时长的问题，酸水解法不仅耗时长，而且对设备腐蚀性较大。单宁酶是一种单宁酰基水解酶，对单宁类物质可进行专一且高效的水解[16]，超声-微波协同提取法具有提取时间短、提取效率高等优点，是近几年发展较快的提取方法之一[17]。目前，对于单宁酶耦联超声-微波协同提取茶条槭叶没食子酸鲜见报道。本研究采用单宁酶耦联超声-微波协同提取茶条槭叶没食子酸，在单因素试验的基础上，通过响应面法对单宁酶耦联超声-微波协同提取茶条槭叶没食子酸的提取工艺进行优化，并根据1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino -bis （3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulfonic acid），ABTS）] 阳离子自由基清除试验对茶条槭叶没食子酸的抗氧化活性进行评价，以期为茶条槭叶中没食子酸的深度开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶条槭叶采集于东北林业大学校园内。DPPH、ABTS、单宁酶（200 U/g）、没食子酸标准品（纯度＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；抗坏血酸（vitamin，VC）：天津市东丽区天大化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（pH7.4，分析纯）：上海博微生物科技有限公司；甲醇（色谱级）：湖北弗顿生化科技有限公司；乙腈（色谱级）：爱思开生物医药科技（上海）有限公司。
1.2 仪器与设备
超声-微波协同萃取仪（CW-2000）：上海新拓分析仪器科技有限公司；医用离心机（H1650）：长沙市湘仪离心机仪器有限公司；高效液相色谱仪（1260）：美国安捷伦公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9145A）：上海一恒科技仪器有限公司；FW100 型万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；旋涡混合器（M375-XH-）：东方化玻（北京） 科技有限公司；电子分析天平（AUW220）：浙江赛德仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 供试品溶液的制备及没食子酸得率测定
将同一批次茶条槭叶置于50 ℃鼓风干燥箱内干燥24 h，粉碎过80 目筛备用。称量0.5 g 茶条槭叶粉末，倒入50 mL 离心管中，按一定的料液比加入pH7的60%乙醇溶液，随后加入一定量的单宁酶，在旋涡混合器充分混合后，立即转移到超声-微波萃取仪中，提取温度为60 ℃，在不同提取时间、不同微波功率（超声功率为50 W）的条件下，制备后8 000 r/min 离心10 min，取2 mL 上清液过0.22 μm 有机滤膜，即为供试品溶液。
将供试品溶液测得峰面积代入标准曲线中，得到样品质量浓度，从而计算出茶条槭叶片中没食子酸得率，其计算公式如下。
式中：Y 为没食子酸得率，%；C 为单位体积提取液中没食子酸的质量浓度，mg/mL；V 为提取液总体积，mL；M 为茶条槭叶粉末的质量，mg。
1.3.2 液相色谱条件的建立
Diamonsil-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），没食子酸检测条件为流动相A：乙腈，流动相B：0.1%磷酸水溶液，检测波长260 nm，柱温25 ℃，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution procedure
时间/min 流量/（mL/ min） 乙腈/% 0.1%磷酸水溶液/%0 0.8 4 96 6 0.8 8 92 30 0.8 20 80
1.3.3 标准曲线的建立
称取10mg 没食子酸标准品，用甲醇配制为1 mg/mL的没食子酸标准品贮备溶液，并逐级稀释为0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 mg/mL 标准品溶液，分别进样10 μL 测定其峰面积值。以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，没食子酸的回归方程为y=5 638.7x-6 121.3（R2=0.999 0），线性范围为0.062 5～1.000 0 mg/mL。
1.3.4 单因素试验
