六堡茶是具有1 500多年历史广西名茶、边销茶，原产于广西梧州六堡镇，以“红、浓、陈、醇”独特品质深受全国及东南亚国家消费者喜爱[1-3]。六堡茶主要采用苍梧群体种鲜叶为原料，经过特殊的冷水渥堆发酵、陈化工艺，形成具有黑茶特殊风味和滋味；其中六堡茶“陈”是指其香气，为影响消费者选择的重要因素，六堡茶除了陈香外还有参香、槟榔香、蜜香、枣香、馥郁香等16种香型[4-5]。茶叶香型其实是大量香气化合物相互影响并被人体嗅觉系统识别而成的，目前对于食品类香气成分提取、检测方法包括顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspace solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometer，HSSPME-GC-MS）[6]、顶空搅拌子吸附萃取气质联用技术（headspace stir bar sorptive extraction-gas chromatograph-mass spectrometer，HS-SBSE-GC-MS）[7]、二维气相色谱-质谱（飞行时间）联用技术[8]、气相色谱-嗅觉测量技术（gas chromatography olfactometry，GC-O）[9]、电子鼻技术[10]等；茶叶中关键香气成分鉴定方法包括香气活性值（odor activity value，OAV）[11]、相对香气活性值（relative odor activity value，ROAV）[12]和正交偏最小二乘判别分析法（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）[13]等。 相关学者利用上述分析手段鉴定黑茶类茶叶的香气主要成分有芳樟醇、雪松醇、萜品醇、1，2，3-三甲氧基苯、苯甲醛、1-甲基萘、二氢猕猴桃内酯等50余种[14-16]，温立香等[17]研究认为α-雪松醇、β-芳樟醇、二氢猕猴桃内酯、α-萜品醇和β-紫罗酮等是陈香六堡茶特征香气成分；黄林杰等[18]研究发现槟榔香型六堡茶关键香气成分为雪松醇、芳樟醇、水杨酸甲酯、苯甲酸甲酯等。
现代六堡茶厂茶生产工艺中六堡茶出香顺序为菌香、枣香、参香、木香、药香，其中枣香、参香为是采用轻发酵工艺则可以出香型，而菌香、木香为采用重发酵工艺出香型。参香六堡茶，为经过陈化10年以上六堡茶出类似中药材西洋参的特征香气，滋味特点是具有很甘甜口感；枣香六堡茶主要是红枣香气，其属于花果香类别较容易区分，红枣香为六堡茶熟茶所特有，香气特征是甜而带有红枣气味，红新发酵的半成品香味较为清淡，随着产品经过长期陈化后红枣香逐渐凸显。在目前六堡茶市场上具有显著参香、枣香的六堡茶比较受到消费者喜爱，但缺少相关特征香气成分及具体明确的生产工艺的研究。
本试验在企业陈化仓库中抽取相同工艺与陈化环境、不同陈化时间生产参香、枣香香气六堡茶各5批次样品，先采用感官审评方法筛选出参、枣香香气最显著样品，然后采用搅拌子吸附萃取技术对样品进行香气成分提取，再采用气质联用仪进行关键成分检测分析，鉴定各香型六堡茶中主要香气化合物名称及相对平均含量，最后各类香气化合物根据其相应香气阈值计算各自相对香气活性值，明确对六堡茶影响形成香型关键香气成分。本文旨在探索研究影响六堡茶香型的关键香气成分，为明确各类香型六堡茶鉴定与量化、品质控制提升、生产加工工艺研究提供理论数据。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
六堡茶样品：在企业陈化仓库中选取不同陈化时间（10年～20年）参香、枣香香气显著六堡茶各5份；茶样采用自封袋阴凉避光、密闭保存待用。癸酸乙酯、正构烷烃（C6-C30）（色谱纯，纯度＞98%）:上海 Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
GC7890B-5977B气相色谱-质谱仪联用仪（含DB-Wax气相色谱柱）：美国Agilent公司；GERSTE磁力搅拌棒：德国哲斯泰公司；TD100热脱附系统：英国玛珂思公司；手动固相微萃取进样器（含PDMS57348-U萃取头）：美国安耐普公司；HH-M4恒温水浴锅：上海赫田仪器公司；HX 7000超纯水发生器：美国默克公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品感官审评
