清香型白酒被认为是中国白酒的起源，可分为大曲清香酒、麸曲清香酒和小曲清香酒[1]，其中华中地区的清香型白酒主要以大曲清香为主，以湖北“石花”品牌为代表[2]。大曲清香型白酒主体香气成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯，主要来源于低温大曲和环境中微生物的代谢[3]。由于在“培曲”工艺上的不同，低温大曲可分为后火、青茬和红心三类[4]，研究表明，不同类型的低温大曲细菌群落结构存在一定的差异[5]。采用高通量测序技术，栾春光等[6]对汾酒3类低温大曲的微生物群落结构和理化指标的差异性进行了分析，发现毕赤酵母（Pichia）和曲霉属（Aspergillus）等菌属与青茬大曲酯化力的提升具有密切相关性，而酿酒酵母属（Saccharomyces）、 维 克 汉 姆 酵 母 产 香 酵 母（Wickerhamomyces）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）对红心曲糖化力和液化力的提升具有积极作用，此外亦发现根霉属（Rhizopus）可促进后火低温大曲酯化力的提升。
后火低温大曲在“潮火期”、“干火期”和“后火期”的温度较青茬曲偏高，而低于红心曲，其断面呈现灰黄色，普遍存在两道黑线，根据颜色的不同通常可分为曲皮和曲心两部分[4]。后火低温大曲的糖化力、液化力和发酵力低于青茬曲，而高于红心曲，但出酒率在三类大曲中最高[4]。虽然在实际生产中通常将后火低温大曲整块粉碎后使用，但对其曲皮和曲心的微生物差异性进行分析，对后续制曲工艺的改良具有指导作用。作为第二代测序技术的代表，Illumina MiSeq高通量测序技术不需要分离培养微生物，能直接捕获样品中微生物的群落结构[7-8]，目前已经广泛应用于中国白酒酒醅[9-10]、窖泥[11-12]和酒曲[13-14]的微生物群系解析中。
作为华中地区大曲清香型白酒的代表，石花酒以高粱、糯米为原料，使用低温大曲经地缸发酵而成[2]，其生产地为湖北省襄阳市谷城县，位于中国四大河流中的汉水流域中段。目前国内学者对山西汾酒酿造用低温大曲的微生物多样性进行了系统解析，但围绕华中地区清香型白酒酿造用大曲微生物群落结构的报道尚少。本研究真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS），采用 Illumina MiSeq高通量测序技术对后火低温大曲真菌群落结构进行解析，对曲皮和曲心中的真菌类群进行甄别，以期为后续制曲工艺的改良和华中地区酿酒微生物资源的挖掘提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
后火低温大曲：采集自湖北省石花酿酒股份有限公司曲库。
DNA基因组提取试剂盒：德国QIAGEN公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs） 混合物、5×聚合酶链式反应（polymerase chain reaction buffer，PCR）缓冲液、DNA 聚合酶：宝生物工程（大连）有限公司；引物ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）/ITS4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）：武汉天一辉远生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Fluor Chem FC3化学发光凝胶成像系统：美国Protein Simple公司；vetiri梯度基因扩增仪：美国AB公司；Illumina MiSeq PE250高通量测序平台：美国Illumina公司；Power Edge R930架式服务器：美国DELL公司；800Y粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品的采集
选取库存30d～35d的后火低温大曲，共采集10份，模具大小为37 cm×18 cm×7 cm。根据截面情况将外部白色区域定为曲皮（编号为QP1～QP10），将内部偏黄部分定为曲心（编号为QX1～QX10），相同数字编号为同一样品。将各样品用粉碎机粉碎封存于无菌袋中并置于-40℃低温条件下贮存备用。
1.3.2 DNA的提取、真菌ITS区PCR扩增及Illumina MiSeq高通量测序
