生物胺（biogenic amine，BA）是一类具有生物活性且含有氨基的有机化合物的总称[1-2]，广泛存在于蛋白质含量较高的水产食品中[3]。在水产品体内微生物中酶的作用下，水产品会发生腐败变质，在此过程中生成大量生物胺，人体摄入过量生物胺易引发中毒。在水产品腐败变质过程中尸胺、腐胺、组胺和酪胺为主要生成的4 种生物胺[4]，因此，本文选取尸胺、腐胺、组胺和酪胺作为评价抗菌肽对生物胺控制的指标，通过观察4 种生物胺含量的变化，分析生物胺的生成和水产品腐败变质的程度。
秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）是茎柔鱼的俗称，生长速度快[5]、体型较大、颜色偏白、肉质细腻、营养丰富，是一种高蛋白、低脂肪、低胆固醇的美味食品，且价格低廉，适合作为食品加工的原料。秘鲁鱿鱼含有丰富的氨基酸和蛋白质[6-7]，极易在贮藏和运输过程中受微生物的影响产生大量生物胺，从而导致生物胺中毒。生物胺的前体物质一般是氨基酸，生物胺主要是由游离的氨基酸经微生物的脱羧作用或经氨基酸脱羧酶脱羧产生[8]。组胺是由组氨酸脱羧酶对组氨酸脱羧作用后产生的一种生物胺，在水产品中毒性最强，因此可选取组胺为评价指标[9-10]。抗菌肽是一种小分子多肽，在动物的非特异性免疫中起着重要的免疫抗菌作用[11-14]，且在水产品中大多具有免疫、广谱抗菌作用[15]，可用作真菌、细菌和寄生虫等的抑制剂[16]。目前国内外有关秘鲁鱿鱼的研究主要集中在蛋白质氧化程度和抗氧化肽方面[17-20]，对其加工过程的产胺菌、生物胺的生成以及抗菌肽的研究较少[21]，关于抑制秘鲁鱿鱼体内生物胺的生成和对鱿鱼的品质控制的研究鲜有报道。
因此本文选取秘鲁鱿鱼为研究对象，进行海蟹源抗菌肽[22]、牡蛎源抗菌肽和带鱼源抗菌肽作为单一生物胺抑制剂的单因素试验并调配复合保鲜抑制剂，通过正交优化试验得到其最优浓度比。验证该复合保鲜抑制剂对以组胺为代表的生物胺的影响，评价该复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼品质控制的能力，以期为秘鲁鱿鱼在贮藏加工中安全质量的监控提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
秘鲁鱿鱼：舟山市福瑞达食品有限公司，在无菌条件下，将鱼切开，依次去内脏团、去头、去皮、洗净、沥尽水分备用。腐胺二盐酸盐、尸胺、组胺二盐酸盐、酪胺盐酸盐标准品（纯度均≥99.0%）：德国Dr Ehrenstorfer公司；海蟹源抗菌肽（crab antibacterial peptide，CAP）、牡蛎源抗菌肽（oyster antibacterial peptide，OAP）、带鱼源抗菌肽（hairtail antibacterial peptide，HAP）：舟山市常青海洋食品有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（FA2004）：上海精密科学仪器有限公司；冷柜（BC/BD-829HN）：青岛海尔股份有限公司；高速冷冻离心机（BR4i）：法国Jouan 公司；高速均质器（T18 生物胺ic 型）：德国IKA 公司；全自动凯氏定氮仪（HGK-57）：上海赫冠仪器有限公司；高速组织捣碎机（DS-1 型）：上海标本模型厂；超纯水系统（Milli-QELIX51 型）：美国Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1 单因素试验设计
考察3 种水产蛋白抗菌肽（OAP、CAP 和HAP）对秘鲁鱿鱼中4 种生物胺含量的影响。3 种水产蛋白抗菌肽的浓度设定均为1%、2%、3%，每个水平设3 个重复。
1.3.2 3 种水产蛋白抗菌肽溶液的配制
试验选取3 种水产蛋白抗菌肽（OAP、CAP 和HAP）作为生物胺抑制剂，以秘鲁鱿鱼为研究对象，根据倪佳丹等[23]、黄明焜等[24]的方法配制3 种生物胺抑制剂溶液，稍作修改，探究3 种生物胺抑制剂溶液对水产品生物胺的抑制效果。分别称取1、2、3 g 的OAP、CAP和HAP 并将9 组抑制剂加入超纯水定容至100 mL，混匀后即得到浓度为1%、2%、3%的3 种溶液。将以上配制好的溶液，置于4 ℃条件下备用。
1.3.3 正交试验