参考国家标准GB/T 32719.4—2016《黑茶第4部分：六堡茶》中感官评价方法，由高级评茶员组成5人审评小组，对10批次样品进行密码评审并记录香型评语及打分，选出打分在85分以上且参香、枣香显著的六堡茶样品各一份，进行香气成分提取及成分分析。
1.3.2 样品香气提取
先取六堡茶样品2.00 g置于50 mL萃取瓶中，然后加入8.00 mL 100℃的超纯水搅拌均匀，然后将萃取瓶置于60℃恒温水浴锅中保温10 min，插入提取的搅拌萃取吸附子（提前老化1.5 h），顶空吸附60 min，取出吸附子立即放入脱附管。
1.3.3 香气成分测定
先将吸附子进行在热脱附系统热脱附香气后进样（一级热脱附280℃、10 min；二级热脱附300℃、5 min）。样品香气成分采用气质联用技术进行测定，色谱条件：进样口温度240℃，起始柱温50℃，保持5 min；先以1.5℃/min上升至170℃，再以10℃/min上升至210℃保持20 min。质谱条件：离子源为电子轰击（electron impaction，EI）；离子源温度为 230℃，采集模式为全扫描，扫描质量范围50.00 aum～650.00 aum。
1.3.4 试验数据处理与关键香气成分
采用气相色谱-质谱联用仪联合分析样品得到色谱图，通过计算机与NIST17质谱库进行检索与匹配，结合化合物的保留时间、匹配度等参数香气成分进行鉴别；香气各组分相对含量（Ci）采用各色谱峰面积与总峰面积比值的面积归一计算；计算出各香气组分相对含量后，根据化合物在水中香气阈值（Ti），由下式计算出各香气成分ROAV值，其中ROAV值大于等于1的化合物，为对样品香型起到决定性作用的关键香气成分，而ROAV值小于1的化合物，则为对样品香型起到修饰性作用的香气成分[19]。
式中：Cmax为对样品香型贡献最大组分的相对含量，%；Tmax为对样品香型贡献最大组分在水中的香气阈值，μg/L；Ci为样品经过搅拌子萃取出来的各香气组分平均相对含量，%；Ti为各香气组分在水中的香气阈值，μg/L。
2 结果与分析
2.1 参香、枣香六堡茶主要香气成分分析
2.1.1 香气成分分析
经过感官审评分别具有参香（陈化时间10年）、枣香（陈化时间15年）显著六堡茶样品2份，其香气具体各香气组分如表1所示。
表1 两种香型六堡茶香气成分组成及相对含量
Table 1 Composition and relative content of aroma components in two types of Liupao tea
枣香六堡茶香气平均相对含量/%烷烃类 1，2-二甲氧基苯 C8H10O2 1.07 0.96 1，2-二甲氧基-4-甲基苯 C9H12O2 1.03 1，2，3-三甲氧基苯 C9H12O3 0.36 1，2，4-三甲氧基苯 C9H12O3 0.17对甲氧基丙烯基苯 C10H12O 0.76 1，2-二甲氧基-4-乙基苯 C10H14O2 2.34 2.84 1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯 C10H14O3 2.58 1，2，3，4-四甲氧基苯 C10H14O4 1.19茶香螺烷 C13H22O 1.05小计 4.70 9.65醇类 己醇 C6H14O 2.18苯乙醇 C8H10O 1.16 1-辛烯-3-醇 C8H16O 0.71氧化芳樟醇I（呋喃型）C10H18O24.887.92氧化芳樟醇II（呋喃型）C10H18O24.546.14反-3，7-芳樟醇氧化物I C10H18O2 0.91 2.18反-3，7-芳樟醇氧化物II C10H18O2 1.40 β-芳樟醇 C10H18O 3.28 6.21 α-萜品醇 C10H18O 3.52 5.04 4-萜烯醇 C10H18O 2.09 2.33橄榄醇 C11H16O2 1.07类别 香气化合物 化学式参香六堡茶香气平均相对含量/%
续表1 两种香型六堡茶香气成分组成及相对含量
Continue table 1 Composition and relative content of aroma components in two types of Liupao tea
