氨基酸是人体必需的营养成分，与生命活动密切相关。氨基酸作为合成体内蛋白质的前体物，同时某些氨基酸是一些功能性物质的前体物，因而具有生物活性功能[1]。如谷氨酸是脑组织生化代谢中的重要氨基酸，参与多种生理活动[2]；苏氨酸有利于增强人体免疫系统功能；天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸都是良好的营养增补剂[3]。氨基酸含量及比例可以反映食品的营养价值，食物蛋白质的氨基酸组成越接近人体氨基酸的需要，越易被人体消化吸收，其营养价值越高。研究发现，不同食物中各类蛋白质的氨基酸组成及比例均不同，植物性蛋白中大多数谷类的限制性氨基酸是赖氨酸和苏氨酸，而大多非谷类的第一限制性氨基酸则是蛋氨酸（含硫氨基酸）[4]。动物性蛋白中氨基酸更接近人体需要。研究人员使用多种蛋白源研制出了不同的食品，如合理氨基酸配比的杂粮馒头[5]、核桃多肽-苦荞-藜麦复合营养粉[6]、大豆-牛奶双蛋白益生菌酸奶[7]等。结果证明，当以蛋白质混合物的形式和特定比例加工为成品时，不仅能改善口味还可以提高氨基酸评分和生物利用率[8]。与单一的原料相比，多种蛋白源食品能更好地发挥原料的营养优势。
黄酒是一种富含氨基酸的低酒精度传统发酵饮料。随着社会发展，在黄酒中添加药食两用的原辅料经调制或直接发酵制得的黄酒因具有度数较低、营养丰富的特点而受到消费者喜爱。如黄芪熟地生晒参黄酒[9]、小米黄酒[10]、糯米莲藕黄酒[11]等，这些原辅料的加入不仅丰富了黄酒的风味口感，还增加了营养价值和保健功效。板栗作为一种较为理想的酿造原料应用于酿造产业中，其产品如板栗黄酒[12]、板栗大米清酒[13]中均含有丰富氨基酸。研究表明，板栗氨基酸种类齐全，含量较高的为谷氨酸和天冬氨酸，第一、第二限制氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸[14]。羊肉属于蛋白质含量较高的动物性食品。研究发现，羊肉蛋白质中必需氨基酸和非必需氨基酸比例均衡，是较为理想的肉制品。黄酒酿造过程中加入羊肉共同发酵的酿造方法也有悠久的历史，文献记载羊羔酒最早出现在北宋初期，在当时较为珍稀，价格昂贵，并具有滋补功效。李时珍在《本草纲目》中，认为羊羔酒：“大补元气，健脾胃，益腰肾”[15]。基于以上情况，本试验优化一种富含均衡氨基酸的板栗羊肉黄酒（mutton chestnut yellow rice wine，MCW）的酿造工艺，以传统黄酒发酵工艺为理论指导，根据板栗和羊肉均富含丰富蛋白质的特点，分别作为植物蛋白源和动物蛋白源，以酒曲发酵作用改善营养成分，通过氨基酸态氮含量及感官评分作为评价指标分析原料发酵程度、蛋白质水解程度及酒的香气风味，通过单因素和正交试验优化工艺条件，并以糯米黄酒、板栗黄酒（chestnut yellow wine，CW）、市售黄酒（yellow wine，YW）作为对比参照，检测其中氨基酸含量并进行营养评价，为多种蛋白源食品的研发提供借鉴，也为板栗、羊肉产品的深加工提供理论基础和技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料
早丰板栗、十二月龄左右羊腿肉、糯米、红曲：浙江丽水生物科技公司；小曲：湖南华伟铭化工科技有限公司；糯米黄酒（rice wine，RW，以糯米为原料采用工艺优化后条件酿造）、板栗黄酒（以板栗、糯米为原料采用工艺优化后条件酿造）：河北科技师范学院酿酒实验室自制；市售黄酒（三年花雕酒）：浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司。
1.2 仪器设备
蒸饭柜：河北德科机械科技有限公司；L530多管架自动平衡离心机：湖南湘仪仪器设备有限公司；PHS-25 pH指示计：上海仪电科学仪器股份有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：日本HITACHI公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 原料的选择
板栗羊肉黄酒原料要求：板栗品质优良、个体大小均一、无病虫害，糯米颗粒饱满、无病虫害，羊腿肉细嫩、新鲜。
