枸杞（Lycium barbarum L.）是我国重要的药用植物资源，主要生长在我国西北地区[1]。枸杞鲜果属于浆果，富含人体所需的蛋白质、维生素、氨基酸和微量矿物质元素等营养物质，能增强人体免疫力，还具有抗衰老、抗癌和抗氧化的功效[2-3]。枸杞的传统食用方法主要是干果泡水饮用，然而，干果制备过程中抗坏血酸、类胡萝卜素和各种维生素流失严重[4]。新鲜枸杞具有独特的风味和丰富的多糖等活性物质，因此深受消费者的喜爱[5]。但是新鲜枸杞水分含量高、皮薄，采后易腐烂。因此，延长新鲜枸杞的贮藏期和提升枸杞贮运品质对于商业价值提升意义重大[6-7]。常用的贮藏方法有低温贮藏法、气调贮藏法、涂膜贮藏法等。其中低温贮藏法受限于枸杞最适贮藏温度（0±1）℃，因此其效果有限。气调贮藏法中的1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）可以抑制枸杞鲜果的呼吸作用从而延长贮藏期，但仅能减缓贮藏后期腐败味的产生，对枸杞外观品质没有明显改善。涂膜法存在化学试剂、水分残留导致的商品价值降低等问题。
在鲜果产销链“预冷-诱抗-贮藏-运输-销售”五大环节中“诱抗”往往被忽视，通常通过短时的冷、热、光、缺氧、高氧等不同的诱抗因子刺激果蔬，改变果蔬原有的代谢行为，实现贮藏期过程“抗性”增强[8-10]。同时，果蔬气调贮藏广泛应用于果蔬贮藏，通过改变贮藏环境中气体浓度降低果蔬呼吸强度，具有高效、安全、无污染、操作简单等优点[11-12]。而关于枸杞鲜果在短时高浓度CO2 等气体应激条件下鲜果品质的变化的研究较少。因此，本文采用不同高浓度二氧化碳短时间应激耦合1-MCP 熏蒸处理枸杞鲜果，探究高浓度二氧化碳短时间应激耦合1-MCP 熏蒸对枸杞鲜果贮藏期品质的调控规律，以期为简单、高效、绿色的枸杞节能应激保鲜技术体系构建提供支持。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
枸杞鲜果：选用宁夏回族自治区中卫市中宁县的“宁杞9 号”秋季果，田间采摘形态饱满、色泽鲜亮、带梗枸杞后，12 h 内空运至天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室。
L-苯丙氨酸：上海源叶生物科技有限公司；聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）（分析纯）：深圳市杜奥科技有限公司；愈创木酚（分析纯）：上海瀚香生物科技有限公司；30% H2O2（分析纯）：上海时代生物科技有限公司；三氯乙酸（分析纯）：上海太仓沪试试剂有限公司；1-甲基环丙烯：山东奥维特生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
CheckPoint 3 （O2/CO2） 气体成分分析仪：丹麦Dansensor 公司；EPOCH-1908028 酶标仪：美国博腾仪器有限公司；PAL-1 数显折光仪：ATAGO（爱拓）中国分公司；GXH-3051H 果蔬呼吸测定仪：北京均方理化科技研究所。
1.3 试验方法
预处理方案参考王瑞庆等[13]的方法并稍作修改，枸杞鲜果运至实验室后，选用形状、颜色、大小均匀，无裂痕、瑕疵、水渍的鲜果，放入温度（0±1）℃、相对湿度（93±3）%，0.1 μL/L 的1-MCP 密封环境下进行预冷熏蒸24 h。然后将熏蒸好的50 kg 鲜枸杞平均分成4 个组别，除对照组外，其余3 组分别放入密闭气调箱中，用氮气迅速排尽箱中空气（O2 浓度＜0.1 %），分别充入不同体积的二氧化碳，使箱内气体浓度分别达到20%CO2、50% CO2、80% CO2，进行短时30 min 密闭应激处理。最后4 组鲜果贮藏于（0±1）℃、相对湿度（93±3）%的环境下15 d，每3 d 随机对枸杞进行指标评价。各组做3 个重复。
1.3.1 呼吸强度
枸杞鲜果呼吸强度采用果蔬呼吸测定仪测量，每次称量（20.5±0.5）g 鲜果放入果蔬呼吸测定仪的气室，测量气室内CO2 生成量的变化，并重复3 次[14]。呼吸强度[A，mg/（kg·h）]计算公式如下。
