我国夏秋茶产量高，但夏秋茶的茶多酚、咖啡碱含量较高[1]，滋味苦涩，香气较低[1-2]，经济效益较差，资源利用率偏低[3]；提高夏秋季茶鲜叶的利用率已经成为茶叶加工的重要课题。云南大叶种茶树鲜叶的茶多酚含量较高，滋味更浓厚[4]，尤其是夏秋茶苦涩味重，品质不高[5]，云南大叶种茶树夏秋茶鲜叶的加工利用，已成为限制云南茶叶产业发展的关键，亟待研究。目前已有报道应用施肥[6]、遮阴[7]降低鲜叶茶多酚含量，以及通过杀青、做青、揉捻、干燥等茶叶加工技术提高夏秋茶品质[8-9] 。运用科学方法提高夏秋茶品质、挖掘夏秋茶市场、促进夏秋茶资源高效利用，是茶叶产业可持续发展的关键环节。
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质[10]，据报道GABA 还具有降血压、改善睡眠、改善脑功能与增强记忆力等生理活性[11-12] 。2009 年，国家卫生健康委员会批准GABA 为新食品原料[13]，因此富含GABA 的食品成为功能食品开发的新热点。GABA 广泛分布于植物、动物和微生物中[14-15]，也存在于茶树鲜叶中，一般含量为0.02～0.20 mg/g[15-16]。1987 年，日本Tsushida等[17]发现经充氮处理后的茶鲜叶GABA 含量显著升高，并将GABA 含量在1.5 mg/g 以上的茶叶命名为γ-氨基丁酸茶。GABA 茶不仅具有儿茶素、茶氨酸等茶叶特征物质的生物活性[15，18]，还具有GABA 的生物活性功能[11]，成为一种具有一定市场潜力的特种保健茶。国内外学者相继利用叶面喷施[16]、嫌气厌氧法[19]、浸泡处理[20]、红外线照射[21]、厌氧/好氧处理[10，22] 等方法提高了茶叶中GABA 的含量，开发了GABA 绿茶[15]、红茶[23]、乌龙茶[23]、白茶[24]等产品。但林智等[19]、王玉花等[25]的研究表明，茶叶经厌氧处理后虽然能增加GABA 的含量，但降低了茶叶风味，出现了特殊的“GABA 臭”[26]。因此，改进GABA 茶的风味品质，成为该功能茶叶产品研究的热点问题。
本文以云南勐海地区的夏秋季大叶种茶树鲜叶为原料，通过爬坡试验、响应面设计优化真空厌氧处理富集GABA 的工艺，加工GABA 白茶，以期开发一种富含GABA 且风味较好的白茶。
1 材料与方法
1.1 试验材料
GABA 白茶加工的鲜叶，于2019 年9 月，采摘于云南省勐海县光芒山地区的勐海大叶种茶树鲜叶，采摘标准为一芽二叶。
1.2 试剂
甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国Sigma 公司；乙酸、氯仿、福林酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化亚锡、茚三酮、邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）、硼酸缓冲液、β-巯基乙醇（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）标准品、天冬氨酸（aspartic acid，Asp）标准品、谷氨酸（glutamic acid，Glu）标准品、丝氨酸（serine，Ser）标准品、组氨酸（histidine，His）标准品、甘氨酸（glycine，Gly）标准品、苏氨酸（threonine，Thr）标准品、精氨酸（arginine，Arg）标准品、丙氨酸（alanine，Ala）标准品、酪氨酸（tyrosine，Tyr）标准品、半胱氨酸（cysteine，Cys）标准品、甲硫氨酸（methionine，Met）标准品、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）标准品、异亮氨酸（isoleucine，Ile） 标准品、亮氨酸（leucine，Leu）标准品、赖氨酸（lysine，Lys）标准品、脯氨酸（proline，Pro）标准品（纯度均≥98%）美国安捷伦公司；茶氨酸（thean）标准品（纯度≥98%）：中国食品药品检定研究院；咖啡碱（caffeine，CA）标准品、儿茶素（catechin，C）标准品、表儿茶素（epicatechi，EC）标准品、表没食子酸儿茶素（epigallocatechin，EGC）标准品、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）标准品、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）标准品、没食子酸（gallic acid，GA）标准品、1，4，6-O-没食子酰基-食子酰基葡萄糖（gallate catechin，GG）标准品、鞣花酸（ellagic acid，EA）标准品、杨梅素（myricetin，My）标准品、槲皮素（quercetin，Qu）标准品、木犀草素（luteolin，Lu） 标准品、山奈酚（kaempferol，Kf）标准品（纯度均≥98%）：成都曼思特生物有限公司。
1.3 仪器与设备