在单因素试验的基础上，正交试验以秘鲁鱿鱼为研究对象，选用3 种水产蛋白抗菌肽为生物胺抑制剂，以3 种抗菌肽抑制剂浓度为自变量，鱼肉样品在4 ℃下贮藏6 d 后对组胺的抑制率为响应值，评价各因素对生物胺的抑制作用，设计三因素三水平的正交试验，因素与水平见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平因素A牡蛎源抗菌肽浓度/%C带鱼源抗菌肽浓度/%1 1.00 1.00 1.00 2 2.00 2.00 2.00 3 3.00 3.00 3.00 B海蟹源抗菌肽浓度/%
1.3.4 组胺抑制率的计算
根据测定出的组胺含量，计算组胺抑制率，评价复合保鲜剂对组胺的抑制作用，其中抑制率（Y，%）按下式计算。
式中：X对照为对照组组胺含量，mg/kg；X试验为试验组组胺含量，mg/kg。
1.3.5 验证试验
将试验组（即200 g 样品+10 mL 复合保鲜抑制剂，用干净玻璃棒充分搅拌混合均匀）的鱼肉浆液和对照组（200 g 样品+10 mL 超纯水）的鱼肉浆液，分装后置于4 ℃条件下贮藏，测定各组样品的组胺含量。
1.3.6 挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）值的测定
利用半微量定氮法测定TVB-N 值。取10 g 秘鲁鱿鱼肉剪碎，移至消化管，加入1.0 g 氧化酶，加少许蒸馏水摇匀，采用凯氏定氮仪进行TVB-N 值的测定。
1.3.7 菌落总数的测定
参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[25]中的方法，采用平板计数法测定菌落总数，结果以lg（CFU/g）表示。
1.3.8 菌落总数抑制率的计算
根据测定出的菌落总数，计算菌落总数抑制率，评价复合保鲜剂对菌落总数的抑制作用，其中抑制率（A，%）按下式计算。
式中：B对照为对照组菌落总数，lg（CFU/g）；B试验为试验组菌落总数，lg（CFU/g）。
1.4 数据处理
所有试验均重复3 次。获得的数据采用Excel 2013 与SPSS 18.0 进行统计分析，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与讨论
2.1 抗菌肽对秘鲁鱿鱼体内多种生物胺的影响
2.1.1 牡蛎源抗菌肽对生物胺的影响
牡蛎源抗菌肽对生物胺的影响见图1。
图1 牡蛎源抗菌肽对4 种生物胺含量的影响
Fig.1 Effects of oyster antimicrobial peptides on four biogenic amines content
由图1 可知，随着贮藏时间的延长，对照组与3 组试验组的鱼肉中4 种生物胺含量均呈上升趋势。经OAP 处理后的鱼肉中4 种生物胺含量整体上均低于对照组，且2%OAP 作用下的鱼肉中4 种生物胺含量均低于1%和3%OAP 作用下的含量，由此推断2%OAP 抑制效果最佳，可能是由于3%OAP 对鱼肉的结构造成了破坏，导致了OAP 浓度为3%时比浓度为2%时更容易产生生物胺。
2.1.2 海蟹源抗菌肽对生物胺的影响
海蟹源抗菌肽对生物胺的影响见图2。
图2 海蟹源抗菌肽对4 种生物胺含量的影响
Fig.2 Effects of crab antimicrobial peptides on four biogenic amines content
由图2 可知，在0～2 d 内4 种生物胺含量变化较小，可能是由于初期样品中的微生物基数较小且游离氨基酸较少，从而产生的生物胺含量较低。经3%CAP处理后的秘鲁鱿鱼肉中4 种生物胺含量最低，由此推断，3%CAP 的抑制作用更强。在整个贮藏期间对照组的4 种生物胺含量均高于试验组，是由于抗菌肽具有免疫、广谱抗菌作用，可以有效阻止微生物中酶的作用，从而抑制秘鲁鱿鱼肉中生物胺的生成。因此，再次证实CAP 可有效抑制生物胺的生成。
2.1.3 带鱼源抗菌肽对生物胺的影响
带鱼源抗菌肽对生物胺的影响见图3。
图3 带鱼源抗菌肽对4 种生物胺含量的影响
Fig.3 Effects of hairtail antimicrobial peptides on four biogenic amines content
由图3 可知，随着贮藏时间的延长，对照组与3 组试验组的鱼肉中4 种生物胺含量均呈上升趋势，且在第2 天后试验组的4 种生物胺含量均低于对照组，表明HAP 对生物胺的生成起到了有效的抑制作用。第2天后3 种浓度的HAP 处理后的秘鲁鱿鱼肉中4 种生物胺含量接近，推测3 种浓度的HAP 对4 种生物胺的抑制效果相似。