1.3.2.2 原料的预处理
板栗脱壳洗净后切碎备用。糯米洗净后加水，室温（25℃）下浸泡12 h～15 h，至用手可以碾碎且无白心。将处理好的板栗和糯米分别放入蒸饭柜100℃蒸制50 min。将羊肉加水煮至变色即捞出，切成肉泥备用。将红曲与小曲在21℃～23℃下浸泡2 h活化备用。
1.3.2.3 冷却拌匀
将蒸好的糯米放在无菌纱布上，用冷水冲洗至米粒松散温度下降至室温（25℃），沥干水分。将洗好的糯米和预处理好的板栗、羊肉、酒曲按比例混合均匀。
1.3.2.4 糖化发酵
将混匀的原辅料放入陶罐中搭窝，19℃培养96 h之后加入1.3倍体积的水主发酵，每隔6 h搅拌1次。
1.3.2.5 过滤
发酵结束后用无菌纱布及脱脂棉分别进行多次粗滤，去除沉淀，之后将滤液进行抽滤得到澄清液体。
1.3.2.6 煎酒
将过滤后的酒样在60℃下持续20 min，以有效除菌，之后密封，阴凉处保存。
1.3.3 单因素试验
根据上述工艺流程，分别在不同板栗添加量（15%、20%、25%、30%、35%）； 不同羊肉添加量（6%、8%、10%、12%、14%）；不同小曲添加量（0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%）；不同红曲添加量（12%、13%、14%、15%、16%）；不同温度（14、16、18、20、22 ℃）；不同发酵时间（6、7、8、9、10 d）条件下，以感官评价、氨基酸态氮含量为指标，考察不同条件对发酵的影响。
1.3.4 正交试验
参照文献方法[16]，在单因素试验的基础上选取板栗添加量、羊肉添加量、小曲添加量、发酵时间4个因素以感官评价及氨基酸态氮含量为指标进行L9（34）正交试验，进一步筛选最优条件组合。正交因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of fermentation conditions
水平D发酵时间/d 1 15 8 0.6 7 2 20 9 0.7 8 3 25 10 0.8 9因素A板栗添加量/%B羊肉添加量/%C小曲添加量/%
1.3.5 感官评价
感官评分参照GB/T 13662—2018《黄酒》中感官指标要求制作感官评价表。感官评价由10名专业人士组成评价小组，对酒样色泽、香气、口味、风格打分，满分100分，取平均分，每人平行测试3次。感官评价标准见表2。
表2 感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation criteria
评价等级 色泽 香气 口味 风格优 橙黄、橙红色，透明清亮有光泽（16～20）具有板栗羊肉黄酒的特色，色、香、味协调（13～15）良 橙黄、橙红色，透明清亮，色泽略差（11～15）明显的板栗和羊肉特有的香气，酒香纯正浓郁（18～25）香甜可口，酸度适中，柔和爽口（31～40）具有板栗羊肉黄酒的特色，色、香、味较为协调（8～12）中 微微浑浊、透明，但光泽较差（6～10）具有板栗和羊肉香气，酒香纯正但香气不浓郁（12～17）香甜可口，纯正醇和，但口感不够柔和（21～30）酒体组分较协调，但特有的风格不显著（4～7）差 浑浊，缺乏黄酒该有的光泽（1～5）有酒香但不明显，香气之间不协调（6～11）酒味淡薄，略有酸涩，有熟味（11～20）产生使人不愉悦的气味（1～5）酒体淡薄，酸败，苦感明显，有异味（1～10）酒体组分不协调，风格不明显（1～3）
1.3.6 氨基酸态氮测定方法
氨基酸态氮含量按照GB/T 13662—2018《黄酒》中的方法进行测定。
1.3.7 氨基酸营养评价
1.3.7.1 氨基酸含量测定
参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》方法测定氨基酸含量。
所测定的氨基酸分为总氨基酸（total amino acids，TAA）、必需氨基酸（essential amino acids，EAA）、和非必需氨基酸（non-essential amino acids，NEAA）。
1.3.7.2 氨基酸营养评价