类别 香气化合物 化学式枣香六堡茶香气平均相对含量/%2-（2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基）乙醇参香六堡茶香气平均相对含量/%C11H20O 2.03 α-雪松醇 C15H26O 8.45 4.91小计 32.88 38.07酮类 2-庚酮 C7H14O 0.71反，反-3，5-辛二烯-2-酮 C8H12O 2.79 6-甲基-5-庚烯-2-酮 C8H14O 1.70异佛尔酮 C9H14O 1.84 3.62 2，2，6-三甲基环己烷酮 C9H16O 1.84 1.97 4-亚甲基-3，5，5-三甲基-2-环己烯-1-酮C10H14O 1.16 α-紫罗酮 C13H20O 2.85 5.54 β-紫罗酮 C13H20O 4.13 7.67 β-二氢紫罗酮 C13H22O 3.16 2.92香叶基丙酮 C13H22O 1.11 3.77 5，6-环氧-β-紫罗酮 C13H20O2 0.86小计 18.65 28.99醛类 正己醛 C6H12O 1.73苯甲醛 C7H6O 1.42壬醛 C9H18O 1.23癸醛 C10H20O 3.58藏红花醛 C10H14O 3.55 2.46 β-环柠檬醛 C10H16O 2.47 2.75小计 8.98 10.21烯类 苯乙烯 C8H8 0.86顺-β-罗勒烯 C10H16 6.77异松油烯 C10H16 6.14 3-蒈烯 C10H16 2.08柠檬烯 C10H16 1.58 α-柏木烯 C15H24 2.80 1.00 β-雪松烯 C15H24 5.40 β-柏木萜烯 C15H24 2.65小计 28.28 1.00杂氧化合物2，2，6-三甲基-3-酮-6-乙烯基四氢吡喃C10H16O2 2.04 1.59 2-正戊基呋喃 C9H14O 2.47 2.26小计 4.51 3.85酯类 水杨酸甲酯 C8H8O3 3.86二氢猕猴桃内酯 C11H16O2 2.01 4.43小计 2.01 8.29
试验采用搅拌子吸附萃取气质联用技术，共从样品中鉴定出七大类共51种香气化合物。由表1可知，两种香型六堡茶香气成分主要以醇类挥发性化合物为主，其相对含量约占到总香气成分的三分之一左右；两种香型六堡茶香气成分在烷烃类、醇类、醛类、杂氧化合物4类化合物相对平均含量相差不大，但在酮类、烯类、脂类3类化合物含量相差较大，特别是参香六堡香气成分中烯类化合物是枣香六堡茶的28倍，香气成分中氧化芳樟醇、芳樟醇、萜品醇、萜烯醇4种化合物相对平均含量超过总含量四分之一，为六堡茶香气的主要组成成分。茶叶香气中的醇类化合物通常具有花香、果香等香气，可以对茶叶香型形成具有较好的修饰、协调作用，比如芳樟醇类化合物具有强烈木香、花香和果香气息，芳樟醇氧化物化合物还有带有樟脑的气息，1-辛烯-3-醇化合物具有果香和木香气息，醇类香气化合物不但可以使香气具有浓郁、韵味持久的特点，同时还可以使茶汤产生滋味纯厚、鲜爽、回甘好的口感[20]；茶叶香气成分中醛类、酮类化合物通常具有花果香和清香；而甲氧基芳香烃类分化合物则是黑茶在陈化贮藏中形成特殊香气成分，比如1，2-二甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯、1，2，3，4-四甲氧基苯等化合物具有黑茶陈香特征气息，是六堡茶中“陈”的特殊风味主要贡献化合物，六堡茶中甲氧基芳香种类与相对含量随着陈化时间延长而不同[21]；茶叶香气成分中不饱和烃类化合物较饱和烃类化合物贡献比较大[22]。
虽然可以通过搅拌子萃取-气相色谱/质谱联用技术对参香、枣香显著的两个六堡茶样品进行香气成分及各相对平均含量测定，但是各香气成分对六堡茶香型的贡献大小却与其相对含量无直接关系，所以需要采用科学方法对其进行分析并评价出影响茶叶香型的关键香气成分。
2.1.2 关键香气成分ROAV分析
根据食品中相关香气研究发现，现在已发现的一万余种香气成分中，仅有一小部分化合物对食品中香气及风味起到关键决定作用，所以这一部分化合物也称关键香气成分[23]；食物的香气并不是简单直接与香气化合物相对含量高低相关，需要根据香气化合物相对应的ROAV值进行分析和鉴定，根据以上研究基础，参考相关文献各类化合物在水中的香气阈值[24]，计算两种香型六堡茶中香气ROAV值如表2、表3所示。
表2 参香六堡茶中主要香气成分
Table 2 List of main aroma components in Shenxiang Liupao tea
