小米属于我国主要粮食作物之一，被誉为“五谷之首”，具有高产、高抗逆性、适口性好等特点[1]。小米营养价值较高，富含蛋白质、淀粉、矿物质、多酚及维生素[2-3]，具有调理肠胃、降血压等生理功能[4]，深受消费者的青睐。小米谷糠是小米加工中的副产物，含量约占10% [5]，含有丰富的营养物质和功能性成分[6]。目前，已有研究证明从小米谷糠中提取的功能成分可应用于食品、医药、化妆品等领域[7-8]。但其附加值的持续性开发和功能性的开发，尤其在食品领域产品的应用仍处于起步阶段。
人体如果常年处于亚健康状态，则会造成人体免疫力低下并引起各种疾病。免疫力低下的主要原因为机体氧化反应过程中产生的氧自由基等强氧化性有害物质摧毁细胞膜，使细胞不能吸收外界营养成分，并丧失对细菌、病毒的抵御能力，因此引起疾病[9-10]。寻找一种抗氧化营养补充剂清除机体自由基，增加机体免疫力，改善人体亚健康状态为当前的研究热点及难点。
天然多糖因其低毒性等生物活性被广泛用于功能食品或制药原料，在降血糖、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤及免疫调节等临床治疗中发挥重要作用[11-14]。葡萄糖、阿拉伯木聚糖等单糖是小米谷糠多糖的主要成分，研究证实小米糠水溶性非淀粉多糖中包含的多酚、黄酮物质，可清除自由基、改善肠道环境[7，15]，但关于小米多糖抗氧化和免疫调节能力的相关研究鲜有报道，并且其在天然多糖活性物质用于调控巨噬细胞活化和细胞因子的产生，促使免疫系统高效应答领域的相关研究仍处于基础阶段。本试验以小米谷糠多糖为研究对象，通过对小米谷糠多糖的分离纯化，并对其体外抗氧化活性进行测定，结合细胞实验进一步验证小米谷糠多糖的抗氧化及免疫调节能力，以期为小米谷糠多糖的高值开发和综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红谷小米谷糠：黑龙江省大庆市肇州托古小米厂；WST-1 试剂：北京北化精细化学品有限公司；1，1-二苯基-2 - 三硝基苯肼（1，1 -diphenyl -2 -trinitrophenylhydrazine，DPPH）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒、酶联免疫吸附测定（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA） 试剂盒、肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）：南京建成生物工程研究所；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、RPMI-1640 培养基、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：青岛高科园海博生物技术有限公司；抗体：北京天根生化科技有限公司；RAW246.7细胞：中国科学院上海生命科学研究所细胞库；抗坏血酸、α-淀粉酶（5 U/mg）、葡萄糖淀粉酶（2×104 U/mL）、蛋白酶（1 500 U/mg）、Griess 试剂、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-2-y1）-2，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]：上海源叶生物科技有限公司；DEAE-52 纤维素层析柱：北京百奥莱博科技有限公司；总RNA 抽提试剂（total RNA extraction reagent，Trizol）试剂：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
AR2140 型分析天平、BIO-RAD 550 型微孔板检测器：瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL16B 型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；DGG-9053A 型电热鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；MJ-10A 型磨粉机：上海市浦恒信息科技有限公司；SP-2000UV 型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；D9000型96 孔荧光定量PCR 仪：苏州北科震泽生物科技有限公司；CLM-170B-8-NF 型二氧化碳培养箱：新加坡ESCO 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 小米谷糠多糖的提取、分离与纯化
