腰果（Anacardium occidentalie L.，AOL）为漆树科腰果属植物，是世界著名的四大坚果之一[1]。腰果营养丰富，在预防心脑血管疾病、润肺、补脑等方面具有重要作用[2]。腰果仁含油量约46%，不饱和脂肪酸含量较高，其中油酸约67%、亚油酸约20%[3]。目前，腰果仁以直接食用为主，极少用于榨油，对腰果仁油的产品开发更为鲜见。常用的油脂提取方法主要有冷榨法[4-6]、溶剂萃取法[7-8]、水酶法[9]、超声辅助法[10]、微波辅助法等[11]。与传统的油脂提取方法相比，超临界萃取技术具有提取温度低、提取效率高、无溶剂残留、安全无污染等优点[12-14]。目前，利用超临界CO2 萃取法提取植物油的相关报道较多，但利用超临界CO2 萃取法制备腰果仁油的工艺研究鲜见报道。
本研究采用超临界CO2 萃取法提取腰果仁油，以得率为考察指标，通过响应面法优化提取工艺，并对制备的腰果仁油脂肪酸组成进行分析，以期为腰果仁油的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脱壳去皮腰果仁：云南滇丰农产品有限公司；氢氧化钠、氯化钠（均为分析纯）、正己烷、甲醇（均为色谱纯）、三氟化硼-甲醇溶液（浓度15%）：国药集团化学试剂有限公司；CO2 气体（纯度≥99.9%）：山东亿成气体有限公司。
1.2 仪器与设备
Speed SFE 型快速溶剂萃取仪：美国ASI 公司；RHP 400 型高速多功能粉碎机：永康市荣浩工贸有限公司；YP802N 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；7820A 型气相色谱仪：安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 腰果仁油萃取工艺路线
腰果仁干燥→粉碎→过筛→称量→装釜→萃取→腰果仁油粗产物→离心→腰果仁油。
1.3.2 腰果仁油脂肪酸成分测定
脂肪酸甲酯化：称取0.1 g 腰果仁油试样加入10 mL 具盖玻璃瓶中，加入4 mL 2%氢氧化钠-甲醇溶液，置于80 ℃水浴锅中水浴加热15 min，再加入3.5 mL 15%三氟化硼-甲醇溶液，置于80 ℃水浴锅中水浴加热2 min，流水冲洗冷却至室温，准确加入1 mL 正己烷，振荡摇匀，再加入2 mL 饱和氯化钠水溶液，5 000 r/min离心5 min，吸取上清溶液，过0.22 μm 的膜后转移至进样瓶中，准备进样。
气相色谱检测条件：检测器为氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）；色谱柱为安捷伦DB-23 石英毛细管柱，柱长60 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm；载气为高纯度氢气、高纯度氮气、空气；载气流速为3 mL/min；分流比50∶1；进样口和检测器的温度分别为250、280 ℃；进样量为1 μL。
1.3.3 腰果仁油得率测定
腰果仁油得率（Y，%）的计算公式如下。
式中：G1 为萃取的腰果仁油总质量，g；G2 为腰果仁总质量，g。
1.3.4 超临界CO2 萃取腰果仁油工艺的优化
1.3.4.1 超临界CO2 萃取腰果仁油单因素试验
准确称取过20 目筛的腰果仁粉10 g，装入萃取釜进行萃取，考察萃取温度（25、30、35、40、45、50、55 ℃）、萃取压强（20、25、30、35、40、45、50 MPa）、萃取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、CO2 流量（2、3、4、5、6、7 L/min）对腰果仁油得率的影响。
1.3.4.2 超临界CO2 萃取腰果仁油响应面试验
在单因素试验的基础上，选取萃取温度、萃取压强、CO2 流量、萃取时间为响应变量，以腰果仁油得率为响应值，利用Box-Behnken 原理设计四因素三水平响应面分析试验，响应面试验设计因素及水平编码见表1。
表1 响应面试验设计因素及水平编码
Table 1 Box-Behnke experiment design factors and level coding
编码 A 萃取温度/℃D 萃取时间/h-1 40 1.0 0 45 1.5 1 50 2.0 B 萃取压强/MPa 35 40 45 C CO2 流量/（L/min）345
1.4 数据处理