式中：C0 为空白试验呼吸罐中CO2 总量，%；C1 为测定后呼吸罐中CO2 总量，%；M 为CO2 的摩尔质量，44.01 g/mol；V 为气室体积，L；V0 为测定温度下CO2 摩尔体积，44.7 mL/mol；m 为鲜果质量，kg；t 为测量时放入气室中的时间，h。
1.3.2 失重率
枸杞贮藏前从各处理组中分别随机取出适量鲜果放入保鲜盒内，记录第0 天枸杞样本质量为M0，贮藏期内每3 d 测定样本质量Mt，每组重复3 次称重[15]。失重率（B，%）以初始总重的减重百分比表示，公式如下。
式中：M0 为贮藏第0 天待测样本质量，kg；Mt 为贮藏期内待测样本质量，kg。1.3.3 腐烂指数
贮藏的枸杞鲜果根据枸杞鲜果表面的腐烂程度进行分级（0～4 级）。评定标准：腐烂面积总面积50%～100%为4 级腐烂程度；25%～50%为3 级腐烂程度；10%～25%为2 级腐烂程度；0%～10%为1 级腐烂程度；果面无生霉腐烂现象为0 级腐烂。腐烂指数（C，%）的计算公式如下。
式中：Rt 为腐烂级别；Nt 为腐烂级别对应的鲜果腐烂数量；R 为腐烂最高级别；N 为总果数量。
1.3.4 可溶性固形物含量
可溶性固形物（soluble solid content，SSC）含量通过数显折光仪显示的数值确定，以质量分数（%）表示[16]。
1.3.5 脂氧合酶活性
脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的活性采用曹建康等[17]的方法。以每克果蔬样品每分钟吸光值变化值增加0.01 为一个LOX 活力单位（U），单位为U/（min·g）。
1.3.6 过氧化物酶活性
过氧化酶（peroxidase，POD）的活性采用曹建康等[17]的方法。每克果蔬样品每分钟吸光值变化值增加1 为1 个过氧化物酶活力单位（U），单位为U/（min·g）。
1.3.7 苯丙氨酸解氨酶活性
苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性测定采用曹建康等[17]的方法。每小时每克果蔬组织（鲜重）酶促反应体系吸光值增加0.01 为1 U，单位为U/（h·g）。
1.3.8 丙二醛含量
参考曹建康等[17]的方法。采用硫代巴比妥酸法测定果实中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，单位为μmol/g。
1.4 数据处理与分析
每个测量数据进行3 个平行，采用SPSS 13.0 进行数据分析，所得数据为平均数±标准差。
2 结果和分析
2.1 不同浓度CO2 应激对鲜食枸杞采后失重率和腐烂指数的影响
CO2 应激对枸杞鲜果外观品质影响见图1。
图1 枸杞鲜果不同处理组在贮藏期15 d 后的外观差异
Fig.1 Appearance of fresh goji berries treated with different methods and stored for 15 d
由图1 可知，50%高CO2 应激处理组在15 d 贮藏后外观品质最好，仍能保持较好的光泽和颜色。
枸杞鲜果在贮藏期15 d 内失重率的变化见图2。
图2 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内失重率的变化
Fig.2 Changes in weight loss rate of fresh goji berries within 15 d of storage
由图2 可知，随着贮藏时间的延长失重率逐渐上升，3 个高浓度CO2 应激处理组均低于对照组，其中50% CO2 应激处理组失重率表现最佳，20% CO2 应激处理组次之，对照组最差，这也与枸杞鲜果呼吸强度变化趋势相似，可能是因为高浓度CO2 处理通过抑制呼吸作用，从而减少了因呼吸产生的水分流失。贮藏15 d 时50% CO2 应激处理组失重率为（0.31±0.01）%，对照组为（0.48±0.01）%。高浓度CO2 应激可降低枸杞秋果贮藏期间水分流失或自身营养物质的消耗，这与焦丽霞等[18]研究的100% CO2 处理4 h 能延缓蒜薹衰老的结果相似。
