带鱼（Trichiurus lepturus）是我国四大海产鱼种之一，在我国黄海、东海、渤海至南海都有分布[1]。带鱼作为一种食用经济鱼类，含有丰富的优质蛋白质、脂肪、多不饱和脂肪酸等营养物质[2]。带鱼加工过程中会产生约占原料50%的加工副产物如鱼头、内脏、鱼骨等[3]，其副产物含有丰富的蛋白质，是提取海洋蛋白资源的极佳来源[4-5]。这些鱼加工副产物通常被随意丢弃或被简单加工成为鱼饲料，会造成环境的污染以及海洋资源利用率较低[6-7]。研究发现，鱼加工副产物是提取生物活性成分的主要来源之一。左格格等[8]从罗非鱼加工副产物中提取出硫酸软骨素；宋恭帅等[9]以大目金枪鱼副产物为原料，采用酶解法提取得到粗鱼油，并通过响应面法优化得到最佳工艺条件；Chen等[10]从罗非鱼鳞片制备得到具有冷冻保护活性的抗冻肽；黑智亮等[11]从鲫鱼卵中提取糖蛋白，通过响应面法优化得到鲫鱼卵唾液酸糖蛋白制备工艺。鱼加工副产物含有丰富的功能成分，在食品工业领域中可被更好地开发和高值化利用。
糖蛋白是由糖链和肽链以共价键连接而成的结合蛋白质[12]，同时具有多糖和蛋白质的某些性质，研究表明糖蛋白还具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等功能作用[13-15]。海洋源糖蛋白的提取方法主要有水浸提法、酸碱提取法、盐溶液提取法、酶提取法、物理辅助提取法等[16-17]。 目前已有学者从墨鱼[18]、鲍鱼[19]、海蜇[20]、马氏珠母贝[21]等提取糖蛋白，还尚未见有关带鱼副产物提取糖蛋白的相关研究。超声技术在物理辅助提取糖蛋白中应用较多，其原理是利用超声波的空化作用、热效应、机械作用加速细胞壁的破碎，促进胞内物质的溶出[22]。因此，将超声技术应用于提取糖蛋白可以有效提高糖蛋白的得率。
基于此，本研究通过测定带鱼副产物的基本营养成分，并在预试验的基础上，采用超声辅助盐提法提取带鱼副产物中的糖蛋白，选取NaCl浓度、提取时间、提取温度、料液比、超声功率、超声时间作为单因素，在单因素试验的基础上采用响应面试验设计优化并确定带鱼副产物糖蛋白的最佳提取工艺条件，为带鱼副产物糖蛋白的提取工艺优化及进一步理化特性的研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
带鱼副产物：福建宏升兄弟食品有限公司，主要组成为鱼内脏、鱼骨头、鱼刺。
氯化钠（分析纯）、石油醚（分析纯）、乙醇（分析纯）：西陇科学股份有限公司；正丁醇（分析纯）、氯仿（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
高速冷冻离心机（3H24R1）：长沙湘智离心机仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH系列）：上海江星仪器有限公司；大功率恒温磁力搅拌器（88-1）：常州国华电器有限公司；微波超声波组合萃取仪（XH-300B）：北京祥鹄科技发展有限公司；冷冻干燥机（FDU-1200）：上海爱朗仪器有限公司；电子天平（FA224）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 营养成分的测定
1.3.1.1 水分测定
水分含量参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定。
1.3.1.2 蛋白质测定
蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定。
1.3.1.3 总糖测定
总糖含量参照GB9695.31—1991《肉制品总糖含量测定》测定。
1.3.1.4 脂肪测定
脂肪含量参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定。
1.3.1.5 灰分测定
灰分含量参照GB5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》测定。
1.3.2 带鱼副产物糖蛋白的制备工艺
带鱼副产物经滚揉混合成匀浆后，置于-20℃冷藏库中备用。将冷冻的带鱼副产物自然解冻，称取样品，加入石油醚进行充分的脱脂处理。称取20 g脱脂带鱼副产物，加入一定料液比的盐溶液进行超声破碎，于一定温度下水浴一段时间，离心取上清液，加入乙醇至终浓度为75%，低温静置过夜，离心取沉淀，将沉淀溶解后加入与样品体积比为1:3的sevage试剂（体积比为4:1的氯仿和正丁醇），进行脱游离蛋白，取上层液体透析48 h以上，冷冻干燥得到糖蛋白[13]。
1.3.3 带鱼副产物糖蛋白得率
糖蛋白得率的计算公式如下。
式中：m为糖蛋白冻干质量，mg；M为脱脂原料质量，g。
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 NaCl浓度对糖蛋白得率的影响
固定提取时间为1.5 h、提取温度为70℃、料液比为1:6（g/mL）、超声功率为500 W、超声时间为10 min，研究不同 NaCl浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）对糖蛋白得率的影响。