1200 型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；756CRT 紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；AR-1140 电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；HTY-800g 茶样粉碎机：永康市红太阳机电有限公司；Smart-Q30 实验室纯水系统：上海和泰仪器有限公司；101A-2 型电热鼓风恒温干燥箱：上海市崇明实验仪器厂；DZF-6050 型真空干燥箱：上海博迅实业有限公司；HH-S28S 型电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；CT15RE 型低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司。
1.4 试验方法
1.4.1 茶叶GABA 含量测定
应用OPA 在线柱前衍生的高效液相色谱-荧光检测器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）方法[27]，测定GABA 含量。
1.4.2 GABA 富集工艺优化
参考段双梅等[28]的方法，采用真空厌氧技术进行茶鲜叶GABA 富集。将鲜叶萎凋8 h 后，设计爬坡试验，分别在不同厌氧处理温度和时间（27 ℃/12 h、30 ℃/16 h、33 ℃/20 h、36 ℃/24 h）下处理萎凋茶叶，放入真空干燥箱中；对照未经厌氧处理，分别在不同温度和时间下处理萎凋茶叶，放入电热鼓风恒温干燥箱中；处理结束后50 ℃烘干茶叶；测定GABA 含量，优化厌氧处理的时间和温度。
利用Design Expert 8.0.6 软件，基于爬坡试验的结果，根据中心复合原理，以GABA 含量（Y）为响应值，厌氧处理温度（A）和时间（B）为因子水平，中心点数为2 个，重复次数为2，进行响应曲面中心复合设计。按照试验设计处理茶树鲜叶，测定处理样品的GABA 含量。应用F 检验对响应曲面设计的多元回归方程及失拟显著性进行分析，在响应曲面试验结果的基础上，采用两因素一水平的响应面试验设计，以厌氧处理时间、温度为考察因素，以GABA 含量为指标进行曲面三维图的绘制，分析得出最佳厌氧处理时间、温度及GABA 含量的峰值。应用响应面设计获得的最优GABA 富集条件（即最佳厌氧处理时间、温度） 进行GABA 白茶加工，并测定其GABA 含量，与理论值比较，验证响应面设计模型的准确性，进行2 次重复试验。
1.4.3 感官审评
采用GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》。由5 名高级评茶员组成，年龄在20～40 岁、男生2 人和女生3 人，对茶样的外形、汤色、香气、滋味和叶底5 项因子进行评分；采用百分制评分，每5 分为一档，2～3 分为半档；5 项评分（0～100 分） 分别与评分系数25%、10%、25%、30%、10%相乘，并将各个乘积值相加，即为该茶样感官审评的总分。
1.4.4 茶叶生化成分测定
以优化得到的条件加工GABA 白茶，以未经厌氧处理的茶样为对照茶样，测定样品生化成分含量。采用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法、GB/T 8305—2013《茶水浸出物测定》中的全量法、GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》中的茚三酮比色法分别测定茶叶水分、水浸出物（water extraction，WE）、游离氨基酸（free amino acid，AA）含量，茶多酚（tea polyphenols，TP）含量参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。应用高效液相色谱方法，分别测定儿茶素类、没食子酸、咖啡碱、黄酮类的含量[29]，以及氨基酸组分含量[27]。
1.5 数据处理
每个试验处理重复2 次，每个样品重复提取测定2 次（响应面试验除外），试验数据用软件IBM Spssstatistics 22 进行单因素方差分析，组间采用最小显著差数法进行两两比较，p＜0.05 为差异显著。采用GraphPad Prism 8 统计绘图。
2 结果与分析
2.1 GABA 白茶工艺优化
2.1.1 爬坡试验
设置处理时间和处理温度梯度进行爬坡试验处理鲜叶，烘干后测定样品GABA 含量，结果见图1。
图1 不同温度/时间处理茶样GABA 含量
Fig.1 Contents of GABA in tea samples treated with various temperatures/time
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
由图1 可知，与对照相比，厌氧处理后GABA 含量增加，当处理温度为33 ℃，处理时间20 h 时出现拐点，GABA 含量为（1.45±0.07）mg/g，因此选择爬坡试验厌氧温度30～36 ℃、处理时间16～24 h 的工艺进行后续响应面试验设计。