各试验重复3 次，使用Prism 8.0 软件绘制单因素图，使用Design Expert 10.0.3 软件进行响应面分析。
2 结果与分析
2.1 超临界CO2 萃取腰果仁油单因素试验分析
2.1.1 萃取温度对腰果仁油得率的影响
腰果仁油萃取时，设定萃取压强25 MPa、CO2 流量3 L/min、萃取时间1.5 h，萃取温度范围25～55 ℃，不同萃取温度条件下腰果仁油得率如图1 所示。
图1 萃取温度对腰果仁油得率的影响
Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of cashew kernel oil
由图1 可知，随萃取温度的升高腰果仁油得率先升高后降低，在萃取温度为45 ℃时腰果仁油得率最高，推测原因可能是分子热运动的速率随着温度的升高不断增大，分子之间相互碰撞的概率提高，有利于腰果仁油与超临界CO2 气体的充分接触，使超临界萃取过程更加高效快速；但随着萃取温度的继续升高，CO2 气体密度也逐渐变小，导致对腰果仁中油脂的溶解能力变小，腰果仁油的得率逐渐下降。因此，后续选取40、45、50 ℃进行响应面优化试验。
2.1.2 萃取压强对腰果仁油得率的影响
设定腰果仁油萃取温度40 ℃、CO2 流量3 L/min、萃取时间1.5 h，萃取压强范围20～50 MPa，不同萃取压强条件下腰果仁油得率如图2 所示。
图2 萃取压强对腰果仁油得率的影响
Fig.2 Effect of extraction pressure on yield of cashew kernel oil
由图2 可知，当萃取压强范围为20～40 MPa 时，随着萃取压强的升高，腰果仁油得率逐渐升高；当萃取压强范围为40～50 MPa 时，随着萃取压强的提高，腰果仁油得率逐渐降低；萃取压强为40 MPa 时，腰果仁油得率最高。超临界CO2 气体扩散系数比液体大，具有良好的传质性能，萃取压强的增加提高了CO2 流体的密度，使得分子之间的传质距离变小，提高了分子之间的传质效率，因此萃取效率得到提高[15]。然而，当萃取压强过高时，萃取釜中的物料易被高压CO2 流体压实，溶质扩散系数降低而不利于萃取，致使腰果仁油的得率降低。因此后续选取35、40、45 MPa 进行响应面优化试验。
2.1.3 萃取时间对腰果仁油得率的影响
设定腰果仁油萃取压强40 MPa、萃取温度40 ℃、CO2 流量3 L/min，萃取时间范围0.5～3.0 h，不同萃取时间条件下腰果仁油得率如图3 所示。
图3 萃取时间对腰果仁油得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on yield of cashew kernel oil
由图3 可知，随着腰果仁油萃取时间的不断延长，腰果仁油得率明显提高，当萃取时间为1.5 h 时，腰果仁油已基本被完全萃取，腰果仁油得率达到最大。当进一步延长萃取时间时，由于萃取时间过长，腰果仁油容易发生聚合现象，而且萃取瓶中的腰果仁油被高压气体冲入排气管道中造成腰果仁油损耗。因此，后续选取1.0、1.5、2.0 h 进行响应面优化试验。
2.1.4 CO2 流量对腰果仁油得率的影响
CO2 流量也是影响腰果仁油得率的重要因素之一，设定腰果仁油萃取压强25 MPa、萃取温度40 ℃、萃取时间1.5 h，CO2 流量范围2～7 L/min，不同CO2 流量条件下腰果仁油得率如图4 所示。
图4 CO2 流量对腰果仁油得率的影响
Fig.4 Effect of CO2 flow rate on yield of cashew kernel oil
由图4 可知，当CO2 流量范围为2～4 L/min 时，随着CO2 流量的增加，腰果仁油得率逐渐提高，主要原因是CO2 流量增大，超临界流体通过萃取釜的流速增加，CO2 流体与物料的接触效果更好，传质效率增加，使得萃取过程更加快速；当CO2 流量为4～7 L/min 时，CO2 流量的增加导致成本亦增加，而且CO2 停留时间缩短，影响了超临界CO2 流体与腰果仁之间的传质、传热，腰果仁中的油脂成分不能很好地溶解到CO2 流体中，影响了萃取效率[16]，致使腰果仁油得率降低。因此，后续选取3、4、5 L/min 进行响应面优化试验。
2.2 腰果仁油萃取响应面优化试验结果分析
2.2.1 响应面试验结果