1.3.4.2 提取时间对糖蛋白得率的影响
在1.3.4.1试验基础上，固定NaCl浓度为0.4 mol/L、提取温度为70℃、料液比为1:6（g/mL）、超声功率为500 W、超声时间为10 min，研究不同提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）对糖蛋白得率的影响。
1.3.4.3 提取温度对糖蛋白得率的影响
在1.3.4.2试验基础上，固定NaCl浓度为0.4mol/L、提取时间为1.5 h、料液比为1:6（g/mL）、超声功率为500 W、超声时间为10 min，研究不同提取温度（50、60、70、80、90 ℃）对糖蛋白得率的影响。
1.3.4.4 料液比对糖蛋白得率的影响
在1.3.4.3试验基础上，固定NaCl浓度为0.4mol/L、提取时间为1.5 h、提取温度为70℃、超声功率为500 W、超声时间为10 min，研究不同料液比[1:3、1:6、1:9、1:12、1:15（g/mL）]对糖蛋白得率的影响。
1.3.4.5 超声功率对糖蛋白得率的影响
在1.3.4.4试验基础上，固定NaCl浓度为0.4mol/L、提取时间为1.5h、提取温度为70℃、料液比为1:9（g/mL）、超声时间为10 min，研究不同超声功率（100、300、500、700、900 W）对糖蛋白得率的影响。
1.3.4.6 超声时间对糖蛋白得率的影响
在1.3.4.5试验基础上，固定NaCl浓度为0.4mol/L、提取时间为1.5h、提取温度为70℃、料液比为1:9（g/mL）、超声功率为 500 W，研究不同超声时间（10、15、20、25、30 min）对糖蛋白得率的影响。
1.3.5 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以提取温度（A）、料液比（B）、超声功率（C）、超声时间（D）为自变量，以糖蛋白得率（Y）为响应值，使用软件Design-Expert V8.0.6设计响应面分析试验，确定带鱼副产物糖蛋白的最佳工艺条件，自变量水平及其范围如表1所示。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Response surface test factor level
水平D超声时间/min-1 60 1:6 30020 0 70 1:9 50025 1 80 1:12 70030因素A提取温度/℃B料液比/（g/mL）C超声功率/W
1.4 数据分析
采用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面分析，采用OriginPro 2019软件进行图形绘制，试验平行测定3次，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 带鱼副产物基本营养成分测定
带鱼副产物一般营养成分分析结果如表2所示。
表2 带鱼副产物的水分、蛋白质、总糖、脂肪、灰分含量
Table 2 Water，protein，total sugar，fat，and ash contents of byproducts from hairtail%
样品 水分 蛋白质 总糖 脂肪 灰分带鱼副产物 75.16±0.34 14.12±0.02 0.82±0.03 6.86±0.07 2.86±0.12
从表2中可以看出带鱼副产物水分含量较高，达到（75.16±0.34）%。蛋白质含量较高，达到（14.12±0.02）%，说明带鱼副产物是较好的蛋白质来源。总糖、脂肪、灰分含量分别达到（0.82±0.03）%、（6.86±0.07）%、（2.86±0.12）%。
2.2 单因素试验
2.2.1 NaCl浓度对糖蛋白得率的影响
NaCl浓度对带鱼副产物糖蛋白得率的影响结果如图1所示。
图1 NaCl浓度对带鱼副产物糖蛋白得率的影响
Fig.1 Effect of NaCl solubility on the yield of glycoprotein from hairtail by-products
由图1可知，随着NaCl浓度的增加，糖蛋白得率呈现先增长后下降的趋势。当NaCl浓度为0.4 mol/L时，糖蛋白得率达到最高，为7.30 mg/g，随着NaCl浓度的增高糖蛋白得率有所下降，可能是因为由于盐浓度过高，导致糖蛋白不易析出。故选择0.4 mol/L的NaCl溶液作为带鱼加工副产物糖蛋白的提取溶剂。
2.2.2 提取时间对糖蛋白得率的影响
提取时间对带鱼副产物糖蛋白得率的影响结果如图2所示。
图2 提取时间对带鱼副产物糖蛋白得率的影响
Fig.2 Effect of extraction time on the yield of glycoprotein from hairtail by-products
由图2可知，当浸提时间为0.5 h～1.5 h时，糖蛋白得率随着提取时间的延长而提高，浸提时间达到1.5 h时，糖蛋白得率达到最高，为7.0 mg/g，糖蛋白得率在浸提1.5 h后有所下降，可能是由于浸提时间过长糖蛋白分解成小分子蛋白和糖，在后期提取处理中被除去，导致得率降低。故选择1.5 h作为带鱼加工副产物糖蛋白的提取时间。