1.3.1.1 小米谷糠多糖的提取
参考文献[14]和[16]，利用水提醇沉的方法进行小米谷糠多糖的提取。将采集后的小米谷糠干燥、粉碎、过筛（80 目），称取200 g 的小米谷糠粉，100 ℃热水浸提1 h 后[料液比1∶10（g/mL）]，3 000 r/min 离心15 min，收集上清液；双酶法去除淀粉和蛋白质（α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶）；灭酶离心后，加入4 倍体积的85%乙醇，醇析溶液在室温（28±2）℃条件下于搅拌器上搅拌过夜，8 000 r/min 离心10 min，收集沉淀后用95%浓度乙醇洗涤，真空浓缩后，40 ℃进行干燥，得到沉淀为小米谷糠多糖（millet polysaccharide，MP）。
1.3.1.2 小米谷糠多糖的分离纯化
称取200 mg MP，溶于10 mL 蒸馏水中，以0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L NaCl 为洗脱液，经DEAE-52 纤维素层析分离纯化得到两种小米谷糠多糖组分MP-1 和MP-2。
1.3.1.3 小米谷糠多糖含量的测定
将提取的小米谷糠多糖溶于1 mL 水中，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量[17]。以葡萄糖为标品，绘制葡萄糖标准曲线，最后得到的拟合线性回归方程为Y=0.014 8X-0.003 6，决定系数r2=0.998 9，按照如下公式计算小米谷糠多糖含量（W，mg/g）。
式中：C 为提取液中多糖含量，mg/mL；D 为稀释倍数；V 为定容总体积，mL；m 为小米谷糠质量，g。
1.3.1.4 洗脱蛋白含量
以胎牛血清蛋白为标品，蛋白质含量采用Bradford法进行测定[18]。以K2SO4 为标品，使用0.5 mol/L HCl 水解小米谷糠粗多糖后，通过BaCl2-明胶法测定硫酸盐含量[19]。
1.3.2 小米谷糠多糖分子量的测定
小米谷糠多糖的相对分子量采用体积排阻色谱-示差检测器-激光光散射联用技术（size-exclusion chromatography-differential refractive index-multi-angle laser light scattering，SEC-RI-MALLS）检测，采用Aglient PL aquagel-OH 凝胶色谱柱，0.2 mol/L 醋酸铵作为流动相，柱温控制在30 ℃，每次进样量为20 μL，洗脱液流速为0.7 mL/min[20]。
1.3.3 小米谷糠多糖体外抗氧化活性分析
1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力的测定
参考Abu Bakar 等[21]的方法，分别取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2） 和VC溶液各1 mL，加入至2 mL 2×10-4 mol/L DPPH 标准液和无水乙醇溶液中，避光静置30 min，在517 nm 波长下测定吸光度。DPPH 自由基清除率计算公式如下。
式中：X 为DPPH 自由基清除率，%；Am 为样品吸光度；AT 为对照吸光度；A0 为空白吸光度。
1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力的测定
参考王兰英等[22]的方法，分别取0.5、1.5、2.5 mg/mL小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2）和VC 溶液各1 mL，加入至3 mL ABTS 溶液和无水乙醇溶液中，黑暗条件下放置1 h，测定734 nm 处的吸光度。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
式中：Y 为ABTS+自由基清除率，%；Am 为样品吸光度；A0 为空白吸光度。
1.3.3.3 羟基自由基清除能力的测定