根据联合国粮农组织及世界卫生组织（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）1973年提出的建议，氨基酸评价使用标准模式将样品中氨基酸组成与人体必需氨基酸模式进行比对，计算样品中必需氨基酸的氨基酸比值（ratio value of amino acids，RAA）和氨基酸比值系数（ratio coefficient of amino acids，RCAA），最后计算求得氨基酸比值系数分（score of ratio coefficient of amino acids，SRCAA）[16]。其中RAA得分最低的为限制氨基酸。计算方法参考文献[17-19]，公式如下。
1.4 数据处理
所有试验均平行重复3次取平均值，数据使用Excel、SPSS、Origin 进行处理及绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 板栗添加量对发酵的影响
板栗富含丰富的淀粉及蛋白质，可以作为酿酒的原料以发酵的方式改善黄酒品质。其中淀粉是微生物新陈代谢的主要物质，可以调节酒的酸度，平衡口感；蛋白质为微生物生长代谢提供氮源，促进发酵进行。板栗添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响见图1。
图1 板栗添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响
Fig.1 Effect of chestnut addition on amino acid nitrogen content and sensory score
由图1可知，氨基酸态氮的含量在板栗添加量15%～20%时上升迅速，之后呈缓慢上升趋势。感官评分先升高后降低。板栗中的蛋白质可以被分解为多肽及氨基酸，既增加了营养成分又提供了呈味物质，但过高的板栗添加量容易导致蛋白质含量过高，细菌过度产酸使酒体浑浊，不利于发酵的进行，同时也会产生不良气味[20]。因此在保证营养及风味的基础上控制板栗的添加量在20%左右较为适宜。
2.1.2 羊肉添加量对发酵的影响
羊肉中的蛋白质被微生物分解为肽及氨基酸，其含量的高低可能会影响黄酒的质量等级和整体风味[21]。羊肉添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响见图2。
图2 羊肉添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响
Fig.2 Effect of mutton addition on amino acid nitrogen content and sensory score
由图2可知，随着羊肉添加量的增加，氨基酸态氮含量呈上升趋势，在羊肉添加量6%～10%时上升迅速，之后上升缓慢。感官评分先升高后缓慢下降。说明羊肉为酒体提供了大量的含氮有机物，使酒体具有较高的营养价值和独特的风味。过多的羊肉会造成大量脂质漂浮在表面隔绝气体交换，使厌氧菌大量繁殖影响口感。因此选择羊肉添加量8%左右为宜。
2.1.3 小曲添加量对发酵的影响
酒曲作为“酒之骨”，在黄酒发酵过程中提供大量酶和微生物，通过酶的分解和微生物的代谢催化底物形成醇类、酯类等物质构成黄酒独特的风味口感。小曲添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响见图3。
图3 小曲添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响
Fig.3 Effect of Xiaoqu addition on amino acid nitrogen content and sensory score
由图3可知，随着小曲添加量增多，氨基酸态氮含量随之升高，在0.7%之后增长变缓。感官评分在小曲添加量0.7%最高，之后开始降低。这是由于当小曲用量较低时糖化不足发酵缓慢，当小曲用量过大，虽然可以快速发酵，抑制其它杂菌生长，但微生物自身繁殖消耗大量糖分，代谢产物过多，加快菌体老化，不利于口感的协调[22]。因此小曲添加量在0.7%较为合适。