CO2应激处理的枸杞鲜果腐烂指数变化规律见图3。
图3 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内腐烂指数的变化
Fig.3 Changes in the decay index of fresh goji berries within 15 d of storage
由图3 可知，贮藏期内CO2 应激处理组的鲜果腐烂指数均低于对照组，其中50% CO2 应激处理组表现最佳，80% CO2 应激处理组次之，均明显降低了鲜果腐烂指数的升高。贮藏第15 天时50% CO2 处理组的腐烂指数仅为（9.60±0.07）%，而对照组高达（53.32±0.26）%。说明50%、80%浓度的CO2 应激处理可以抑制枸杞鲜果腐烂，可能是激发了枸杞抗病反应机制，这也与PAL活性变化趋势相符。
2.2 不同浓度CO2 应激对鲜食枸杞采后呼吸强度和SSC 的影响
呼吸强度是果蔬采后生理代谢强度的重要指标，低温、气调均是降低果蔬采后呼吸强度的重要手段[19]。1-MCP 与高浓度CO2 应激对枸杞鲜果呼吸强度和可溶性固形物含量的影响见图4～图5。
图4 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内呼吸强度的变化
Fig.4 Changes in the respiratory intensity of fresh goji berries within 15 d of storage
图5 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内可溶性固形物含量的变化
Fig.5 Changes in the soluble solids of fresh goji berries within 15 d of storage
由图4 可知，枸杞各处理组在第3、9 天均出现明显的呼吸峰，而高浓度CO2 应激并没有改变新鲜枸杞呼吸峰的出现时间，但在贮藏中CO2 处理均表现出了对呼吸强度不同程度的抑制，与赵游丽等[20]用低温胁迫可降低枸杞呼吸强度的研究结果相似。从整体上看50% CO2 处理组在贮藏前期抑制效果最佳，20% CO2处理组在贮藏后期同样具备良好的抑制效果。
由图5 可知，枸杞鲜果随着贮藏时间的延长SSC变化波动较大，50%高浓度CO2 应激改变了SSC 的变化趋势，整体表现优于对照组，这与真空预冷结合微孔膜包装处理枸杞后变化结果一致[21]。80% CO2 组和20% CO2 组则明显低于对照组的SSC 含量，不利于SSC 的积累。而50% CO2 短激处理，快速改变了鲜果代谢途径，与对照组相比，贮藏前期提高了可溶性固形物含量积累，贮藏后期含量保持在较高水平，说明该处理能够更有效保持鲜果营养成分，在贮藏过程中使鲜果能保持良好的风味。
2.3 不同浓度CO2 应激对鲜食枸杞贮藏期间PAL 和POD 活性的影响
PAL 是一种抵御病原菌或响应应激反应的关键酶，常在果蔬抵御病原菌侵害过程起着重要作用[22]。高浓度CO2 应激对枸杞鲜果贮藏期间PAL 活性的调控效应见图6。
图6 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内苯丙氨酸解氨酶活性的变化
Fig.6 Changes in the phenylalanine ammonialyase activity of fresh goji berries within 15 d of storage
由图6 可知，除了第6 天，50% CO2 组和80% CO2组的PAL 活性相较于对照组有明显提高，而20% CO2组与对照组的鲜果PAL 活性变化无明显差异。可见在一定范围内，高浓度的CO2 短时处理可以诱导鲜食枸杞的应激效应，有效提高枸杞鲜果贮藏期间的鲜果抗性，这与水核苹果在脉冲CO2 气调贮藏中PAL 活性升高的结果一致[23]。
POD 作为一种果蔬组织内重要的抗氧化酶，是果蔬清除自由基的关键酶[24]。CO2 应激处理对枸杞鲜果POD 的活性调控见图7。