按照生产商的使用说明对后火低温大曲样品进行宏基因组DNA提取，参照陈怡等[15]的方法对真菌的ITS序列进行PCR扩增。使用琼脂糖凝胶对PCR产物进行鉴定，使用Illumina MiSeq PE250高通量测序平台将扩增合格的产物进行测序。
1.3.3 序列质控及生物信息学分析
参照Wang等[16]的方法对下机序列进行质控。参考Du等[17]的方法，物种分析和多样性评估使用QIIME（v1.90）平台进行分析，大致流程为建立分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）、UNITE 数据库进行同源性比对以及多样性分析。
1.4 数据统计
使用两配对样本的非参数（Wilcoxon符号秩）检验和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）分析后火低温大曲曲皮和曲心间真菌的差异性；使用Excel 2016进行数据处理；使用R软件（v4.1.0）和Origin 2017进行绘图；线性判别分析效应大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）算法使用Huttenhower实验室Galaxy服务器的在线网页（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/） 对 P＜0.05的菌群进行甄别。
2 结果与分析
2.1 α多样性分析
通过对20份样品进行Illumina MiSeq高通量测序，共得到高质量序列1 424 879条，平均每个样品71 244条（范围：63 862条～74 023条，标准差 2 415）。根据100%和97%相似度划分去除单序列后得到了857个OTU，平均每个样品321个（范围：248～406个，标准差56）。当测序深度为63 010条序列时，通过Wilcoxon符号秩检验对Chao 1指数和Shannon指数进行分析，比较了曲皮和曲心中真菌群落的丰度和多样性，结果见图1。
图1 低温大曲不同部位真菌α多样性指标比较分析
Fig.1 Comparative analysis of α diversity indexes in different parts of low-temperature Daqu
A.Chao 1指数；B.Shannon指数。
由图1可知，曲皮和曲心真菌类群的Chao 1指数的值分别为432±39和511±59，Shannon指数的值分别为0.87±0.10和2.15±0.48。经Wilcoxon符号秩检验发现曲皮和曲心中Chao 1指数差异非常显著（P＜0.01），Shannon指数差异极显著（P＜0.001）。由此可见，后火低温大曲曲心的真菌丰富度和多样性均显著高于曲皮。
2.2 β多样性分析
本研究进一步对曲皮和曲心的β多样性进行了分析，结果如图2所示。
图2 基于UniFrac距离加权和非加权的低温大曲不同部位真菌群落结构主坐标分析
Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of fungal community structure in different parts of low-temperature Daqu based on weighted and unweighted UniFrac distance
A.加权；B.非加权。
由图2可知，基于加权和非加权UniFrac距离对曲皮和曲心间β多样性进行分析均发现两组之间有明显的分离趋势。由图2A可知，第一主成分和第二主成分的总贡献值高达99.35%，大部分曲心样品分布于坐标轴左侧，所有的曲皮样品分布于坐标轴右侧，由图2B也可得出相似的结论。经MANOVA分析发现，曲皮和曲心样品间差异极显著（P＜0.001），这说明后火低温大曲曲皮和曲心样品间真菌物种组成存在显著差异。
2.3 曲皮、曲心样品物种组成分析
本研究将在20个样品中平均相对丰度超过1.00%的真菌门或属定义为优势真菌门或属，小于1.00%的门或属定义为“Others”，而不能鉴定到门或属水平的序列定义为“unclassified”。纳入本研究的后火低温大曲样品中真菌类群可鉴定为3个门、6个纲、8个目、17个科和18个属，后火低温大曲曲皮和曲心中优势真菌门和属的相对含量比较分析如图3所示。
图3 基于门和属水平的低温大曲不同部位真菌构成分析