参照李兰[1]的方法，分别取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2）和VC 溶液各1 mL，加入到反应体系（6 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L H2O2）中，在37 ℃水浴中反应30 min，乙醇代替样品做空白组，于510 nm 处测定吸光度。羟基自由基清除率计算公式如下。
式中：Z 为羟基自由基清除率，%；Am 为样品吸光度；A0 为空白吸光度。
1.3.3.4 总抗氧化能力的测定
小米谷糠多糖的总抗氧化能力测定采用T-AOC检测试剂盒进行检测，分别取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2）和VC 溶液各1 mL，操作方法严格按照试剂盒操作步骤进行测定。
1.3.4 小米谷糠多糖免疫活性能力测定
1.3.4.1 细胞系和细胞培养
巨噬细胞RAW246.7 培养于添加了10% FBS 的RPMI 培养基中，在37 ℃和5% CO2 培养箱中培养[23]。
1.3.4.2 小米谷糠多糖对RAW264.7 细胞NO 的影响
RAW264.7 细胞接种于96 孔板（1×106 /mL）中，并在CO2 培养箱中培养24 h 后，去除培养基加入200 μL含有不同浓度（25、50、100 μg/mL） 的小米谷糠多糖MP、MP-1、MP-2 和LPS（1 μg/mL）的培养基，继续孵育24 h 后，吸取上清液，分别使用Griess 试剂和MTT 试剂测定细胞NO 产量和细胞增殖情况[24-25]，在550 nm处用酶标仪测量吸光度。
1.3.4.3 RAW264.7 细胞mRNA 表达的定量分析
分别用小米谷糠多糖MP、MP-1、MP-2（25、50、100 μg/mL）和LPS（1 μg/mL）处理RAW264.7 细胞（1×106 /mL）24 h。使用Trizol 试剂提取总RNA，测定RNA浓度后使用oligo -dT20 引物和Superscript III RT Takara 构建cDNA。β-actin 用作内标，所用引物详情见表1。TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌量采用ELISA 试剂盒测定。
表1 实时定量PCR 分析中使用引物信息
Table 1 Primer information used in RT-PCR
mRNA 引物序列TNF-α 正向 CCCCCACAGTCAAAGACACT反向 TACAGGCTTGTCACTCGAATT iNOS 正向 CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG反向 GGGAGTAGC CTGTGTGCACCTGGAA IL-1β 正向 ATGGCAACTATTCCAGAACTCAACT反向 CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT IL-6 正向 TTCCTCTCTGCAAGAGACT反向 TGTATCTCTCTGAAGGACT IL-10 正向 TACCTGGTAGAAGTGATGCC反向 CATCATGTATGCTTCTATGC β-actin 正向 ATGTGCAAAAAGCTGGCTTTG反向 ATTTGTGGTGGATGATGGAGG
1.3.4.4 小米谷糠多糖对RAW264.7 细胞特异性受体的影响
RAW264.7 细胞（1×106 个/mL） 通过TLR4、TLR2或CR3 单克隆抗体（10 μg/mL）预培养2 h，然后通过MP-1（100 μg/mL）或LPS（1 μg/mL）刺激RAW264.7 细胞产生NO，其NO 检测方法同1.3.5.2。
1.4 数据统计与分析
采用Excel 2017、SPSS 20.0 软件对数据统计分析，用Origin 软件进行绘图处理，每次试验重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 小米谷糠多糖分离纯化结果
小米谷糠多糖梯度洗脱结果见图1，多糖含量和化学成分见表2。
图1 小米谷糠多糖梯度洗脱
Fig.1 Elution gradient for millet bran polysaccharide
表2 小米谷糠多糖化学成分分析
Table 2 Chemical composition of millet bran polysaccharide%
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
