茶多糖（tea polysaccharides，TPs）又称为茶活性多糖或茶叶多糖，是醛糖和（或）酮糖通过α-糖苷键或β-糖苷键连接成的天然聚合物，主要由阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖等组成高聚合度的多糖苷键聚糖类，并与蛋白质紧密结合，约占茶叶干物质重的0.8%～3.5%[1]，茶多糖具有降低血糖、血脂、改善胰岛素抵抗、增强葡萄糖耐受、抗血凝等功效，对糖尿病并发症也有积极预防效果[2-5]，是现阶段极具开发潜质的天然物质之一，广泛应用于功能食品、医药保健、美容日化等领域，其提取、纯化方法也受到广泛关注[6-7]。
江西省修水县古称义宁州，所产红茶称为宁州工夫红茶，又简称为“宁红”，是当前江西省重点打造“四绿一红”茶产业中的唯一红茶品牌[8]。目前，对于宁红茶营养功效研究相对较薄弱，特别是在功能成分提取制备方面的报道较少。传统的茶多糖提取方法多采用水提醇沉法[9]、酸碱提取法[10]、超声波或微波辅助浸提法[11]、超临界萃取法[12]等，上述方法多存在提取得率低、仪器设备要求严或经济成本高等问题[13]，而采用酶法的提取反应条件较温和，有效成分浸出率和生物活性较高等优势[14-15]。为推动宁红茶深加工利用并提高其茶多糖提取量，基于响应面分析法中的中心组合设计优化酶法提取工艺技术，探讨提取时间、复合酶用量和料液比等关键因素对宁红茶多糖提取量的影响，为宁红茶开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
宁红茶：2020年5月产自江西省宁红集团有限公司，按照宁红茶传统工夫红茶的“萎调→揉捻→发酵→干燥→提香”加工工序制作。干茶粉碎后过40目筛备用。
果胶酶（11 000 U/g）、中性蛋白酶（30 000 U/g）、纤维素酶（10 000 U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；葡萄糖标准品：成都埃法生物科技有限公司；蒽酮、浓硫酸：国药集团化学试剂有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ME204电子分析天平：梅特勒-托利多（常州）仪器有限公司；UV-722紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：河南郑州长城科工贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 宁红茶多糖标准曲线制作及含量测定
宁红茶多糖含量测定依据蒽酮-硫酸法[16]进行。称取0.33 g蒽酮加入到100 mL浓硫酸于棕色瓶中溶解；0.25 g葡萄糖标准品于250 mL容量瓶中定容，摇匀后分别取 2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL 于 100 mL 定容，分别取 1 mL置于标有 1、2、3、4、5 编号试管，冰水浴中分别加入4 mL蒽酮-硫酸溶液，摇匀后3 min沸水浴后快速冷却，于620 nm波长处测定其吸光值，以蒸馏水代替葡萄糖溶液为空白对照。以质量浓度x为横坐标，吸光值y为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程y=0.083 4x-0.033 1（R2=0.999 1），说明测定范围内线性关系较好。
宁红茶提取液中茶多糖测定：抽滤样品于100 mL容量瓶中定容，取0.2 mL试液于具塞刻度试管中，各管中准确移入4 mL蒽酮试剂，摇匀后置于沸水浴中准确加热7 min，冷却至室温后于620 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线方程计算各提取液中宁红茶多糖提取量。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 酶种类筛选
称取1.0 g宁红茶粉末，料液比1:20（g/mL），酶解温度45℃，反应时间3 h条件下，分别检测0.8%（以底物质量计）酶用量的5种类型[纤维素酶（种类1），果胶酶（种类2），果胶酶与纤维素酶组合酶（种类3），果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶组合（种类4），中性蛋白酶（种类5）]对宁红茶多糖提取量的影响，确定适合的酶种类。
1.3.2.2 果胶酶与纤维素酶质量比对宁红茶多糖提取量的影响
准确称取1.0 g宁红茶粉末，料液比1:20（g/mL），复合酶用量0.8%（以底物质量计），酶解温度45℃，反应时间3 h条件下，分别考察果胶酶与纤维素酶质量比为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3对宁红茶多糖提取量的影响。
1.3.2.3 复合酶用量对宁红茶多糖提取量的影响
准确称取1.0 g宁红茶粉末，料液比1:20（g/mL），酶解温度45℃，反应时间3 h条件下，分别考察复合酶用量（果胶酶:纤维素酶=2:1，质量比）0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%对宁红茶多糖提取量的影响。
1.3.2.4 酶解温度对宁红茶多糖提取量的影响
准确称取1.0 g宁红茶粉末，料液比1:20（g/mL），复合酶用量0.9%（果胶酶:纤维素酶=2:1，质量比），反应时间3 h条件下，分别考察酶解温度35、40、45、50、55℃对宁红茶多糖提取量的影响。