根据表1 的响应面试验设计，设计出29 个响应面试验，每组试验重复3 次，取平均值，试验设计及结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Box-Behnke experimental design and results
序号 A 萃取温度B 萃取压强C CO2 流量D 萃取时间Y 得率/%1 -1 -1 0 0 35.040 8 2 0 0 1 1 35.266 1 3 1 0 0 1 39.107 9 4 1 0 0 -1 27.776 7 5 0 0 0 0 44.599 6 6 0 0 -1 1 33.336 6 7 -1 1 0 0 39.705 9 8 0 0 0 0 45.473 2 9 -1 0 1 0 36.865 2 10 0 0 1 -1 36.741 9 11 1 1 0 0 35.878 0 12 0 0 0 0 46.022 4 13 1 0 -1 0 32.662 3 14 0 -1 0 1 35.592 2 15 -1 0 0 -1 31.932 3 16 0 -1 -1 0 24.348 9 17 0 -1 0 -1 24.886 2 18 0 1 1 0 33.151 7 19 0 -1 1 0 40.461 0 20 1 0 1 0 40.831 3 21 1 -1 0 0 39.044 0 22 0 0 0 0 44.909 4 23 0 0 -1 -1 22.566 5 24 0 1 0 1 36.451 6 25 -1 0 -1 0 33.480 4 26 0 1 -1 0 39.228 0 27 0 0 0 0 46.988 7 28 -1 0 0 1 39.292 8 29 0 1 0 -1 34.661 9
利用Design-Expert 10.0.3 软件对各因素进行回归拟合，得到多元二次回归方程：Y=45.598 7-0.084 762 6A+1.64199B+3.14121C+3.37349D-1.957 76AB+1.19606AC+0.992 673AD-5.547 07BC-2.229 08BD-3.061 5CD-3.360 04A2-5.005 99B2-6.194 76C2-7.610 67D2。
2.2.2 响应面试验方差分析
对回归方程进行方差分析，结果如表3 所示。
表3 回归模型及方差分析
Table 3 Regression model and analysis of variance
注：* 表示影响显著，P＜0.05；** 表示影响极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 方差 F 值 P 值 显著性回归模型 1079.41 14 77.10 28.16 ＜0.000 1 **A 0.086 1 0.086 0.031 0.861 7 B 32.35 1 32.35 11.82 0.004 0 **C 118.41 1 11 136.56 1 13 15.33 1 15 5.72 1 5.3.94 1 3.8.41 43.25 ＜0.000 1 **D 6.56 49.88 ＜0.000 1 **AB .33 5.60 0.032 9 *AC 72 2.09 0.170 3 AD 94 1.44 0.250 1 BC 123.08 1 123.08 44.96 ＜0.000 1 **BD 19.88 1 19.88 7.26 0.017 4 *CD 37.49 1 37.49 13.69 0.0024 **A2 73.23 1 73.23 26.75 0.000 1 **B2 162.55 1 162.55 59.37 ＜0.000 1 **C2 248.92 1 248.92 90.92 ＜0.000 1 **D2 375.71 1 375.71 137.23 ＜0.000 1 **残差 38.33 14 2.74失拟项 34.73 10 3.47 3.86 0.102 5纯误差 3.60 4 0.90合计 1 117.74 28
由表3 可知，该模型的显著性检验概率P＜0.000 1，认为该模型具有统计学意义。其中，F 值可用来检验各变量对响应值的影响程度，F 值越大，则相应变量的显著程度越高。萃取工艺条件对腰果仁油得率影响的大小顺序为D>C>B>A，即萃取时间＞CO2 流量＞萃取压强＞萃取温度。模型的决定系数R2 为0.965 7，说明该模型具有较高显著性；RAdj2 为0.931 4，能够解释试验93.14%的响应值变异，且与预测相关系数Pred R2（0.816 0）接近，说明此试验模型与真实数据拟合程度良好，具有实践指导意义，由此可以用该模型分析和预测超临界CO2 萃取腰果仁油的最佳提取工艺条件。