图7 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内过氧化物酶活性的变化
Fig.7 Changes in the peroxidase activity of fresh goji berries within 15 d of storage
由图7 可知，随着贮藏时间的延长，各组的POD活性整体均呈上升趋势，高浓度CO2 应激处理较对照组在贮藏前期有效提高了POD 活性水平，这与Lin 等[25]利用95% CO2 处理双孢菇12 h 明显提高POD 活性增强其抗氧化能力的研究结果一致。由此可见，高浓度CO2 应激在前期有效提升了枸杞鲜果清除自由基的能力，可能是果蔬应激后抗性自由基提升的对应效果，而贮藏后期清除自由基的代谢途径回归正常。
2.4 不同浓度CO2 应激对鲜食枸杞贮藏期间MDA 含量和LOX 活性的影响
MDA 是膜脂氧化中间产物的重要指示性指标，其积累会造成果蔬细胞质和细胞膜的伤害[26]。CO2 应激处理对枸杞鲜果MDA 含量的影响见图8。
图8 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内丙二醛含量的变化
Fig.8 Changes in the malondialdehyde content of fresh goji berries with 15 d of storage
由图8 可知，MDA 含量随着贮藏时间的延长整体呈现上升趋势。20% CO2 应激可延缓枸杞鲜果的MDA积累，而50%和80% CO2 应激处理组的MDA 含量除第0、9 天外，均明显高于对照组。这可能由于CO2 应激后细胞应激代谢造成一定的过氧化反应[27]。过高浓度的CO2 应激处理对于枸杞细胞膜结构有一定的损害。
LOX 作为能特异性催化膜脂不饱和脂肪酸氧化的关键酶，枸杞鲜果在贮藏期15 d 内脂氧合酶活性的变化见图9。
图9 枸杞鲜果在贮藏期15 d 内脂氧合酶活性的变化
Fig.9 Changes in the lipoxygenase activity of fresh goji berries within 15 d of storage
由图9 可知，随着贮藏时间的延长，LOX 活性呈整体下降的趋势。贮藏前期高浓度CO2 应激可有效抑制LOX 活性，当贮藏第6 天时，50%、80% CO2 应激处理组LOX 活性高于对照组。除第6 天外，12 d 内CO2应激处理组的LOX 活性明显低于对照组。这一研究结果与提高豆芽生长环境中的CO2 浓度降低LOX 活性和95% CO2 处理双孢菇12 h 缓解细胞氧化损伤的结果相似[25，27]。适宜浓度高二氧化碳应激处理虽能刺激MDA 的积累、但也能抑制LOX 活性。
3 结论
果蔬采后在短时间内其呼吸作用会有明显增强，这不利于果蔬采后的贮藏运输，而通过1-MCP 进行预冷熏蒸，可降低因采后田间热和呼吸作用增强造成的失水以及腐烂变质。本文在此基础上，以高浓度CO2应激保鲜技术结合1-MCP 对鲜食枸杞秋果贮藏期的保鲜效果进行了探究。结果表明，高浓度CO2 应激处理可与1-MCP 进行有机结合，通过高浓度CO2 对枸杞的短时应激作用，通过提高PAL、POD 等抗性酶活力，抑制LOX 活力并与抑制呼吸作用的1-MCP 共同作用，减少鲜果内部因呼吸代谢造成的品质劣变及不必要的营养消耗。与单一的1-MCP 处理组进行对比，复合处理组的保鲜效果更为突出，CO2 短时应激可以明显改善1-MCP 对外观品质无法起到良好保护作用的缺点。复合处理的枸杞鲜果在贮藏期间的呼吸强度和腐烂指数都得到了明显的抑制，并降低了鲜果采后失重率，改善枸杞贮藏中外观品质下降的问题，提高鲜果自身抗性，延长了新鲜秋枸杞的贮藏货架期。综上，50% CO2 应激处理30 min 对鲜食枸杞秋季鲜果贮藏期品质调控效果最佳，失重率最低，短期内对抗胁迫关键酶PAL 的激活效果最佳。
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