1.3.2.5 提取时间对宁红茶多糖提取量的影响
准确称取1.0 g宁红茶粉末，料液比1:20（g/mL），复合酶用量0.9%（果胶酶:纤维素酶=2:1，质量比），酶解温度45℃条件下，分别考察提取时间2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h对宁红茶多糖提取量的影响。
1.3.2.6 料液比对宁红茶多糖提取量的影响
准确称取1.0 g宁红茶粉末，复合酶添加量0.9%（果胶酶:纤维素酶=2:1，质量比），酶解温度45℃，提取时间3.5 h条件下，分别考察料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30（g/mL）对宁红茶多糖提取量的影响。
1.3.3 响应面优化试验
按照响应面Box-Behnken中心组合试验设计的原理，基于单因素试验结果进行三因素三水平试验设计，以提取时间（A）、复合酶用量（B）和料液比（C）为响应因子，响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factor levels and variables of response surface design
水平A提取时间/hB复合酶用量/%C料液比/（g/mL）-1 2.5 0.7 1:15 0 3.0 0.9 1:20 1 3.5 1.1 1:25
1.4 数据分析
使用Excel 2007软件分析相关试验数据，SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差分析和显著性分析，Design-expert 8.0软件中Box-Behnken构建响应面试验和分析回归模型结果。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 酶种类的确定
不同酶种类对宁红茶多糖提取量的影响见图1。
图1 不同酶种类对宁红茶多糖提取量的影响
Fig.1 Effect of enzyme types on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图1可知，以种类3（果胶酶与纤维素酶组合）获得宁红茶多糖提取量最高，达到27.32 mg/g（P＜0.05），其次是种类2（果胶酶）和种类4（果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶组合），宁红茶多糖提取量为23 mg/g左右，二者间无显著差异（P＞0.05），而种类1（纤维素酶）获得宁红茶多糖提取量最低，仅有16.70 mg/g（P＜0.05），与种类5（中性蛋白酶）获得18.70 mg/g宁红茶多糖提取量无显著差异（P＞0.05）。说明中性蛋白酶的存在可能会抑制复合酶的综合作用，且单独使用时效果亦不佳。确定以种类3（果胶酶与纤维素酶组合）为酶解体系提取宁红茶中的茶多糖。
2.1.2 果胶酶与纤维素酶质量比的影响
果胶酶与纤维素酶质量比对宁红茶多糖提取量的影响见图2。
由图2可知，在果胶酶与纤维素酶质量比2:1～1:3内，随着纤维素酶的用量增加，宁红茶多糖提取量呈现下降趋势，由 27.87 mg/g降低到 18.70 mg/g（P＜0.05）。以果胶酶与纤维素酶质量比为2:1时，两种酶活性复合作用发挥最优，此时宁红茶多糖提取量最高（27.87 mg/g），但与果胶酶与纤维素酶质量比为1:1时的宁红茶多糖提取量无显著差异（P＞0.05），综合试验结果和原料成本确定果胶酶和纤维素酶质量比为2:1适宜。
图2 果胶酶与纤维素酶质量比对宁红茶多糖提取量的影响
Fig.2 Effect of pectinase-cellulose content ratio on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
2.1.3 复合酶用量的影响
复合酶用量对宁红茶多糖提取量的影响见图3。
图3 复合酶用量对宁红茶多糖提取量的影响
Fig.3 Effect of compound enzymatic addition on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3可知，在选取的果胶酶与纤维素酶组合的复合酶用量范围内，宁红茶多糖提取量随着复合酶用量的增加呈先升高后降低的变化趋势，当复合酶用量为0.9%（以底物质量计）时，宁红茶多糖提取量达到最高 30.72 mg/g（P＜0.05），继续增加复合酶用量，宁红茶多糖提取量显著降低，在复合酶用量为1.3%时仅有21.98 mg/g，其原因是酶量达到一定临界时，反应体系会达到饱和状态，随着复合酶用量的继续增加会抑制酶活性或加速产物转变[17]。综合表明果胶酶和纤维素酶组合的复合酶用量以0.9%最佳。
2.1.4 酶解温度的影响
酶解温度对宁红茶多糖提取量的影响见图4。
图4 酶解温度对宁红茶多糖提取量的影响
Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4可知，在35℃～45℃内宁红茶多糖提取量随着温度升高显著增加，由最初的22.37mg/g显著增加到30.73 mg/g（P＜0.05），达到宁红茶多糖提取量最大值。而随着温度继续升高，宁红茶多糖提取量显著下降，在55℃时宁红茶多糖提取量仅有21.29 mg/g，但与35℃时的提取效果无显著差异（P＞0.05），其原因是酶具有最适温度，低温不能发挥酶的最适活性，温度过高会抑制酶活性甚至是破坏酶结构，直至完全丧失其活性[18]。45℃～55℃的酶解温度抑制了酶活性，而活性物质溶出率的上升往往依靠温度的提高，但提取效果不及酶解效果。结果表明酶解温度以45℃适宜。