称取干燥茶条槭叶粉末0.5 g，以60%乙醇为提取溶剂，采用单宁酶耦联超声-微波协同提取法提取没食子酸。固定提取条件：提取时间20 min、提取温度50 ℃、微波功率400 W、pH5、料液比1∶60（g/mL）、单宁酶添加量为（样品质量的）3%；分别对单宁酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1 ∶80（g/mL）]、pH 值（3、4、5、6、7、8）、微波功率（100、200、300、400、500 、600 W）、提取时间（5、10、20、30、40、50 min）、提取温度（30、40、50、60、70 ℃）6 个因素进行单因素试验，考察各因素对茶条槭叶没食子酸得率的影响。
1.3.5 响应面法优化提取工艺
以单因素试验结果为基础，选取对没食子酸得率影响较高的4 个因素（单宁酶添加量、料液比、提取时间、微波功率）作为自变量，采用四因素三水平设计Box-Beheken Design 试验，试验因素与水平见表2。
表2 响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiment
水平因素A 提取时间/min D 微波功率/W-1 30 400 0 40 500 1 50 600 B 单宁酶添加量/%C 料液比/（g/mL）3 1∶50 4 1∶60 5 1∶70
1.3.6 提取方法的比较
索氏提取法：参考王彦清等[18]的提取方法，称取茶条槭叶粉末5.0 g，置索氏提取器中，提取溶剂为95%乙酸溶液，液料比20∶1（mL/g），提取时间4 h，10 000 r/min离心10 min 后取上清液即为待测溶液。
酸水解法：参考邱亮[8]的提取方法，称取茶条槭粉末1.0 g，按1∶40（g/mL）的料液比，加入浓度为4 mol/L HCl，在80 ℃水浴中加热水解4 h，10 000 r/min 离心10 min 后取上清液即为待测液。
1.3.7 没食子酸的纯化
参照王广娟[19]的方法对D301 阴离子交换树脂进行预处理，使用上样流速为1 mL/min，洗脱速度为1 mL/min，洗脱溶剂为5%盐酸-70%乙醇的条件经过D301 树脂对茶条槭叶没食子酸提取液进行纯化。将结晶样品进行真空干燥，得到没食子酸纯化物。
1.3.8 没食子酸的DPPH 自由基清除能力测定
参考文献[20]的方法并稍加调整。分别配制不同浓度梯度的没食子酸溶液和VC 溶液。取3 mL DPPH溶液和3 mL 体积分数95%的乙醇溶液，置于a 试管中，取3 mL DPPH 溶液和3 mL 不同质量浓度的没食子酸溶液，置于b 试管中，取3 mL 不同质量浓度的没食子酸溶液和3 mL 体积分数95%乙醇溶液，置于c 试管中，摇匀，避光条件下静置30 min，VC 溶液同样按照上述方法操作。用体积分数95%乙醇调零，在517 nm处测量各样品吸光度。样品对DPPH 自由基清除率（E1，%）按下列公式计算。
式中：Aa 为a 试管中样品的吸光度；Ab 为b 试管中样品的吸光度；Ac 为c 试管中样品的吸光度。
1.3.9 没食子酸的ABTS+清除能力测定
参考文献[21]的方法并稍加调整，分别配制7.4 mmol/L ABTS 溶液和2.6 mmol/L 过硫酸钾溶液，按1∶1 的体积比混合在暗黑室温下反应12 h。再用磷酸盐缓冲液稀释40～50 倍，得到ABTS+工作液。分别配制5 组不同浓度的没食子酸溶液和VC 溶液。取0.2 mL甲醇溶液和0.8 mL ABTS+工作液，放置在试管1 中，取0.2 mL 样品溶液与0.8 mL ABTS+工作液放置在试管2 中，取0.2 mL 样品溶液与0.8 mL 的甲醇溶液放置在3 试管中，室温下避光静置30 min 后，在734 nm 处测量各样品吸光度。样品的ABTS+自由基清除率（E2，%）按下列公式计算。
式中：A1 为试管1 中混合液的吸光度；A2 为试管2 中混合液的吸光度；A3 为试管3 中混合液的吸光度。
1.4 数据统计与处理
每组试验平均重复3 次，数据的统计与处理使用Origin 2018 和Design-Expert 8.0.6。
2 结果与分析
2.1 标准品及样品色谱结果
标准品及样品色谱图如图1 所示。
图1 标准品和样品色谱图
Fig.1 Chromatograms of the standard and the sample
A.标准品；B.样品。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 pH 值对茶条槭叶没食子酸得率的影响
pH 值对茶条槭叶没食子酸得率的影响见图2。
图2 不同pH 值对没食子酸得率的影响
Fig.2 Effect of different pH values on the yield of gallic acid