2.2 复配保鲜抑制剂正交优化试验
在前期单因素试验的基础上，进一步研究3 种水产蛋白抗菌肽对秘鲁鱿鱼肉中生物胺的综合抑制作用。选用上述3 种水产蛋白抗菌肽调配复合保鲜抑制剂，按其添加剂量不同将其分为9 组复合保鲜抑制剂，对牡蛎源抗菌肽、海蟹源抗菌肽及带鱼源抗菌肽的添加水平设计三因素三水平正交试验，通过正交优化试验得出在4 ℃条件下贮藏6 d 后，各水平的样品中组胺含量和组胺抑制率[对照组组胺含量为（57.87±1.89）mg/kg]，结果见表2。
表2 正交试验结果与极差分析
Table 2 Results and range analysis of orthogonal test
序号 A B C 组胺含量/（mg/kg）组胺抑制率/%1 1.00 1.00 3.00 23.75 58.96 2 1.00 2.00 2.00 18.40 68.17 3 1.00 3.00 1.00 17.95 68.98 4 2.00 1.00 3.00 17.52 69.72 5 2.00 2.00 2.00 14.97 74.13 6 2.00 3.00 1.00 14.81 74.40 7 3.00 1.00 3.00 17.94 69.00 8 3.00 2.00 1.00 17.90 69.07 9 3.00 3.00 2.00 17.58 69.62 K1 37.817 38.130 40.980 K2 42.100 40.757 40.867 K3 40.063 41.090 38.130极差R 4.283 2.960 2.850因素主次A>B>C较优搭配A2B3C1
由表2 可知，在应用复合保鲜抑制剂后第6 组的组胺含量最低，且对组胺抑制率可达74.40%，因此第6 组对组胺抑制效果最优。结合R 值的大小对比可知，牡蛎源抗菌肽是最优因素，其次是海蟹源抗菌肽和带鱼源抗菌肽。结合各因素的最佳水平可知，A 为2%、B为3%、C 为1%时最优。因此再次证实第6 组复合保鲜抑制剂为最优组合，即牡蛎源抗菌肽、海蟹类抗菌肽和带鱼源抗菌肽的浓度分别为2%、3%、1%，由此得出该试验配制的复合保鲜抑制剂的最佳浓度比为2∶3∶1。
2.3 验证试验
通过对正交优化试验结果的分析，优化浓度比后制得复合保鲜抑制剂。样品贮藏过程中复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼组胺的抑制率见表3。
表3 复合保鲜抑制剂对组胺含量变化的影响
Table 3 Effects of composite preservatives on histamine content
注：—表示未应用复合保鲜抑制，对组胺尚未起到抑制作用。
贮藏时间/d 组胺含量/（mg/kg) 组胺抑制率/%对照组 试验组0 36.74±1.75 36.31±1.64 —2 43.66±1.40 21.85±0.76 49.95±1.73 4 47.37±3.76 14.10±2.67 70.23±5.63 6 57.78±4.42 14.80±0.74 74.39±2.28 8 79.88±10.9 21.39±1.41 73.22±1.76 10 97.77±23.3 41.69±6.65 57.36±6.84
由表3 可知，在贮藏第6 天时，复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼肉样品的组胺抑制率可以达到74.39%。但随着贮藏时间的延长，复合保鲜剂对组胺的抑制效果有所下降，贮藏第10 天时，抑制率下降到57.36%。由此推断，虽然随着贮藏时间的延长复合保鲜剂对组胺的抑制率有所下降，但对组胺仍有较强的抑制作用。
2.4 复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中品质指标变化的影响
2.4.1 复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中生物胺含量变化的影响
复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中生物胺含量变化的影响见图4。
图4 秘鲁鱿鱼的生物胺含量变化
Fig.4 Changes in biogenic amine content of Dosidicus gigas