2.1.2 响应面试验设计及结果
利用Design Expert 8.0.6 软件，设计响应面试验，厌氧处理后测定茶样GABA 含量，结果见表1。
表1 响应面试验设计及结果
Table 1 Design and results of response surface test
编号 因素水平 GABA 含量/（mg/g）A 处理温度/℃ B 处理时间/h 1 30 16 1.21 2 30 16 1.19 3 30 20 1.22 4 30 20 1.20 5 30 24 1.07 6 30 24 1.17 7 33 16 1.38 8 33 16 1.39 9 33 20 1.53 10 33 20 1.54 11 33 20 1.49 12 33 20 1.50 13 33 24 1.44 14 33 24 1.43 15 36 16 1.41 16 36 16 1.31 17 36 20 1.59 18 36 20 1.54 19 36 24 1.47 20 36 24 1.43
以GABA 含量为因变量（Y），以处理温度（A）、处理时间（B）为自变量。基于以上结果进行回归分析，建立响应面回归模型，得到GABA 含量的回归方程：GABA含量（Y）=1.52+0.14A+0.01B+0.040AB-0.13A2-0.11B2。
数据运用Design-Expert 8.0.6 软件进行方差分析，结果见表2。
表2 响应面设计模型的方差分析
Table 2 Variance analysis of response surface design model
注：** 表示影响极显著（p<0.01）；* 表示影响显著（p<0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 p 值 显著性模型 0.404 705 5 0.080 941 49.384 69 <0.000 1 **A 处理温度0.236 804 1 0.236 804 144.481 80 <0.000 1 **B 处理时间0.001 129 1 0.001 129 0.688 855 0.420 5 AB 0.012 862 1 0.012 862 7.847 344 0.014 1 *A2 0.076 970 1 0.076 970 46.962 14 <0.000 1 **B2 0.051 648 1 0.051 648 31.511 85 <0.000 1 **残差 0.022 946 14 0.001 639失拟项 0.009 292 3 0.003 097 2.495 267 0.114 1纯误差 0.013 654 11 0.001 241总离差 0.427 650 19
由表2 可知，模型极显著（p<0.01），且失拟项不显著（p>0.05），模型的决定系数R2=0.946 3。表明未知因素对试验结果的干扰较小，该试验模型能够充分拟合试验数据，证明GABA 含量的回归方程是GABA 含量与各因素合适的数学模型，即可以利用此回归方程确定GABA 白茶加工的最佳工艺[30]。根据F 值可知，处理温度对GABA 含量的影响大于处理时间，处理温度达到极显著水平（p<0.01），处理温度和处理时间的交互作用对GABA 含量的影响达到显著水平（p<0.05）。
根据回归方程得到两个因子的响应面三维曲面图和等高线图，分别见图2、图3。
图2 处理时间和处理温度交互作用的响应面3D 图
Fig.2 3D graph of response surface about the interaction between processing time and processing temperature
图3 处理时间和处理温度交互作用的响应面等高线图
Fig.3 Response surface contour map about the interaction between processing time and processing temperature
图2 中呈现出坡度较陡的曲面，图3 等高线呈椭圆，表明各因素之间的交互作用较显著，说明厌氧处理时间和温度的交互作用显著，对GABA 含量有较大影响。
通过响应面结果分析，得到GABA 白茶加工厌氧处理的最优条件为处理温度34.72 ℃、处理时间20.62 h，公式计算得出GABA 含量的理论值为1.498 mg/g。根据实际情况调整工艺参数为处理温度34 ℃、处理时间20 h。为了检验模型的准确性，进行3 次验证试验，测定得到GABA 含量为（1.52±0.05）mg/g，与预测值1.498 mg/g 相接近，说明该模型可以很好地预测厌氧处理条件与GABA 含量之间的关系。
2.2 GABA 白茶感官品质与生化成分
对加工得到的GABA 白茶和对照茶样（经厌氧处理的白茶）进行感官审评，结果见图4 和表3。
表3 GABA 白茶与对照感官审评结果
Table 3 Sensory evaluation results of white tea rich in GABA and control group
注：** 表示与对照比差异极显著（p<0.01）。