由图2 可知，当pH 值从3 增加到7 时，没食子酸得率随着pH 值的升高而升高，但在pH 值达到4 后，升高趋势变缓；在pH 值达到7 时，没食子酸得率最高，为20.62%，随后没食子酸得率开始缓慢下降。这是由于酶的活性具有最适pH 值，当达到最佳条件时，酶的活性最高，导致反应速率增加。当超出最适pH 值时，会导致酶活力降低，使酶发生变性，导致反应速率降低[22]。因此，选择溶液pH 值确定为7。
2.2.2 单宁酶添加量对茶条槭叶没食子酸得率的影响
单宁酶添加量对茶条槭叶没食子酸得率的影响见图3。
图3 不同单宁酶添加量对没食子酸得率的影响
Fig.3 Effect of different tannase addition amounts on the yield of gallic acid
由图3 可知，当单宁酶添加量从1%增加到5%时，没食子酸得率随着单宁酶添加量的增加而升高，当单宁酶添加量为4%时，没食子酸得率为21.11%，但在单宁酶添加量超过4%后，没食子酸得率增加变慢。这是因为适量的单宁酶与底物反应较充分，减少或增加单宁酶浓度，均会抑制反应速率[23]。因此，选择3%～5%的单宁酶添加量进行后续优化试验。
2.2.3 料液比对茶条槭叶没食子酸得率的影响
料液比对茶条槭叶没食子酸得率的影响见图4。
图4 不同料液比对没食子酸得率的影响
Fig.4 Effect of different solid-to-liquid ratios on the yield of gallic acid
由图4 可知，当料液比为1∶30～1∶60（g/mL）时，没食子酸得率随着溶剂添加量的增加而升高，当料液比为1∶60（g/mL）时，没食子酸得率为21.69%。但料液比达到1∶60（g/mL）后，没食子酸得率开始呈现降低趋势。这可能是因为溶剂添加量较少使得提取溶剂不能完全浸润样品，没食子酸没有充分提取出来，使得其得率降低。随着溶剂添加量的增加，样品与提取溶剂的接触面积增大，可能将没食子酸完全充分提取出来。但是，当溶剂添加量进一步增大时，溶质已全部溶出，反而引入更多的杂质，导致没食子酸的得率降低[24]。因此，选择1∶50～1∶70（g/mL）的料液比进行后续优化试验。
2.2.4 微波功率对茶条槭没食子酸得率的影响
微波功率对茶条槭叶没食子酸得率的影响见图5。
图5 微波功率对没食子酸得率的影响
Fig.5 Effect of microwave power on the yield of gallic acid
由图5 可知，当微波功率从100W 增加到500W 时，没食子酸得率随着微波功率的升高而升高，微波功率为500 W 时，没食子酸得率为18.62%，达到最高，但微波功率断续增大时，没食子酸得率呈下降趋势。其原因是随着微波功率继续增大，溶质吸收微波的能力逐渐增强[25]，使得大部分杂质溶出，影响了提取物质的溶解度，导致得率下降。因此，选择400～600 W 的微波功率进行后续优化试验。
2.2.5 提取时间对茶条槭叶没食子酸得率的影响
提取时间对茶条槭叶没食子酸得率的影响见图6。
图6 提取时间对没食子酸得率的影响
Fig.6 Effect of extraction time on the yield of gallic acid
由图6 可知，提取时间从5 min 增加40 min 时，没食子酸得率随着提取时间的延长而升高，提取时间为40 min 时，没食子酸得率为20.36%，达到最高。但在提取时间超过40 min 后，没食子酸得率呈下降趋势。其原因是随着提取时间的延长，没食子酸大多已析出到溶液中，继续延长提取时间可能会导致其他杂质溶出，使没食子酸含量降低[26]。因此，选取30～50 min 提取时间进行后续优化试验。
2.2.6 提取温度对茶条槭叶没食子酸得率的影响
提取温度对茶条槭叶没食子酸得率的影响见图7。
图7 不同提取温度对没食子酸得率的影响
Fig.7 Effect of extraction temperature on the yield of gallic acid
由图7 可知，提取温度从30 ℃增加到60 ℃时，没食子酸得率随着提取温度的增加而升高，当提取温度为60 ℃时，没食子酸得率为16.64%，达到最高。但提取温度达到60 ℃后，没食子酸得率下降趋势较明显。其原因是在一定范围内，适当提高提取温度，有利于没食子酸的析出，同时能够促进酶解作用，随着提取温度继续升高，没食子酸发生降解，同时单宁酶超出其温度的耐受范围而变性失活，使反应受到抑制[27]，导致没食子酸得率降低。因此，确定提取温度为60 ℃。
2.3 响应面优化试验结果
2.3.1 模型的建立及显著性检验
中心组合优化试验结果见表3。
表3 中心组合优化试验结果
Table 3 Optimized results of central composite experiment