2.2.3 提取温度对糖蛋白得率的影响
提取温度对带鱼副产物糖蛋白得率的影响结果如图3所示。
图3 提取温度对带鱼副产物糖蛋白得率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of glycoprotein from hairtail by-products
由图3可知，糖蛋白得率随提取温度的升高而逐渐提高，当温度超过70℃时，糖蛋白得率增长趋于缓慢。考虑到温度过高会使糖蛋白活性降低，选用70℃作为提取糖蛋白的提取温度。
2.2.4 料液比对糖蛋白得率的影响
料液比对带鱼副产物糖蛋白得率的影响结果如图4所示。
图4 料液比对带鱼副产物糖蛋白得率的影响
Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of glycoproteins from hairtail by-products
由图4可知，当料液比为1:9（g/mL）时，糖蛋白得率最高达到9.10（mg/g），且糖蛋白得率随溶剂体积的增大而呈缓慢下降趋势，可能是由于溶剂体积过大导致原料细胞破碎不完全，糖蛋白溶出不充分，致使得率降低。故选择料液比1:9（g/mL）作为带鱼加工副产物糖蛋白的提取料液比。
2.2.5 超声功率对糖蛋白得率的影响
超声功率对带鱼副产物糖蛋白得率的影响结果如图5所示。
图5 超声功率对带鱼副产物糖蛋白得率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield of glycoprotein from hairtail by-products
由图5可知，随着超声功率的提高，糖蛋白的得率呈先上升后下降的趋势，当超声功率为100 W～500 W时，糖蛋白得率增加较快，当超声功率超过500 W时，糖蛋白得率开始下降。可能是不同提取物有不同的适宜提取超声功率范围，超出其适宜范围，超声作用可能会使目标产物发生降解而影响其得率[23]。故选择500 W作为提取带鱼加工副产物糖蛋白的超声功率。
2.2.6 超声时间对糖蛋白得率的影响
超声时间对带鱼副产物糖蛋白得率的影响结果如图6所示。
图6 超声时间对带鱼副产物糖蛋白得率的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic time on the yield of glycoprotein from hairtail by-products
由图6可知，当超声时间为25 min，糖蛋白得率达到最高，超过25 min后则降低。这说明在超声的作用下，糖蛋白更易溶出，但长时间的超声处理会引起糖蛋白糖苷键断裂而发生降解，糖蛋白易变性，降低糖蛋白的得率[24]。故选择25 min作为提取带鱼加工副产物糖蛋白的超声时间。
2.3 响应面优化试验
综合单因素试验的结果，选择对糖蛋白得率影响较大的因素进行响应面优化。本试验固定NaCl浓度和提取时间，选取提取温度（A）、料液比（B）、超声功率（C）、超声时间（D）为因素，糖蛋白得率（Y）作为响应值。根据Box-Behnken试验设计原理，对试验方案中29组试验进行研究，得到的结果如表3所示。
表3 试验设计与结果
Table 3 Experimental Design and Results
试验编码ABCDY糖蛋白得率/（mg/g）1 -1 -1 0 0 4.88 2 1 -1 0 0 6.88 3 -1 1 0 0 5.21 4 1 1 0 0 7.80 5 0 0 -1 -1 7.25 6 0 0 1 -1 6.97 7 0 0 -1 1 6.64 8 0 0 1 1 6.40 9 -1 0 0 -1 5.32 10 1 0 0 -1 8.88 11 -1 0 0 1 7.43 12 1 0 0 1 6.42 13 0 -1 -1 0 6.30 14 0 1 -1 0 6.51 15 0 -1 1 0 5.27 16 0 1 1 0 7.26 17 -1 0 -1 0 5.56 18 1 0 -1 0 7.80 19 -1 0 1 0 4.78 20 1 0 1 0 8.29 21 0 -1 0 -1 5.99 22 0 1 0 -1 7.61 23 0 -1 0 1 7.08 24 0 1 0 1 6.21 25 0 0 0 0 9.27 26 0 0 0 0 9.00 27 0 0 0 0 8.56 28 0 0 0 0 8.94 29 0 0 0 0 9.37
运用Design-Expert V8.0.6软件对以上29组试验响应值进行回归分析，经回归拟合后，得到糖蛋白得率（Y）标准回归方程：Y=9.03+1.07A+0.35B-0.091C-0.015D+0.15AB+0.32AC-1.14AD+0.45BC-0.62BD+0.01CD-1.22A2-1.50B2-1.25C2-0.85D2。
2.3.1 回归模型的方差分析
方差分析如表4所示。