茶样 外形 汤色 滋味 香气 叶底 感官评分评语 评语 评语 评语 评语 得分得分 得分 得分 得分对照 叶张较嫩， 绿黄明亮 平和、 青草气 黄绿较柔软，88.0±6.0 85.0±6.0 86.0±2.0 92.0±4.0 83.3±3.3 82.0±2.4灰绿，较匀 有青草味 匀亮GABA 白茶 芽叶连枝，红褐 橙黄明亮 甜、醇厚 果香、甜香， 橙红，匀齐 90.0±7.0 91.6±6.0**88.0±2.8 91.0±3.0 95.0±3.3** 92.0±3.2**显毫，较匀整 持久
图4 GABA 白茶与对照的外观和茶汤颜色
Fig.4 Appearance and infusion colors of white tea rich in GABA and control group
由图4 和表3 可知，GABA 白茶干茶色泽较红，汤色橙黄明亮，滋味更加甜、醇厚、润滑且无苦涩味，香气为甜香带果香；对照茶样干茶色泽灰绿，汤色绿黄明亮，滋味平和、有青草味，香气呈青草气；厌氧处理后GABA 白茶感官评分为91.6±6.0，极显著（p<0.01）高于对照茶样85.0±6.0。
为了进一步研究加工茶叶的品质特征，测定了GABA白茶和对照茶样的29 种茶叶特征成分，结果见图5。
图5 GABA 白茶与对照生化成分含量聚类热图
Fig.5 Cluster heat maps of biochemical components in white tea rich in GABA and control group
** 表示差异极显著（p<0.01）。
由图5 可知，经厌氧处理白茶的GABA 含量极显著增加，达（1.53±0.06）mg/g，这与Liao 等[31]研究结果一致。且GABA 白茶水浸出物含量极显著增加，达（580.70±0.35）mg/g，水浸出物是体现滋味醇厚品质特征的原因之一。茶多酚是主要涩味物质，儿茶素为茶多酚主要成分，其中酯型儿茶素具更强的苦涩味[32]。GABA 白茶比对照组茶叶中茶多酚含量极显著低于对照（p<0.01）；在GABA 白茶中，儿茶素类中EGCG、ECG、C、EGC、GG、GC 等呈苦涩味的主要化合物含量极显著低于对照茶样（p<0.01），这与感官审评结果经厌氧处理GABA 白茶相比于对照组滋味苦涩味更低相符；GCG、GA 的含量较对照茶样增加极显著（p<0.01），CG、EC 的含量较对照茶样有所增加，但不显著。咖啡碱是茶汤中主要苦味物质，GABA 白茶中咖啡碱含量降低了1.23 mg/g，这与GABA 白茶滋味苦涩味更低表现一致。游离氨基酸是主要鲜爽味物质，GABA 白茶较对照茶样的游离氨基酸含降低了12.00 mg/g。氨基酸组分含量表现各异；GABA 白茶中Phe、Ile、Thr、Leu、Cys、Met、Pro、Tyr 含量显著高于对照（p<0.05），而Thean、Ala、Gly、Glu、His、Asp、Ser 的含量极显著低于对照（p<0.01）。
3 讨论
茶叶经过厌氧处理后，其生化成分也发生了明显变化。本研究中，茶鲜叶经萎凋8 h，厌氧处理及干燥优化工艺制备GABA 白茶的GABA 含量得到了显著提高，这与邬龄盛等[24] 、王芳[33]的γ-氨基丁酸白茶加工工艺研究结果一致。但本研究加工出的GABA 含量为1.52 mg/g，本研究的原料为夏秋茶鲜叶，氨基酸含量低是原因之一。测定结果显示茶鲜叶经过厌氧处理后水浸出物含量增加，不同处理方式加工的白茶水浸出物含量存在一定差异，说明GABA 白茶茶汤中的呈味物质比较丰富，与茶汤厚薄、滋味浓厚程度密切相关[27]；茶多酚和游离氨基酸含量降低，这与王芳[33]、Teng 等[15]研究中GABA 白茶的茶多酚含量均下降的研究结果一致；测定结果还发现儿茶素、咖啡碱的含量降低，这是本文制备的GABA 白茶口感甜醇的物质基础。
早期林智等[19]建立了25 ℃真空厌氧8 h 的绿茶加工工艺，Dai 等[34]、毛清黎等[35]、邬龄盛等[24]、吴琴燕等[36]、沈强等[37]、王芳等[33]也运用厌氧处理加工得到GABA 绿茶、白茶，其中沈强等[37]还采用间歇厌氧的方式来提高GABA 含量。这些研究得到的厌氧时间大都是6～8 h，而本研究最终得到的最佳加工工艺为34 ℃厌氧处理20 h，厌氧处理的时间较长。较长时间的厌氧处理，不仅提高了茶样GABA 含量，而且加工的白茶还具有汤色橙黄明亮、滋味甜醇的特征，一方面提高了GABA 含量，另一方面改善了夏秋茶的口感。
夏秋茶产量占我国总产量的60%以上[38]，其高效利用成为我国茶叶产业提质增效的关键。本研究发现通过厌氧处理可以降低夏秋茶茶多酚、咖啡碱含量，进而减少夏秋茶的苦涩味，为夏秋茶资源的高效利用提供了技术参考。今后，应当继续研究，以期建立环保、低成本的技术，提高夏秋茶风味品质。
4 结论
本研究以云南大叶种夏秋季茶鲜叶为原料，优化建立了经34 ℃厌氧处理20 h 后50 ℃干燥加工GABA白茶的工艺。加工的GABA 白茶中GABA 含量超过1.5 mg/g，具有滋味甜醇、甜香带果香的品质特征，为提高茶叶资源利用率提供了试验依据。
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