2.1.5 提取时间的影响
提取时间对宁红茶多糖提取量的影响见图5。
图5 提取时间对宁红茶多糖提取量的影响
Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图5可知，在选取2.0h～4.0h内，茶多糖提取量随着提取时间的延长呈现先增加后降低的变化趋势，在3.0h时达到宁红茶多糖提取量最大值32.33mg/g（P＜0.05），而提取时间2.0h宁红茶多糖提取量最低，仅为18.57mg/g（P＜0.05）。表明短时间的提取时间，酶解作用和浸提效果不充分，而酶解时间过长对提高宁红茶多糖的提取量无显著促进作用，存在反应体系抑制酶活性的现象或不利于产物的稳定因素[19]。确定提取时间以3.0 h最佳。
2.1.6 料液比的影响
料液比对宁红茶多糖提取量的影响见图6。
图6 料液比对宁红茶多糖提取量的影响
Fig.6 Effect of ratio of solid to liquid on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图 6 可知，在 1:10（g/mL）～1:30（g/mL）内，宁红茶多糖提取量随溶剂添加量的减小而呈现显著的先升高后降低的变化趋势，当料液比1:20（g/mL）时，宁红茶多糖提取量达到最大值32.27 mg/g（P＜0.05），随后显著下降，在料液比 1:30（g/mL）时仅有 18.49 mg/g（P＜0.05），该结果与 1:10（g/mL）时提取量（17.93 mg/g）无显著差异。其原因为料液比较大时易受到传质阻力影响，宁红茶多糖溶出量偏低；在一定的料液比范围内，传质阻力减弱，包括宁红茶多糖在内的活性物质溶出量会升高，当溶剂添加量过小时大量的液体溶剂形成稀释效应[20]。确定料液比以1:20（g/mL）最佳。
2.2 响应面模型建立与分析
根据Box-Benhnken的中心组合原理设计17组试验，结果如表2所示。
表2 响应面分析试验及结果
Table 2 Response surface methodology and analysis results
序号 A提取时间 B复合酶用量 C料液比 Y宁红茶多糖提取量/（mg/g）1 1 0 1 33.17 2 0 0 0 31.93 3 0 -1 -1 12.06 4 0 0 0 31.36 5 -1 1 0 22.65 6 -1 0 1 25.60 7 1 1 0 28.92 8 0 -1 1 20.07 9 -1 -1 0 19.31 10 0 0 0 31.33 11 0 0 0 31.43 12 1 0 -1 17.48 13 0 0 0 29.87 14 -1 0 -1 16.22 15 1 -1 0 24.81 16 0 1 1 29.09 17 0 1 -1 13.51
对表2中的试验数据进行二次多项式回归拟合，得到宁红茶多糖提取量（Y）与提取时间（A）、复合酶用量（B）、料液比（C）的回归模型方程：Y=31.18+2.58A+2.24B+6.08C+0.19AB+1.18AC+1.89BC-1.41A2-5.85B2-6.65C2。
方差分析见表3。
表3 宁红茶多糖提取量的回归模型方程方差分析
Table 3 Analysis and statistical parameters of regression model on tea polysaccharides from Ninghong black tea
注:*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 781.01 9 86.78 124.22 <0.000 1 **A 53.05 1 53.05 75.93 <0.000 1 **B 40.14 1 40.14 57.46 0.000 1 **C 295.97 1 295.97 423.67 <0.000 1 **AB 0.15 1 0.15 0.21 0.659 AC 9.95 1 9.95 14.25 0.006 9 **BC 14.33 1 14.33 20.51 0.002 7 **A2 8.41 1 8.41 12.04 0.010 4 *B2 144.01 1 144.01 206.14 <0.000 1 **C2 186.38 1 186.38 266.79 <0.000 1 **残差 4.89 7 0.70失拟项 2.49 3 0.83 1.39 0.368 0纯误差 2.40 4 0.60总和 785.90 16
由表3可知，该试验模型P<0.000 1，极显著；失拟项P=0.368 0>0.05，不显著，说明该模型具有很高可信度[21]。本试验选取的3个因子对宁红茶多糖提取量Y的影响强弱顺序：C（料液比）>A（提取时间）>B（复合酶用量）；一次项 A、B、C 均呈极显著；二次项 B2、C2和交互项AC、BC均呈极显著，二次项A2呈显著。相关系数R2=0.993 8，表明响应值的变化有99.38%来源于所选变量；校正相关系数R2adj=0.985 9，表明该模型可以解释98.59%的响应值变化；变异系数C.V.%=3.39<5%，说明试验设计的精确性和重复性极其显著。综上证明该模型拟合程度高，可应用于分析和预测宁红茶中茶多糖的提取工艺。