Fig.3 Fungal community composition in different parts of lowtemperature Daqu at phylum and genus levels
A.门水平；B.属水平。
由图3A可知，根据UNITE数据库，99.95%的序列被鉴定为子囊菌门（Ascomycota），10份低温后火大曲中Ascomycota的相对含量均>99.73%，为优势菌门。由图3B可知，在属层面上，曲皮中的优势真菌属主要为复膜孢酵母属（Saccharomycopsis，98.92%）。曲心中的优势真菌属主要为Saccharomycopsis（58.20%）和Aspergillus（40.97%）。由此可见，后火低温大曲曲皮和曲心中的微生物群落结构以及分布均存在一定差异，与图2结果一致。经Wilcoxon符号秩检验发现，Saccharomycopsis在曲皮中极显著偏高（P<0.001），Aspergillus在曲心中显著偏高（P<0.01）。
与曲皮相比后火低温大曲中曲心的物种丰富度和多样性均较高，究其原因可能是由于在后火阶段随着水分的蒸发，曲心中的水分含量高于曲皮，微生物最后向水分较高的曲心发展[18]。罗惠波等[19]对山西汾酒3种低温大曲的真菌群落进行分析发现，后火大曲中的优势菌为Pichia。张双燕等[20]对北京地区低温大曲中微生物多样性进行分析发现，优势真菌种群以假丝酵母属（Canndida）、Aspergillus、毛霉属（Mucor）和Wickerhamomyces为主。这与本文研究结果有所差异，可能是由原料、工艺条件以及环境等因素引起的。
2.4 基于OTU水平真菌多样性分析
本研究将在20个样品中均存在的OTU定义为核心OTU。后火低温大曲曲皮和曲心真菌OTU分布结果如图4所示。
由图4A可知，后火低温大曲中共存在857个OTU，其中曲心中注释的OTU总量高于曲皮，曲皮中仅注释到572个OTU，而曲心中注释到757个OTU。所有样品中共有的OTU有91个，但包含了1 342 093条序列，占所有序列的94.19%。由图4B可知，所有样品中均存在且相对含量>1.00%的OTU仅2个，分别为OTU776（70.84%）和 OTU1183（17.91%），其中 OTU776隶 属 于 Saccharomycopsis，OTU1183 隶 属 于 Aspergillus，这进一步证实了 Saccharomycopsis和 Aspergillus为后火大曲中的优势真菌属。酵母菌有利于酒精发酵，同时也影响相关酶系的产生，曲霉等具有较强的产酶能力，能促进酵母菌的生长繁殖，进而产生更多的酒精，对白酒的风味起着重要的作用[21]。
图4 OTU在不同样本中的分布和核心OTU相对含量瀑布图
Fig.4 Distribution of OTUs in different samples and waterfall plot of relative abundance of key OTUs
A.OTU分布图；B.核心OTU相对含量。
2.5 曲皮和曲心样品差异菌群分析
LEfSe分析常用于分类学水平物种特征及差异的认识与揭示[22]。为进一步解析后火大曲曲皮和曲心中真菌群落结构的差异，采用Lefse分析对其差异微生物进行了甄别，结果见图5。
图5 LEfSe分析
Fig.5 Cladogram of LEfSe
由图5可知，LEfSe的LDA阈值得分为3.0，共鉴定出8个丰度差异显著的类群（P<0.05），曲心和曲皮中各4个。结果表明，Saccharomycopsis可作为曲皮中的生物标志物，Aspergillus可作为曲心的生物标志物[23]。值得一提的是，曲皮中的优势真菌属为Saccharomycopsis，而曲心中的优势真菌属是Saccharomycopsis和Aspergillus。由此可见，后火低温大曲曲皮和曲心中真菌群落结构差异主要是由优势真菌属Saccharomycopsis和Aspergillus造成的。
3 结论
通过Illumina MiSeq高通量测序技术发现，石花后火低温大曲曲皮和曲心中真菌群落结构差异显著，曲心中真菌丰度和种类均显著偏高，曲皮中优势真菌属主要以Saccharomycopsis为主，曲心中以Saccharomycopsis和Aspergillus为主。进一步解析发现，造成曲皮和曲心样品中真菌群落结构差异的主要菌群为Saccharomycopsis和Aspergillus等优势真菌属。
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