2.2.3 响应面分析
不同萃取工艺条件两两交互作用对腰果仁油得率的影响见图5～10。
图5 萃取温度与萃取压强交互作用对腰果仁油得率的影响
Fig.5 Effect of interaction between extraction temperature and extraction pressure on the yield of cashew kernel oil
由图5 可知，萃取温度与萃取压强交互作用对腰果仁油得率的影响趋势呈抛物曲面分布，曲面整体纵向跨度较大且等高线呈现明显椭圆形，表明二者交互作用对腰果仁油得率影响较为显著。腰果仁油得率随萃取温度和萃取压强的增加均呈先增加后降低的变化趋势。取适中条件：萃取温度42～48 ℃、萃取压强39～43 MPa 水平时，可显著提高腰果仁油得率。
由图6 可知，腰果仁油得率随萃取温度和CO2 流量的增加呈先增加后降低的变化规律。相比较而言，曲面CO2 流量方向波动幅度较大，表明其对腰果仁油得率影响较萃取温度影响更加显著。仅考虑二者影响下的腰果仁油得率，优化工艺条件集中于萃取温度44～48 ℃，CO2 流量4.0～4.5 L/min 水平区间组合。
图6 萃取温度与CO2 流量交互作用对腰果仁油得率的影响
Fig.6 Effect of interaction between extraction temperature and CO2 flow rate on the yield of cashew kernel oil
由图7 可知，腰果仁油得率随萃取温度和萃取时间的升高和延长均呈现先增加后降低的变化趋势，且随萃取时间的变化趋势更加显著，表明萃取时间对腰果仁油得率的影响较萃取温度显著。当在萃取温度44～48 ℃、萃取时间1.4～1.8 h 取值时，为二者交互影响下优化提取工艺的条件范围。
图7 萃取温度与萃取时间交互作用对腰果仁油得率的影响
Fig.7 Effect of interaction between extraction temperature and extraction time on the yield of cashew kernel oil
由图8 可知，萃取压强与CO2 流量交互作用等高线呈显著椭圆形，且3D 曲面纵向跨度较大，表明萃取压强与CO2 流量交互作用对腰果仁油得率影响显著。当萃取压强小于40 MPa 时，腰果仁油得率与萃取压强呈正相关关系；当萃取压强大于40 MPa 时，其相关关系发生改变，在萃取压强40 MPa 附近取值时为腰果仁油得率的临界最佳工艺参数，同理腰果仁油得率随CO2流量变化的临界最佳工艺参数为4.25 L/min 左右。
图8 萃取压强与CO2 流量交互作用对腰果仁油得率的影响
Fig.8 Effect of interaction between extraction pressure and CO2 flow rate on the yield of cashew kernel oil
由图9 可知，萃取压强和萃取时间对腰果仁油得率的影响呈抛物曲面分布，萃取时间为腰果仁油得率的敏感影响因子，萃取压强39～43 MPa、萃取时间1.4～1.8 h 有利于提高腰果仁油得率。
图9 萃取压强与萃取时间交互作用对腰果仁油得率的影响
Fig.9 Effect of interaction between extraction pressure and extraction time on the yield of cashew kernel oil
如图10 所示，CO2 流量与萃取时间二者交互作用的等高线呈显著椭圆形，CO2 流量与萃取时间交互作用对腰果仁油得率影响显著，表现为腰果仁油得率随CO2 流量和萃取时间的增加和延长呈先增加后降低的变化趋势。取CO2 流量4.0～4.5 L/min、萃取时间1.4～1.8 h 水平区间值时，可显著提高腰果仁油得率。
图10 CO2 流量与萃取时间交互作用对腰果仁油得率的影响
Fig.10 Effect of interaction between CO2 flow rate and extraction time on the yield of cashew kernel oil