由图4 可知，两组样品在0～4 d 时3 种生物胺含量变化较小，可能是由于初期样品中的微生物基数较小且游离氨基酸较少，使得产生的生物胺含量较低。经复合保鲜抑制剂处理后，试验组的3 种生物胺含量均低于对照组，可能是因为随着贮藏时间的延长，微生物逐渐增多，且游离的氨基酸在脱羧酶的作用下生成生物胺。腐胺由鸟氨酸脱羧酶作用产生，因此推测具有鸟氨酸脱羧酶的微生物繁殖较快，试验组在抑制剂处理后阻碍了微生物生长，极大程度抑制了腐胺的产生。综上，复合保鲜抑制剂处理后的样品抑制了3 种生物胺的生成，从而延缓了鱼体的腐败时间，降低了鱼体的腐败程度，有利于秘鲁鱿鱼的品质控制。
2.4.2 复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中TVBN 值变化的影响
复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中TVB-N值变化的影响见图5。
图5 秘鲁鱿鱼TVB-N 值的变化
Fig.5 Changes in total volatile basic nitrogen of Dosidicus gigas
由图5 可知，随着贮藏时间的延长，TVB-N 值逐渐升高，是由于鱼的脂肪等物质不断氧化，在微生物的作用下，产生碱性物质。TVB-N 值升高意味着鱼体在微生物的作用下正处于腐败变质过程。经复合保鲜剂处理后的试验组，由于其微生物的繁殖受到限制，产生的碱性代谢产物也相对较少，因此TVB-N 值较低[26-27]。结果表明，在贮藏第10 天时试验组TVB-N 值为17.87 mg/100 g，仅为对照组的47.85%，证明该复合保鲜抑制剂对样品中TVB-N 值产生了明显的抑制作用，有利于秘鲁鱿鱼的品质控制。
2.4.3 复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中菌落总数变化的影响
复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中菌落总数变化的影响见图6。
图6 秘鲁鱿鱼的菌落总数变化
Fig.6 Changes in the total number of colonies of Dosidicus gigas
由图6 可知，随着贮藏时间的延长，对照组与试验组的菌落总数均呈上升趋势，且试验组的菌落总数均低于对照组，由此可见复合保鲜抑制剂具有一定的抑菌作用。贮藏第10 天时，复合保鲜抑制剂对菌落总数抑制率达到了33.02%，有很好的抑菌效果。对照组与试验组进行对比，结果显示试验组的微生物数量增加更缓慢。因此，再次证实复合保鲜抑制剂对微生物的生长有明显的抑制作用[28-29]。
3 结论
本试验以秘鲁鱿鱼为试验对象，以牡蛎源抗菌肽、海蟹源抗菌肽和带鱼源抗菌肽作为单一生物胺抑制剂，进行单因素试验，并将3 种水产蛋白抗菌肽配制成复合保鲜抑制剂进行三因素三水平的正交优化试验及验证试验，优化了复合保鲜抑制剂的最佳浓度比并分析其对组胺的抑制效果，通过观察TVB-N 值、菌落总数及多种生物胺含量的变化，评价贮藏期间该复合保鲜抑制剂对鱿鱼品质的影响。试验结果表明，3 种水产蛋白抗菌肽均能够有效减缓鱿鱼体内生物胺的形成，对生物胺有明显的抑制作用；正交试验优化了复合保鲜抑制剂的最佳浓度比为2∶3∶1；验证试验表明到贮藏第6 天时对组胺的抑制率为74.39%，第10天时下降到57.36%，虽然随着贮藏时间的延长对组胺的抑制率有所下降，但是复合保鲜剂对组胺仍有较强的抑制作用。试验组的样品在贮藏过程中TVB-N 值显著低于对照组，且在贮藏第10 天时试验组TVB-N 值为17.87 mg/100 g，仅为对照组的47.85%，表明试验组对TVB-N 值的升高产生了明显的抑制作用，说明该复合保鲜抑制剂有利于延缓鱿鱼品质的劣变；贮藏第10 天时复合保鲜抑制剂对菌落总数的抑制率达到了33.02%。研究结果表明，该复合保鲜抑制剂不仅有效抑制了生物胺的生成，还有利于鱿鱼品质的控制。本试验通过抗菌肽复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼生物胺的控制及品质的影响进行初步分析，可为秘鲁鱿鱼贮藏期内的保鲜提供基础的理论依据。
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