小米谷糠多糖 提取率 多糖含量 蛋白质含量 硫酸盐MP 11.27 MP-1 53.14±0.52b 59.78±0.81b 12.58±0.31a 13.17±0.62a±1.11a 78.58±0.93a 9.78±0.55b 7.42±0.90c MP-2 41.29±0.72a 45.78±1.21c 7.63±0.34c 8.47±0.71b
如图1 所示，经过凝胶柱洗脱后的小米谷糠多糖，洗脱峰较为单一且对称。小米谷糠经过水提醇沉后得到小米谷糠多糖，其含量为11.27%，且主要含有59.78% 多 糖、12.58% 蛋白质及少量硫酸盐。经过DEAE-52 纤维素层析分离纯化得到两个组分MP-1（蒸馏水洗脱）和MP-2（0.5 mol/L NaCl 洗脱），含量分别是53.14%和41.29%，由表2 可知各纯化组分主要由多糖（78.58%和45.78%）、蛋白质（9.78%和7.63%）和少量硫酸盐（7.42%和8.47%）组成。以上结果表明，小米谷糠多糖MP 为硫酸化多糖，且经过分离纯化后得到化学成分比例有所不同。
2.2 小米谷糠多糖分子量
对纯化后小米谷糠多糖各组分的分子量进行检测，组分的分子量分布如图2 和表3 所示。
图2 小米谷糠多糖分子量分布
Fig.2 Molecular weight distribution of millet bran polysaccharide
a.MP；b.MP-1；c.MP-2。UV.紫外检测；RI.示差折光检测。
表3 小米谷糠多糖分子量
Table 3 Molecular weight of millet bran polysaccharide
样品 分子量/kDa 波长/nm MP 16.4±7.8 31.2±0.1 MP-1 14.1±5.5 31.2±0.1 MP-2 13.9±1.6 31.4±0.1
由图2 和表3 可知，MP、MP-1 和MP-2 的分子量分别为16.4、14.1、13.9 kDa，多糖保留时间约为50 min，其中小米谷糠多糖MP 具有较高的分子量，而纯化后的小米谷糠多糖MP-1 和MP-2 分子量逐渐降低。这可能是因为纯化除去了部分非多糖类的小分子物质，从而降低MP-1 和MP-2 多糖的分子量[26-27]。
2.3 小米谷糠多糖体外抗氧化活性分析
机体在进行一系列的生命活动时，不可避免会产生自由基，对人体造成严重的氧化损伤，威胁机体健康。因此机体需要大量能抵抗自由基的抗氧化物质，消除自由基对细胞的氧化攻击[28]。本试验采用体外实验检测小米谷糠多糖的自由基清除能力及总抗氧能力的影响。小米谷糠多糖的体外抗氧化能力的测定结果见图3。
图3 小米谷糠多糖体外抗氧化活性分析
Fig.3 Antioxidant activity of millet bran polysaccharide in vitro
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，在小米谷糠多糖浓度为0.5～2.5 mg/mL时，DPPH 自由基清除率呈上升趋势，且当浓度为2.5 mg/mL 时，MP-1 中DPPH 自由基清除率高达63.45%。与对照组相比，小米谷糠多糖中ABTS+自由基清除率、羟基自由基清除率的变化趋势同DPPH 自由基清除率变化趋势一致，MP-1 的自由基清除能力最强，最高清除率分别为64.12%和54.26%。机体对外界的防御能力与抗氧化能力有关，并与人体健康存在密切的联系，因此检测小米谷糠多糖的总抗氧化能力可以代表小米多糖的抗氧化能力的强弱[29-30]。由总抗氧化能力结果可知小米谷糠多糖的抗氧化活性呈剂量依赖性，当多糖浓度在2.5 mg/mL 时，MP-1 的抗氧化能力优于MP-2 和MP。因此，MP-1 具有较好的抗氧化活性。
2.4 小米谷糠多糖对RAW264.7 细胞NO 产量及细胞增殖测定结果
免疫系统主要通过识别和消灭外来有害物质来预防各种疾病的发生，因此免疫系统对机体健康起到至关重要的作用[31]。本研究采用RAW264.7 巨噬细胞来验证小米谷糠多糖对免疫系统的影响。NO 作为一种重要的炎症因子，可由经多糖等物质刺激活化后的巨噬细胞产生，具有杀死肿瘤细胞和致病微生物等作用[32]，因此NO 可以作为小米谷糠多糖对免疫系统调节效果的重要指标。RAW264.7 细胞NO 产量及细胞增殖见图4。
图4 RAW264.7 细胞NO 产量及细胞增殖
Fig.4 NO production and proliferation of RAW264.7 cells
不同字母表示与LPS 的差异显著（P＜0.05）；* 表示与对照组的差异显著（P＜0.05）。