2.1.4 红曲添加量对发酵的影响
红曲是大米经过红曲霉等多种微生物发酵制成的一种酿造用曲，研究证明，通过酶解可产生氨基酸、有机酸、挥发性化合物等，对酒的风味香气作用显著[23]。红曲添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响见图4。类物质的代谢生成，较低的发酵温度可以有效降低黄酒中高级醇的含量和提高黄酒的香气品质[24]。因此在保证充分发酵的条件下选择18℃作为最佳发酵温度。
图4 红曲添加量对氨基酸态氮含量及感官评分的影响
Fig.4 Effect of red yeast rice addition on amino acid nitrogen content and sensory score
2.1.6 发酵时间对发酵的影响
发酵时间对氨基酸态氮含量及感官评分的影响见图6。
图6 发酵时间对氨基酸态氮含量及感官评分的影响
Fig.6 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen content and sensory score
由图4可知，随着红曲添加量的增加，氨基酸态氮含量先增加后略微下降，感官评分在小范围内出现波动。说明红曲的添加量在12%～16%这个范围对酒的发酵影响较小，选择13%作为红曲的最佳添加量。
2.1.5 温度对发酵的影响
温度影响微生物的生长繁殖进而影响黄酒的发酵。发酵温度对氨基酸态氮含量及感官评分的影响见图5。
图5 发酵温度对氨基酸态氮含量及感官评分的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen content and sensory score
由图5可以看出，随着温度的升高，氨基酸态氮含量缓慢上升，感官评分先缓慢增长后在19℃下降。这是由于随着温度的升高，微生物的代谢速度加快使蛋白质分解为氨基酸增加了氨基酸态氮含量，呈味氨基酸的增多也使气味口感得到改善。而过高的温度加快了微生物的衰老和凋亡，抑制了糖化发酵的进行，研究证明高温下微生物更容易代谢产生高级醇且不利于酯
由图6可知，氨基酸态氮在发酵8 d时增长逐渐变缓，感官评分也在第8天开始下降。发酵时间越长，淀粉及蛋白质水解程度越高，分解的总糖及含氮物质越多。微生物经历增殖繁衍的旺盛期后开始趋于平稳、衰亡，影响气味口感的不良物质增多。因此选择8 d作为最佳发酵时间。
2.2 正交试验结果
在单因素试验的基础上进行正交试验，试验设计与极差分析见表3。
表3 发酵工艺优化正交试验结果及极差分析
Table 3 Orthogonal test results and range analysis of fermentation process optimization
试验号 A B C D 感官评分氨基酸态氮含量/（g/L）1 1 1 1 1 84.6 0.224 2 1 2 2 2 81.3 0.196 3 1 3 3 3 82.5 0.154 4 2 1 2 3 89.2 0.218 5 2 2 3 1 86.6 0.322 6 2 3 1 2 83.2 0.182 7 3 1 3 2 78.8 0.364 8 3 2 1 3 79.3 0.198 9 3 3 2 1 76.5 0.098感官 K182.800 84.200 82.367 82.567评价 K286.333 82.400 82.333 81.100分数 K378.200 80.733 82.633 83.667 R 8.133 3.467 0.300 2.567氨基酸 K1 0.191 0.269 0.201 0.215态氮 K2 0.241 0.239 0.171 0.247含量 K3 0.220 0.145 0.280 0.190 R 0.050 0.124 0.109 0.057