序号 香气化合物 化合物在水中香气阈值/（μg/L）ROAV值1 0.078 32.40 5 α-紫罗酮 0.40 15.52 6 5，6-环氧-β-紫罗酮 0.20 9.37 7 1，2-二甲氧基-4-乙基苯 0.75 6.80 8 1，2-二甲氧基苯 0.75 3.11 9壬醛 1.00 2.68 10 1-辛烯-3-醇 1.00 1.55 11 β-芳樟醇 6.00 1.19 12 β-环柠檬醛 5.00 1.08 13 1，2，3-三甲氧基苯 0.75 1.05 β-紫罗酮 0.09 100.00 2 α-雪松醇 0.50 36.83 3 β-二氢紫罗酮 0.20 34.43 4 4-亚甲基-3，5，5-三甲基-2-环己烯-1-酮
表3 枣香六堡茶中主要香气成分
Table 3 List of main aroma components in Zaoxiang Liupao tea
序号 香气化合物 化合物在水中香气阈值/（μg/L）ROAV值β-紫罗酮 0.09 100.00 2水杨酸甲酯 0.06 75.49 3苯乙醇 0.45 30.25 4 β-二氢紫罗酮 0.20 17.13 5 α-紫罗酮 0.40 16.25 6己醇 0.20 12.79 7 α-雪松醇 0.50 11.52 8癸醛 0.76 5.53 9 1，2-二甲氧基-4-乙基苯 0.75 4.44 10 1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯 0.75 4.04 1 11 1，2，3，4-四甲氧基苯 0.75 1.86 12 1，2-二甲氧基-4-甲基苯 0.75 1.61 13 1，2-二甲氧基苯 0.75 1.50 14 2-庚酮 0.68 1.23 15 β-芳樟醇 6.00 1.21
通过表2、3的ROAV值可以发现，参香、枣香六堡茶分别鉴定出13种和15种关键香气成分（ROAV值大于1）。β-紫罗酮水中香气阈值较低，具有甘甜醇厚的花香，是两种香型六堡茶ROAV最大香气成分，而紫罗酮类香气化合物具有明显木香香气特征，可以进一步氧化成二氢海葵内酯、茶螺烯酮等香气化合物，有研究认为其为黑茶香型主要贡献香气成分[25-26]。水杨酸甲酯为枣香型六堡茶独有香气成分，其具有与冬青叶相类似的薄荷香味，有研究发现水杨酸甲酯在一般在茶叶鲜叶或者绿茶中含量较高[27]。α-雪松醇是具有陈香、木香的香气成分，其在参香六堡茶中香气贡献作用大约是枣香六堡茶3倍，有学者认为α-雪松醇是黑茶类在陈化过程中产生的特有的香气成分[28-29]；在两个香型六堡茶样品中检测出多种含氧芳香烃类关键香气化合物，氧芳香烃类化合物一般具有陈味、霉味，被认为是黑茶在陈味产生主要香气成分，具有随着陈化发酵时间增加其在香气成分占比随着增加趋势[30-31]。芳樟醇又称为沉香醇，芳樟醇和橙花叔醇是决定茶叶花甜香的关键物质，芳樟醇在两种香型六堡茶中香气的ROAV值在1.2左右，说明其对六堡茶香型基本起到修饰作用；杨丽容等[32]研究发现老树茶香气成分中醇类化合物占70%以上，并且芳樟醇及其氧化物含量远高于其他化合物，因此认为芳樟醇及其氧化物是可以作为决定茶叶品质关键香气物质。
在六堡茶毛茶制作完成后进入了渥堆、陈化后发酵的阶段，在这阶段茶叶的内含物质通过微生物发酵过程中分泌胞外酶的酶促作用、微生物呼吸发酵产生的热量和六堡茶水分湿热作用等共同影响下生成新风味化合物，六堡茶的特殊香气成分也是在此阶段生成并不断变化，其由各自不同香气成分综合表现出来的香型也随着陈化时间产生变化：三年左右的六堡茶多呈现陈香，类似于荷香、樟香、兰香等，五年左右的六堡茶逐渐出现香气下沉趋势，呈现出栗香、木香、槟榔香，十年左右则会转化出参香、果糖香，超过十年甚至会转化出淡淡的枣香、蜜香，而六堡茶最终呈现出的香型也会受茶叶品质、存储条件的影响。六堡茶经过后发酵过程形成的各类陈香、参香、枣香香型，其实就是各种关键香气成分的改变后综合作用的结果。
3 结论
本文先通过感官评审筛选出两种参香、枣香显著的六堡茶样品，然后采用顶空搅拌子萃取-气相色谱/质谱联用技术对样品进行挥发性香气成分检测，试验从共鉴别出芳香烃、醇、酮、醛、烯、酯、杂氧化合物七大类共51种香气化合物，借鉴ROAV法从中鉴别出参香六堡茶13种、枣香六堡茶15种关键香气成分化合物。试验为科学鉴定、评价六堡茶各类香型提供关键香气成分数据，为研究不同香型六堡茶生产工艺及相关标准提供数据基础。
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