由图4 可知，浓度为25～100 μg/mL 的小米谷糠多糖及其纯化组分均能显著刺激RAW264.7 细胞NO 的产生，并呈现一定的剂量依赖性，其中相同药物计量浓度下，MP-1 的NO 产量高于MP 和MP-2，且当小米谷糠多糖MP-1 浓度为100 μg/mL 时，NO 产量与LPS（1 μg/mL）刺激得到的NO 产量相近。而通过RAW264.7 细胞增殖实验结果可知，与RPMI 对照组相比，小米谷糠多糖及其纯化组分均对细胞无毒副作用，并具有促进细胞增殖的效果，由此说明小米谷糠多糖具有增强机体免疫活性的效果，其中MP-1 效果最显著。
2.5 RAW264.7 细胞mRNA 表达的定量分析
研究表明调节免疫反应的NO 主要由3 种形式的一氧化碳合成酶（carbon monoxide synthetase，NOS）产生，其中诱导型一氧化碳合成酶（inducible carbon monoxide synthetase，iNOS）为其中的主要形式，其能够在癌症治疗、肿瘤细胞凋亡及活菌抑制中大量产生[24]。因此本试验通过RT-PCR 技术来验证NO 产量最高的小米谷糠多糖纯化组分MP-1 对iNOS mRNA 的相对表达量的影响，结果如图5 所示。
图5 RAW264.7 细胞mRNA 表达的定量分析
Fig.5 Quantitative analysis of mRNA expression in RAW264.7 cells
a.PCR 结果；b.mRNA 表达含量。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图5 可知，随着MP-1 浓度的增加，RT-PCR 电泳检查得到的iNOS mRNA 表达水平随之增加，但与LPS 存在一定差异。表明iNOS 能够促进NO 的产生，从而验证MP-1 对RAW264.7 巨噬细胞的激活作用。通过检测促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 的基因表达量，结果表明荧光条带的强度随着多糖浓度的增加而增加，而相关研究表明炎症因子的过量表达会导致严重的炎症反应，对机体产生毒副作用，而IL-10炎症因子能够激活反馈抑制作用，其显著的荧光强度表明IL-10 能够进行反向调节炎症因子的产生[33]。综上，小米谷糠多糖MP-1 能够激活巨噬细胞进而正向调节其免疫活性。
2.6 小米谷糠多糖RAW264.7 细胞特异性受体的分析
研究表明巨噬细胞会通过其细胞膜上的特异性受体识别病原体并发挥免疫作用，因此多糖等刺激物需要与相关受体特异性结合进而刺激免疫细胞活化从而产生促炎因子[34]。因此本试验在确定MP-1 能够促进巨噬细胞活化并正向调节机体免疫的基础上，利用TLR4、TLR2 及CR3 特异性抗体来探讨RAW264.7巨噬细胞与MP-1 谷糠多糖分子的相互作用机制，结果如图6 所示。
图6 RAW264.7 细胞特异性受体的分析
Fig.6 Specific receptor of RAW264.7 cells
不同字母表示差异显著（P<0.05）。
由图6 可知， 在TLR4 抗体的存在情况下，RAW264.7 的NO 产量显著降低并与MP-1 单独存在条件下的NO 产量存在显著差异，但TLR2 及CR3 抗体对于MP-1 激活RAW264.7 细胞产生NO 的抑制效果不显著，因此可以得出MP-1 多糖与巨噬细胞的相互作用的主要受体为TLR4。
3 结论
本试验通过水提醇沉法得到小米谷糠多糖MP 并经过分离纯化得到两种纯化多糖（MP-1 和MP-2），分子量分别为16.4、14.1 kDa 和13.9 kDa，其中MP-1 的多糖得率和含量最高，分别为53.14%和78.58%。通过体外抗氧化实验证明，小米谷糠多糖具有较强的DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS+自由基清除率，有望作为一种潜在的天然、易得的抗氧化剂资源。此外，小米谷糠多糖可通过刺激巨噬细胞释放NO 和细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β），进而增强免疫调节活性而且对RAW264.7 细胞无毒性，其中MP-1 具有显著促进NO产生及细胞增殖的能力，从而调节机体免疫能力。因此，小米谷糠多糖可以作为新型的抗氧化及免疫调剂补充剂用于功能性食品的生产和加工。
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