天然微藻多糖具有一定的生物活性，据报道，天然微藻多糖具有抗肿瘤[1]、抗辐射[2]、抗氧化[3]、抑菌[4]、抗病毒和免疫调节[5]、抗糖尿病和抗炎[6]等的作用，加之微藻具有生长速度快、良好的环境适应性、和不占用耕地[7-8]等的特点，因此研究微藻多糖的提取纯化及生物活性对微藻资源的进一步开发利用具有一定意义。
胶网藻属于绿藻门绿藻纲绿球藻目胶网藻科胶网藻属，其对环境表现出良好的耐受能力，且蛋白质含量较高，在污水处理及规模化培养这两个方面具有发展前景[9]。除此之外，Kumar等[10]发现胶网藻Dictyosphaerium chlorelloides具有良好的在极端环境下的适应能力，具有作为胞外多糖来源的潜力。
本文采用超声提取法对胶网藻（Dictyosphaerium sp.1A10）多糖进行提取，并用DEAE-52纤维素柱层析和Sepharose CL-6B凝胶柱层析对粗多糖进行纯化，测定胶网藻粗多糖和纯化后的多糖组分的体外抗氧化能力，通过紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱、高效凝胶色谱等技术分析了胶网藻多糖组分PCP-4的基本结构，以期为胶网藻多糖的进一步研究提供试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
胶网藻（Dictyosphaerium sp.1A10）：海南大学化学工程与技术学院藻种库。
硫酸、氢氧化钠、三氯甲烷、无水葡萄糖、氯化钠、无水乙醇、甲醇、正丁醇、蒽酮：山东西亚化学科技有限公司；甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸：上海麦克林生化有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]、DEAE-52 纤维素、琼脂糖凝胶CL-6B、羟自由基清除率检测试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒：上海源叶生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。试验用水均为超纯水。
1.2 仪器与设备
多用途恒温超声提取机（SY-1000E）：北京弘祥隆生物技术开发有限公司；冷冻离心机（3H12RI）：湖南赫西仪器装备有限公司；紫外可见分光光度计（TU-18010PC）：北京普析通用仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪（TENSOR27）：德国Bruker公司；数显型旋转蒸发仪（RV10PLUS）：德国艾卡仪器设备有限公司；真空冷冻干燥机（SCIENTZ-10N）：宁波新芝生物股份有限公司；全波长酶标仪（XMARKTM）：美国BIO-RAD公司；高效液相色谱仪（Waters 2695）：美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 胶网藻多糖的提取与纯化
1.3.1.1 多糖含量测定
以无水葡萄糖为对照品，用蒽酮硫酸法进行多糖含量的测定。葡萄糖标准曲线的建立：无水葡萄糖用超 纯 水 配 制 成 0.005、0.010、0.025、0.050、0.075、0.100 mg/mL的系列标准溶液。再用80%的浓硫酸溶解配制0.2%蒽酮硫酸溶液，现用现配。吸取1 mL葡萄糖标准溶液和4 mL蒽酮硫酸溶液于10 mL试管中，摇匀后沸水浴10 min，取出后冰浴5 min，在紫外分光光度计620 nm波长下测定吸光度（A620 nm），以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
1.3.1.2 胶网藻粗多糖提取
称取一定量的胶网藻藻粉，按1:25（g/mL）的料液比加超纯水混合，在50℃、超声功率200W条件下超声提取40min，冷冻离心收集上层液，沉淀再次按1:25（g/mL）的料液比加超纯水混合，重复超声提取1次，冷冻离心收集上层液，合并两次提取的上层液，70℃减压旋转浓缩。将浓缩液和Sevage试剂[氯仿-正丁醇=4:1（mL/mL）]按 4:1（mL/mL）混合，涡旋振荡 10 min，8 000 r/min 冷冻离心10 min，分层取上层液，重复此步骤除3次蛋白得到粗多糖溶液。粗多糖溶液再次70℃减压旋转浓缩，加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%以沉淀多糖，4℃过夜，8 000 r/min冷冻离心10 min得到沉淀，将沉淀冷冻干燥得到胶网藻粗多糖。
1.3.1.3 胶网藻粗多糖纯化
称取适量胶网藻粗多糖，用超纯水溶解配制成30 mg/mL的粗多糖溶液。对DEAE-52纤维素进行预处理：取100 g DEAE-52纤维素，用超纯水浸泡抽滤两次后，再加超纯水溶胀12 h后抽滤。接着用0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡1 h，抽滤并用超纯水冲洗至中性，最后用0.5 mol/L的HCl溶液浸泡1 h，抽滤并用超纯水冲洗至中性，保存在20%乙醇溶液中，置于4℃冰箱保存待用。用DEAE-52纤维素装柱（30cm×1.5cm），将粗多糖溶液上样，依次用 0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度为1.5 mL/min，每个管收集3 mL洗脱液，每个梯度收集30管，用蒽酮硫酸法测定A620nm，以管数为横坐标，A620nm为纵坐标绘制洗脱曲线，将分离的各个峰对应的洗脱液合并，透析浓缩，冷冻干燥即得不同多糖组分。