从表3可知，不同因素对发酵的影响也不同。对感官评价的影响为板栗添加量＞羊肉添加量＞发酵时间＞小曲添加量，对氨基酸态氮含量的影响为羊肉添加量＞小曲添加量＞发酵时间＞板栗添加量。分别以感官评价和以氨基酸态氮含量为评价指标时得到两组最佳工艺组合：A2B1C3D3和A2B1C3D2。在两组工艺条件下分别酿造酒样后进行测定，对比两种组合的酒样发现A2B1C3D3氨基酸态氮含量为0.3 g/L，感官评分88.5；A2B1C3D2氨基酸态氮含量为0.287 g/L，感官评分87.2，发酵时间延长其氨基酸态氮含量上升，感官评分变化不大，A2B1C3D3组合的酒样表现更好，因而选择最佳工艺组合为A2B1C3D3，既板栗添加量20%，羊肉添加量8%，发酵9 d，小曲添加量0.8%。
2.3 游离氨基酸测定结果
游离氨基酸含量测定结果见表4。
从表4可以看出，4种酒样氨基酸含量及组成存在差异。从氨基酸总量来看，MCW氨基酸总量最高，RW和CW氨基酸总量低可能受多种因素影响，如陈酿时间较短、原料种类不同及添加量存在差异等。从必需氨基酸含量来看，MCW中含量最高的是亮氨酸，占总量的10.5%；RW和CW必需氨基酸中赖氨酸含量最高，分别是9.8%、8.67%。从必需氨基酸与氨基酸总量比值（EAA/TAA）看，MCW为38%，YW和RW都为31%，CW稍低，为28%，MCW与FAO/WHO标准规定（含量40%）最接近。
表4 游离氨基酸含量
Table 4 Content of free amino acids mg/L
注：*表示必需氨基酸。
氨基酸种类 MCW YW RW CW Asp 240.09 180.21 71.30 158.42 Glu 291.10 220.50 166.41 317.88 Thr* 55.98 100.60 23.31 32.36 Met* 78.83 17.04 19.39 46.96 Ser 116.67 130.06 21.29 84.58 pro 134.45 252.67 119.94 239.90 Gly 162.07 153.06 53.89 169.68 Ala 258.93 248.70 59.41 196.46 His* 75.35 23.51 27.95 75.42 Val* 80.56 142.79 23.89 61.94 Arg 247.06 180.71 31.22 70.78 Ile* 77.32 153.36 14.07 23.96 Leu* 268.23 83.28 60.12 120.66 Lys* 228.46 88.30 80.27 159.84 Phe* 119.54 56.21 0.90 1.74 Tyr 119.74 120.74 44.16 83.00 TAA 2 554.38 2 151.74 817.52 1 843.58 EAA 984.27 665.09 249.90 522.88 NEAA 1 570.11 1 486.65 567.62 1 320.70（EAA/TAA）/% 38 31 31 28（EAA/NEAA）/% 63 45 44 40
2.4 氨基酸营养评价
氨基酸评分主要反映的是食物蛋白中氨基酸含量与氨基酸评分模式中对应氨基酸需要量相比的满足程度，现代营养学理论认为，影响蛋白质营养价值的因素除了其必需氨基酸含量，还包括其必需氨基酸构成比例及氨基酸平衡理论[25]。根据4种酒样中各种氨基酸含量，计算得出必需氨基酸占氨基酸总量的质量分数，与WHO/FAO推荐模式谱进行比较，并根据公式计算其 RAA、RCAA、SRCAA，结果见表5。
表5 必需氨基酸与WHO/FAO推荐模式谱的比较
Table 5 Comparison between the essential amino acids in the samples and the amino acid pattern recommended by WHO/FAO