2.3 Box-Behnken响应面图分析
各响应因素交互作用对宁红茶多糖提取量影响如图7所示。
由图7可知，提取时间与料液比、复合酶用量与料液比对宁红茶多糖提取量影响的响应曲面坡度较陡峭，等高线呈椭圆形且各曲线之间密集，说明各因子的交互效应对宁红茶多糖提取量的作用显著。同时，结合曲面陡峭变化，说明料液比对宁红茶多糖提取量的影响更显著，其次是提取时间和复合酶用量，与方差分析结果一致。
图7 各响应因素交互作用对宁红茶多糖提取量影响的响应面和等高线图
Fig.7 The response surface and contour plots of the interaction of each factor to the extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea
2.4 最佳条件确定与回归模型验证
通过Box-Behnken响应面优化试验得到复合酶法提取宁红茶多糖最佳工艺参数：提取时间3.211h，复合酶用量0.933%（以底物质量计），料液比1:20（g/mL），此条件下获得宁红茶多糖提取量为31.905 mg/g。为便于实际操作，优化调整工艺技术参数：提取时间3.2 h，复合酶用量0.93%（以底物质量计），料液比1:20（g/mL），并在此参数下进行3次重复验证，宁红茶多糖提取量平均值为31.62 mg/g，与理论值31.905 mg/g接近（P>0.05），表明基于Box-Behnken响应面优化酶法提取宁红茶多糖的工艺技术可靠。
3 结论
本研究以江西省宁红茶的茶多糖提取量为考察目标，在单因素试验筛选基础上，利用Box-Behnken响应面优化酶法提取宁红茶多糖的工艺技术，获得最佳提取工艺参数：提取时间3.2 h，复合酶用量0.93%（以底物质量计），料液比1:20（g/mL），在此工艺参数下其提取量为31.62 mg/g，接近模型预测的提取值31.905 mg/g（P>0.05），综合说明此试验模型结果可靠，且该提取方法优于传统提取方法效果，试验为宁红茶的深加工利用提供科学依据。
[1] 程利增,朱将雄,周慧,等.茶多糖提取纯化、结构活性及应用研究进展[J].中国茶叶,2021,43(8):7-15.CHENG Lizeng,ZHU Jiangxiong,ZHOU Hui,et al.Research progress on the extraction,purification,structures,activities and application of tea polysaccharides[J].China Tea,2021,43(8):7-15.
[2] 马慧敏,柯钦豪,曹琴,等.茶多糖的提取方法研究进展[J].湖北科技学院学报（医学版）,2019,33(6):550-552.MA Huimin,KE Qinhao,CAO Qin,et al.Research progress on extraction methods of tea polysaccharides[J].Journal of Hubei University of Science and Technology (Medical Sciences),2019,33(6):550-552.
[3] XIAO J B,JIANG H X.A review on the structure-function relationship aspect of polysaccharides from tea materials[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2015,55(7):930-938.
[4] XU A N,LAI W Y,CHEN P,et al.A comprehensive review on polysaccharide conjugates derived from tea leaves:Composition,structure,function and application[J].Trends in Food Science&Technology,2021,114:83-99.
[5] 石玉涛,郑淑琳,吴伟伟,等.武夷名丛茶树种质资源茶多糖抗氧化活性分析[J].福建农业学报,2020,35(7):801-810.SHI Yutao,ZHENG Shulin,WU Weiwei,et al.Antioxidant activity of polysaccharides in Wuyi mingcong tea germplasms[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences,2020,35(7):801-810.
[6] 杨孝延,孙玉军,邓世尧.植物多糖的提取及其在化妆品中的应用研究进展[J].长江大学学报（自科版）,2017,14(22):54-59,5.YANG Xiaoyan,SUN Yujun,DENG Shiyao.Extraction of plant polysaccharide and its application in cosmetics[J].Journal of Yangtze University(Natural Science Edition),2017,14(22):54-59,5.