在糖蛋白得率的响应面二次模型方差分析中，模型模型P＜0.000 1，表明该模型具有极显著性，失拟项P＞0.05不显著，表明该模型的拟合效果较好。模型决定系数 R2=0.781 2，修正相关系数R2Adj=0.912 7，表明预测值和试验值具有良好的相关性，可以应用到理论预测。根据F值大小得出各因素对糖蛋白得率的影响主次顺序为提取温度＞料液比＞超声时间＞超声功率。在一次项中，A提取温度和B料液比均达到极显著水平，二次项A2、B2、C2和D2的影响均达到极显著水平。
2.3.2 响应面分析
利用软件Design-Expert V8.0.6对表4的数据进行二次多元回归拟合，得到相应回归方程的响应面图如图7～图12所示。
表4 糖蛋白得率的响应面二次模型方差分析
Table 4 Response surface quadratic model analysis of variance for glycoprotein yield
注：*表示具有显著差异，P＜0.05；**表示具有极显著差异，P＜0.01。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 49.58 14 3.54 21.91 ＜0.000 1 **A 13.85 1 13.85 8566 ＜0.000 1 **B 1.47 1 1.47 9.09 0.009 3 **C 0.099 1 0.099 0.61 0.446 9 D 0.28 1 0.28 1.75 0.207 6 AB 0.087 1 0.087 0.54 0.475 2 AC 0.40 1 0.40 2.49 0.136 6 AD 5.22 1 5.22 32.30 ＜0.000 1 **BC 0.79 1 0.79 4.90 0.044 0 *BD 1.55 1 1.55 9.59 0.007 9 **CD 4×10-4 1 4×10-42.475×10-3 0.961 0 A2 9.68 1 9.68 59.91 ＜0.000 1 **B2 14.66 1 14.66 90.67 ＜0.000 1 **C2 10.13 1 10.13 62.64 ＜0.000 1 **D2 4.72 1 4.72 29.21 ＜0.000 1 **残差 2.26 14 0.16失拟项 1.86 10 0.19 1.85 0.291 0纯误差 0.40 4 0.10总和 51.84 28
图7 提取温度与料液比的交互作用
Fig.7 Interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio
图8 提取温度与超声功率的交互作用
Fig.8 Interaction between extraction temperature and ultrasonic power
图9 提取温度与超声时间的交互作用
Fig.9 Interaction between extraction temperature and ultrasonic time
图10 料液比与超声功率的交互作用
Fig.10 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power
图11 料液比与超声时间的交互作用
Fig.11 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic time
图12 超声功率与超声时间的交互作用
Fig.12 Interaction between ultrasonic power and ultrasonic time
因素对响应值影响越显著，响应面图曲面越陡峭[25]。由图7～图12可知，提取温度和超声时间、料液比和超声时间之间交互作用的曲面图较陡，说明这两个交互作用项对糖蛋白得率的影响较显著。
2.3.3 验证试验
经响应面优化后，以糖蛋白得率为评价指标，确定其制备的最优条件：提取温度78.37℃，料液比1:10.01（g/mL），超声功率525.32 W，超声时间21.14 min，此时带鱼副产物糖蛋白得率为9.59 mg/g。根据实际情况调整后得到带鱼副产物糖蛋白的最优制备条件：NaCl浓度0.4 mol/L，提取时间1.5 h，提取温度78℃，料液比1:10（g/mL），超声功率 525 W，超声时间 21 min，采用上述优化后的制备工艺条件进行重复试验，测得的带鱼副产物糖蛋白得率为（9.20±0.20）mg/g。实际值与预测值的误差在1%以内，表明此预测模型可行。
3 结论
本文以带鱼副产物为原料，对超声辅助盐提法提取糖蛋白的工艺进行研究。采用单因素试验和响应面法确定了带鱼副产物糖蛋白提取的最优工艺：NaCl浓度0.4 mol/L，提取时间1.5 h，提取温度78℃，料液比1:10（g/mL），超声功率 525 W，超声时间 21 min，并且在此工艺条件下的带鱼副产物糖蛋白得率为（9.20±0.20）mg/g，得率的实际值与预测值无明显差异。本文通过对带鱼副产物海洋资源的进一步利用，采用响应面优化提取得到带鱼副产物糖蛋白，为带鱼加工副产物糖蛋白的制备工艺优化研究提供一定的理论基础。
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