评价指标 WHO/FAO推荐模式谱MCW YW RW CW RAA RAA RAA RAA RCAA Thr 4.0 0.55 1.17 0.71 0.44 0.56 Cys+Met 3.5 0.88 0.23 0.68 0.73 0.94 Val 5.0 0.63 1.33 0.83 0.67 0.86 Ile 4.0 0.76 1.78 0.43 0.32 0.42 Leu 7.0 1.50 0.55 1.05 0.93 1.20 Lys 5.5 1.63 0.75 1.56 1.58 2.03 Phe+Tyr 6.0 1.56 1.37 0.92 0.77 0.99 SRCAA 52.9 47.66 49.00 47.57 RCAA 0.51 0.82 0.59 0.71 1.40 1.52 1.46 RCAA 1.14 0.22 1.29 1.73 0.54 0.72 1.33 RCAA 0.81 0.77 0.94 0.49 1.19 1.77 1.04
RAA反映了食物中蛋白质与人体蛋白质构成模式的接近程度，最小的是限制氨基酸。从表5可以看出，YW第一限制氨基酸为半胱氨酸+蛋氨酸，RW和CW第一限制氨基酸为异亮氨酸，MCW第一限制氨基酸为苏氨酸。因此，建议在食用时考虑和限制性氨基酸含量较高的食物一同食用，充分补足该类限制性氨基酸，提高食品中各类必需氨基酸的整体利用率和营养价值[26]。RCAA值反映了某一食品中氨基酸含量与特定模式氨基酸的偏离程度，CW中赖氨酸数值最大，表现出营养过剩的趋势。SRCAA越高意味着食品中必需氨基酸比例越接近人体的必需氨基酸比例即营养价值越高。4种酒样中SRCAA最高的是MCW，达52.9。说明MCW较另外3种酒样氨基酸营养价值更高，更适宜人体生理需求。
2.5 味觉氨基酸含量分析
不同氨基酸具有不同的侧链基团，因而也产生了不同的口味感官。按照氨基酸的味觉强度，大致可以把 氨 基 酸 分 为 甜 味 氨 基 酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His）、苦味氨基酸（Val、Leu、Ile、Met、Trp、Arg）、鲜味氨基酸（Lys、Glu、Asp）和芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Cys）[27]。4种酒样的味觉氨基酸含量见表6。
表6 味觉氨基酸含量
Table 6 Content of delicious amino acids mg/L
氨基酸类型 MCW YW RW CW 均值鲜味氨基酸 759.65 489.01 307.98 636.14 548.2甜味氨基酸 803.45 908.6 305.79 798.4 704.06芳香族类氨基酸 239.28 176.95 45.06 84.74 136.51苦味氨基酸 752 577.18 158.69 324.3 453.04
从表6可以看出，4种酒样中鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量均占前两位，芳香族类氨基酸含量最低。其中含量较高的甘氨酸、丙氨酸是主要的甜味氨基酸，能有效降低苦味；谷氨酸是所有呈味氨基酸中鲜味最强的氨基酸，含量也较高。这些氨基酸赋予了黄酒鲜甜的风味，同时有效减少苦味，缓解不良口感。板栗羊肉黄酒中呈味氨基酸含量较高，特别是鲜味氨基酸和苦味氨基酸含量远高于其他酒样，且鲜味、甜味、苦味氨基酸均较突出，这可能是其独特滋味的来源。
3 结论
以糯米、羊肉、板栗为原料，加入红曲与小曲发酵，以氨基酸态氮含量及感官评分分析其原料发酵程度、蛋白质水解程度及香气、口感，通过单因素试验及正交试验优化发酵工艺，得到最佳发酵工艺条件为板栗添加量20%，羊肉添加量8%，小曲添加量0.8%，红曲添加量13%，发酵时间9 d，发酵温度18℃。以相同工艺及条件制得的RW、CW及YW共同作为研究对象测定其氨基酸含量及组成，通过必需氨基酸与氨基酸总量比值、氨基酸评分及氨基酸比值系数评价氨基酸营养价值，结果表明，同样工艺条件下MCW中氨基酸总量最高，达2 554.38 mg/L，必需氨基酸与总氨基酸的比值38%也明显高于CW、RW及YW，接近FAO/WHO规定标准含量40%，说明羊肉及板栗的添加均增加了氨基酸总量，羊肉的添加还显著提高了必需氨基酸的含量。羊肉作为动物蛋白源，和植物蛋白源在一定程度上形成互补，使氨基酸总含量增加的同时构成也更为均衡，符合人体需要，营养价值得到提高，同时赋予相应食品独特的滋味。
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