[7]WANG H S,CHEN J R,REN P F,et al.Ultrasound irradiation alters the spatial structure and improves the antioxidant activity of the yellow tea polysaccharide[J].Ultrasonics Sonochemistry,2021,70:105355.
[8] 胡琳菁.红茶始祖修水宁红，扬千年历史[J].江西农业,2015(3):31-32.HU Linjing.The ancestor of black tea,Xiushui Ninghong,has a thousand years of history[J].Jiangxi Agriculture,2015(3):31-32.
[9] 荆晶,黄国凤,魏敏,等.响应面法优化绿茶多糖的提取工艺及应用[J].遵义医学院学报,2016,39(1):76-80.JING Jing,HUANG Guofeng,WEI Min,et al.Optimization of extraction of polysaccharides from green tea by response surface methodology[J].Journal of Zunyi Medical University,2016,39(1):76-80.
[10]来林康,邓尚贵.鱼腥草多糖提取工艺及抗氧化活性研究[J].安徽农业科学,2014,42(35):12646-12649.LAI Linkang,DENG Shanggui.Study on extraction of polysaccharides from Houttuynia cordata and antioxidant activity[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2014,42(35):12646-12649.
[11]熊磊,陈慧,胡文兵,等.黄金茶多糖超声提取工艺及体外抗氧化研究[J].江西农业大学学报,2017,39(4):801-809.XIONG Lei,CHEN Hui,HU Wenbing,et al.A study on ultrasonic extraction technology for gold tea polysaccharide and its ecto antioxidant activity[J].Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis,2017,39(4):801-809.
[12]韦晓洁,银慧慧,孟菲,等.超临界CO2流体萃取苦丁茶多糖的工艺优化[J].广西植物,2018,38(5):590-595.WEI Xiaojie,YIN Huihui,MENG Fei,et al.Supercritical CO2fluid extraction process optimization for polysaccharides from Ilex Kudingcha[J].Guihaia,2018,38(5):590-595.
[13]李瑶佳.植物多糖提取方法研究进展[J].现代农业科技,2019(1):222-223,225.LI Yaojia.Research progress on extraction methods of plant polysaccharides[J].Modern Agricultural Science and Technology,2019(1):222-223,225.
[14]温思萌,王亚冬,昝立峰,等.响应面优化酶法提取茯苓多糖工艺[J].中国食品添加剂,2021,32(8):36-43.WEN Simeng,WANG Yadong,ZAN Lifeng,et al.Optimization of enzymatic extraction of pachyman from Poria cocos by response surface methodology[J].China Food Additives,2021,32(8):36-43.
[15]聂铭,陆胜民,王阳光,等.响应面法优化果胶酶辅助提取杨梅花色苷工艺研究[J].食品科技,2021,46(7):194-200.NIE Ming,LU Shengmin,WANG Yangguang,et al.Optimization of anthocyanins extraction assisted with pectinase from red bayberry by response surface methodology[J].Food Science and Technology,2021,46(7):194-200.
[16]陈劲然.超声波对黄大茶多糖的提取率、结构及生物活性的影响[D].合肥:安徽农业大学,2020:15-17.CHEN Jinran.Effects of ultrasound on extraction rate,structure and biological activity of polysaccharide from large yellow tea[D].Hefei:Anhui Agricultural University,2020:15-17.
[17]CHEN W W,JIA Z B,ZHU J J,et al.Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic extraction of polysaccharides from thick-shell mussel(Mytilus coruscus)and their antioxidant activities[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,140:1116-1125.
[18]TENG J,WANG M,LIU Y,et al.Optimization of ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis extraction of tea polyphenols from green tea and their antioxidant activities[J].Journal of Applied Botany and Food Quality,2021,94:140-147.
[19]罗兰心,姜青,李翔,等.生物酶法提取铁观音茶梗中茶多酚工艺技术研究[J].食品研究与开发,2020,41(24):79-85.LUO Lanxin,JIANG Qing,LI Xiang,et al.Study on technique of compound enzyme extraction of tea polyphenols from tieguanyin tea stalks[J].Food Research and Development,2020,41(24):79-85.
[20]蔡邦肖,段玲靓.水浸提绿茶有效成分的工艺优化研究[J].中国食品学报,2011,11(5):120-128.CAI Bangxiao,DUAN Lingliang.Optimization of water extraction technology on active components from tea leave[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2011,11(5):120-128.
[21]ZHANG G W,HU M M,HE L,et al.Optimization of microwave-assisted enzymatic extraction of polyphenols from waste peanut shells and evaluation of its antioxidant and antibacterial activities in vitro[J].Food and Bioproducts Processing,2013,91(2):158-168.