编号 A B C D Y 得率/ %1 0 1 0 1 25.41±0.63 2 0 -1 0 1 24.22±0.57 3 010-1 0 -1 23.79±0.82 4 0 0 -1 24.53±0.47 5 0 0 0 26.46±0.49 6 0 0 0 0 26.62±0.36 7 1 0 0 1 24.16±0.42 8 0 0 -1 1 24.63±0.57 9 -1 0 1 0 24.85±0.69 10 -1 0 0 -1 23.21±0.36 11 0 1 1 0 25.74±0.39 12 1 0 -1 0 24.79±0.48 13 0 -1 -1 0 24.17±0.74 14 0 -1 1 0 24.53±0.69 15 0 0 0 0 26.12±0.33 16 -1 0 0 1 25.42±0.46 17 0 0 1 -1 24.01±0.61 18 1 1 0 0 25.33±0.67 19 0 0 -1 -1 23.45±0.71 20 -1 -1 0 0 24.51±0.49 21 0 0 0 0 26.57±0.43 22 0 0 1 1 24.56±0.34 23 -1 0 -1 0 24.12±0.29 24 0 0 0 0 26.71±0.38 25 -1 1 0 0 25.75±0.49 26 0 1 -1 0 24.88±0.58 27 0 1 0 -1 23.64±0.36 28 1 -1 0 0 24.36±0.72 29 1 0 1 0 25.75±0.43
采用单宁酶耦联超声-微波协同提取法从茶条槭叶中提取没食子酸，在单因素试验基础上，以提取时间（A）、单宁酶添加量（B）、料液比（C）、微波功率（D）为自变量，没食子酸提取率（Y）为响应值，设计四因素三水平试验，测定每组试验的没食子酸得率。利用软件Design-Expert 8.0.6 对表3 数据进行拟合，得到二次多项式回归方程：Y=26.50＋0.088A＋0.43B＋0.28C＋0.48D -0.068AB ＋0.058AC -0.65AD ＋0.13BC ＋0.33BD －0.16CD－0.73A2－0.78B2－0.89C2－1.44D2。
响应面拟合回归方程的方差分析结果见表4。
表4 响应面拟合回归方程的方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis of response surface fitting regression equation
注：P＜0.05 表示影响显著；P＜0.01 表示影响极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值模型 26.24 14 1.87 21.63 <0.000 1 A提取时间 0.094 1 0.094 1.08 0.316 2 B单宁酶添加量 2.23 1 2.23 25.71 0.000 2 C 料液比 0.96 1 0.96 11.12 0.004 9 D 微波功率AD BD 2.77 1 2.77 32.02 <0.000 1 1.66 1 1.66 19.21 0.000 6 0.45 1 0.45 3.45 0.039 1 AB 0.018 1 0.018 0.21 0.653 5 AC 0.013 1 0.013 0.15 0.701 9 BC 0.063 1 0.063 0.72 0.410 0 CD 0.099 1 0.099 1.15 0.302 7 A2 3.42 1 3.42 39.45 <0.000 1 B2 3.97 1 3.97 45.80 <0.000 1 C2 5.12 1 5.12 59.09 <0.000 1 D2 13.54 1 13.54 156.25 <0.000 1残差 1.21 14 0.087失拟项 1.00 10 0.10 1.92 0.227 5纯误差 0.21 4 0.052总变异 27.45 28
由表4 方差分析结果可知，该模型F=21.63，P＜0.01，说明该试验优化模型差异极显著，在统计学上有意义，而且失拟项F=1.92，P=0.277 5＞0.05 ，表明差异不显著，无失拟因素存在，该模型拟合度良好，可对试验结果进行分析。该试验设计表明，提取时间（A）对没食子酸得率没有显著性影响，单宁酶添加量（B）、料液比（C）以及微波功率（D）对没食子酸得率影响极显著（P＜0.01），且由F 值大小可知，C＜B＜D ，说明微波功率（D）对没食子酸得率影响最大。在组合因素中，AD 的交互作用对没食子酸得率影响极显著（P＜0.01），BD 的交互作用对没食子酸得率影响显著（P＜0.05），其余各因素的交互作用对没食子酸得率的影响不显著。
2.3.2 响应面优化试验结果
各因素交互作用的响应面见图8。
图8 各因素交互作用的响应面
Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors
a～f 分别为AD、BD、AB、AC、CD、BC 的响应面。
由图8 可知，坡度越陡表明相互作用越明显。由图8a 和图8b 分析可直观地看出，响应面坡度较陡，等高线为椭圆形，说明A、D 和B、D 之间交互作用表现为影响显著。
对图8c～8f 分析可知，响应面坡度较平缓，等高线接近圆形，说明AB、AC、CD 以及BC 之间交互作用均表现为影响不显著。这与表4 方差分析结果相一致。
2.3.3 最佳提取条件的确定及验证试验
通过综合回归模型的统计分析可知，没食子酸的最佳提取工艺参数为提取时间39.60 min、单宁酶添加量4.33%、料液比1∶61.64（g/mL）、微波功率520.48 W，此条件下没食子酸理论提取得率为26.64%。考虑到实际操作的可行性，将工艺参数调整为提取时间40 min、单宁酶添加量4.3%、料液比1∶60（g/mL）、微波功率520 W。利用上述最优条件进行重复性试验，得到没食子酸的得率为（26.25±0.41）%，与理论预测值吻合度较高，表明优化后的条件切实可行。因此，该模型准确、可靠，可用于茶条槭叶没食子酸的优化提取。
2.3.4 与其他提取工艺比较
不同提取方法对茶条槭叶没食子酸得率的对比结果见表5。
表5 不同提取方法对茶条槭叶没食子酸得率的对比结果
Table 5 Comparison of different extraction methods on the yield of gallic acid from Acer ginnal leaves
方法 提取时间/min 没食子酸得率/%单宁酶耦联超声-微波协同提取法 40 26.25±0.41酸水解法 240 21.03±0.52索氏提取法 240 18.62±0.38
由表5 可知，本研究将单宁酶耦联超声-微波协同提取法与酸水解法和索氏提取法进行了比较，单宁酶耦联超声-微波协同提取法对茶条槭叶中没食子酸的得率均高于酸水解法和索氏提取法，且耗时短，说明单宁酶耦联超声微波协同提取法能有效提高没食子酸得率。
2.3.5 没食子酸纯化结果
没食子酸粗提液经树脂纯化后再旋转蒸发除去洗脱溶剂然后冷冻干燥制得固体粉末。经高效液相色谱仪测定没食子酸的纯度可达90%以上。
2.4 没食子酸抗氧化能力测定
2.4.1 DPPH 自由基的清除能力
茶条槭叶没食子酸和VC 对DPPH 自由基的清除能力见图9。
图9 没食子酸对DPPH 自由基清除率的影响
Fig.9 Effect of gallic acid on DPPH free radical scavenging rate
由图9 可知，随着质量浓度的增加，没食子酸和VC对DPPH 自由基清除率均为先升高后稳定的趋势，在质量浓度5～30 μg/mL 时，没食子酸和VC 清除DPPH自由基清除能力均显著升高，在30 μg/mL 后，随着浓度的增加，两者清除率变化均不明显。当质量浓度为50 μg/mL 时，没食子酸对DPPH 自由基的清除率为87.3%，高于VC 对DPPH 自由基清除率为83.6%。结果表明，没食子酸对DPPH 自由基有较强的清除作用。
2.4.2 ABTS+自由基的清除能力
茶条槭叶没食子酸和VC 对ABTS+自由基的清除率见图10。
图10 没食子酸对ABTS+自由基清除率的影响
Fig.10 Effect of gallic acid on ABTS+ free radical scavenging rate
由图10 可知，随着质量浓度的增加，没食子酸和VC 对ABTS+自由基清除率均表现为先升高后稳定的趋势，在质量浓度5～30 μg/mL 时，没食子酸和VC 清除ABTS+自由基能力均显著升高，在质量浓度达到30 μg/mL后，两者清除ABTS+自由基能力均趋于稳定，此时，没食子酸对ABTS+自由基的清除率为92.13%，高于VC对ABTS+自由基的清除率89.16%。结果表明，没食子酸具有较好的抗氧化性。
3 结论
本研究采用单宁酶耦联超声-微波协同提取法，以茶条槭叶为研究材料，在单因素试验的基础上，采用响应面法进行优化分析，最终确定的最佳工艺参数：提取时间40 min、单宁酶添加量4.3%、料液比1∶60（g/mL）、微波功率520 W、pH 值为7，提取温度60 ℃。此条件下进行重复试验，没食子酸得率为（26.25±0.41）%。与模型的预测值26.64%相近。单宁酶耦联超声-微波协同法显著提高了没食子酸的得率，并且具有消耗时间短，效率高，操作简单等优势。通过DPPH 自由基以及ABTS+自由基清除试验，比较没食子酸和VC 的抗氧化活性，发现没食子酸的抗氧化性均高于VC。试验结果证明，单宁酶耦联超声－微波协同提取法能够提高没食子酸得率，且没食子酸具有较强的抗氧化性，为茶条槭叶中没食子酸的高效提取和深度开发利用提供参考。
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