综合考虑各萃取因素之间的交互作用对腰果仁油得率的影响，进一步确定超临界萃取的最优工艺条件，以最大腰果仁油得率为优化目标，根据Design-Expert 10.0.3 软件运行结果，腰果仁油得率在萃取温度、萃取压强、CO2 流量、萃取时间等因素共同影响下的最优提取工艺为萃取温度45.273 ℃、萃取压强39.966 MPa、CO2 流量4.216 L/min、萃取时间1.591 h，该条件下模型预测的腰果仁油得率为46.239%。
2.2.4 验证试验
根据软件预测结果，结合实际工艺条件设置的精确性与可行性，选择萃取温度45 ℃、萃取压强40 MPa、CO2 流量4.2 L/min、萃取时间1.6 h 萃取制备腰果仁油，进行3 次重复试验，平均得率为46.41%。该试验结果与模型预测结果较接近，表明基于该响应面模型分析优化腰果仁油萃取的最佳制备工艺有效可行。
2.3 腰果仁油的脂肪酸成分分析
利用最佳萃取条件下制备的腰果仁油，经过甲酯化处理后，通过气相色谱仪进行检测分析。图11 为37种脂肪酸甲酯标准品气相色谱图，图12 为制备的腰果仁油样品脂肪酸甲酯气相色谱图，通过与37 种脂肪酸甲酯标准品出峰时间进行比较，定性分析脂肪酸种类，采用面积归一法，计算脂肪酸相对含量。超临界CO2 萃取的腰果仁油中不同脂肪酸的含量见表4。
图11 37 种脂肪酸甲酯标准品气相色谱图
Fig.11 Gas chromatogram of 37 fatty acid methyl esters
图12 超临界CO2 萃取腰果仁油样品脂肪酸甲酯气相色谱图
Fig.12 Gas chromatogram of fatty acid methyl esters in cashew nut oil samples extracted by supercritical CO2
表4 超临界CO2 萃取腰果仁油脂肪酸相对含量
Table 4 Fatty acid relative content analysis of cashew kernel oil extracted by supercritical CO2
不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）名称 含量/% 名称 含量/%油酸（C18∶1） 58.42 棕榈酸（C16∶0） 11.160亚油酸（C18∶2） 18.75 硬脂酸（C18∶0） 9.890棕榈油酸（C16∶1） 0.42 花生酸（C20∶0） 0.640二十碳烯酸（C20∶1） 0.15 肉豆蔻酸（C14∶0） 0.024 γ-亚麻酸（C18∶3） 0.14二十碳三烯酸（C20∶3） 0.11花生四烯酸（C20∶4） 0.11二十碳五烯酸（C20∶5） 0.11
由表4 可知，超临界CO2 萃取的腰果仁油中，不饱和脂肪酸相对含量达78.21%，与橄榄油（86.7%）相比略低。其中油酸含量最高，亚油酸次之，相对含量分别为58.42%、18.75%。油酸是一种长链不饱和的n-9 系列脂肪酸，其分子结构中含有18 个碳原子和1 个不饱和双键，这种特殊的单不饱和结构决定了油酸具有较强的氧化稳定性[17]，从而使腰果仁油具有较长的保质期。高油酸植物油区别于普通植物油，在营养保健功能方面发挥重要作用，有研究发现高油酸植物油能够增强大鼠胰岛细胞胰岛素分泌功能，降低机体血糖水平[18]，调节肠道菌群，改善机体代谢紊乱[19]，此外油酸含量较高的植物油在维持心脑血管健康方面具有重要作用，尤其是能降低心脑血管疾病患者血清中总胆固与低密度脂蛋白胆固醇的含量[20]。
3 结论
本研究以腰果仁油得率为考察指标，发现萃取时间对腰果仁油得率影响最大，CO2 流量次之，萃取压强、萃取温度影响较小。优化后的超临界CO2 流体萃取腰果仁油的最佳条件为萃取温度45 ℃、萃取压强40 MPa、CO2 流量4.2 L/min、萃取时间1.6 h，该条件下腰果仁油的得率为46.41%。通过气相色谱技术检测到腰果仁油中含有12 种脂肪酸，分别为油酸、亚油酸、棕榈油酸、二十碳烯酸、γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、肉豆蔻酸，其中饱和脂肪酸相对含量为21.714%，不饱和脂肪酸相对含量为78.21%，单不饱和脂肪酸相对含量为59.0%，多不饱和脂肪酸相对含量为19.21%。
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