比较不同多糖组分的抗氧化活性，选择抗氧化活性较高的组分进行第二次纯化，取适量该多糖组分溶于超纯水，上样交联琼脂糖凝胶CL-6B层析柱（30 cm×1.5 cm），以超纯水为洗脱液，洗脱速度为0.4 mL/min，每个收集管收集3 mL洗脱液，每个梯度收集30管，用蒽酮硫酸法测定A620nm，绘制洗脱曲线。合并分离峰对应的洗脱液，透析浓缩，冷冻干燥。
1.3.2 胶网藻多糖组分化学性质测定
1.3.2.1 总糖含量测定
参照1.3.1的蒽酮硫酸法测定总糖含量。
1.3.2.2 蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质含量，测定方法参照考马斯亮蓝G250说明书的绘制标准曲线法。
1.3.2.3 糖醛酸含量测定
采用咔唑硫酸法测定多糖中糖醛酸含量，测定方法参考文献[11]绘制标准曲线法。
1.3.2.4 三氯化铁反应
参照文献[12]的方法检测多糖中有无酚类物质。
1.3.3 胶网藻多糖体外抗氧化能力
1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力
参考周新宇等[13]的方法，配制7 mmol/L的ABTS溶液和5 mmol/L过硫酸钾溶液，ABTS溶液和过硫酸钾溶液按1:1（mL/mL）混合，室温避光12 h即得ABTS母液。测定之前，用80%乙醇稀释ABTS母液即得ABTS工作液。在96孔酶标板上，取10 μL不同浓度的样品，加200 μL ABTS工作液作为测定组；空白组用10 μL 80%乙醇替代样品，阳性对照组用VC替代样品。轻摇酶标板混合均匀，室温避光5 min，于酶标仪上测定734 nm处的吸光度（A734nm）。
ABTS+自由基清除率/%=（A1-A2）/A1×100
式中：A1为空白组80%乙醇与ABTS工作液的A734nm；A2为测定组样品与ABTS工作液的A734nm。
1.3.3.2 DPPH自由基清除能力
参考文献 [14]报道方法，配制得0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液。在96孔酶标板上，取100 μL不同浓度的样品，加100 μL 0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液作为测定组；空白组用100 μL超纯水替代测定组的样品，对照组用100 μL甲醇替代测定组的DPPH-甲醇溶液，阳性对照组用VC替代测定组的样品。轻摇酶标板混合均匀，室温避光30 min，于酶标仪上测定517 nm波长处的吸光度（A517nm）。
DPPH 自由基清除率/%=（A1-A2+A3）/A1×100
式中：A1为空白组的 A517 nm；A2为测定组的A517 nm；A3为对照组的A517nm。
1.3.3.3 羟自由基清除能力
按照羟自由基清除率检测试剂盒说明书操作，设置空白组、未损伤组、损伤组、对照组和测定组共5组，按表1分别向2.0 mL离心管中加入不同量的0.75 mmol/L邻二氮菲溶液、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.3）、0.75 mmol/L FeSO4溶液、超纯水、样品溶液和0.01%过氧化氢溶液，共计1.0 mL，混匀置于37℃水浴1 h，每组各取300 μL到96孔酶标板上，于酶标仪上测定536 nm波长处的吸光度（A536nm）。
表1 羟自由基测定试验试剂用量
Table 1 Reagent dosage of hydroxyl radical assay mL
试剂 空白组 未损伤组 损伤组 对照组 测定组邻二氮菲溶液 0 0.15 0.15 0 0.15磷酸盐缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 FeSO4溶液 0 0.1 0.1 0 0.1超纯水 0.8 0.55 0.45 0.7 0.35过氧化氢溶液 0 0 0.1 0 0.1样品溶液 0 0 0 0.1 0.1
羟自由基清除率/%=[（A5-A4）-（A3-A1）]/（A2-A3）×100
式中：A1为空白组的A536nm；A2为未损伤组的A536nm；A3为损伤组的 A536 nm；A4为对照组的 A536 nm；A5为测定组的A536nm。
1.3.3.4 铁离子还原能力
采用铁离子还原法（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定铁离子还原能力，按照总抗氧化能力试剂盒说明书操作，以0.3 mol/L醋酸缓冲液（pH3.6）:TPTZ溶液:FeCl3溶液=10:1:1（体积比）配制成FRAP工作液，将10 mmol/L FeSO4溶液用超纯水分别稀释至 0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mmol/L，作标准曲线。在96孔酶标板上，取30 μL不同浓度的样品，加265 μL的0.3 mol/L醋酸缓冲液（pH3.6）作为测定组；标准曲线组用不同浓度的FeSO4溶液替代样品；空白组用超纯水替代样品。轻摇酶标板混合均匀，37℃水浴30 min，于酶标仪上测定593 nm波长处的吸光度（A536nm），根据标准曲线算出对应FeSO4浓度。
1.3.4 胶网藻纯化多糖光谱扫描
1.3.4.1 紫外光谱扫描
配制1 mg/mL的胶网藻纯化多糖组分水溶液，用紫外分光光度计在波长200 nm～800 nm进行扫描，得到紫外光谱，观察在260 nm和280 nm处有无峰出现。
1.3.4.2 红外光谱扫描
取少量胶网藻纯化多糖组分，和适量干燥的KBr粉末混匀，置于玛瑙研钵中，在钨灯照射下顺时针研磨至无明显颗粒，进行压片处理得到薄片，在傅里叶变换红外光谱仪上以波数4 000 cm-1～400 cm-1进行扫描。
1.3.5 分子量测定
分子量采用高效凝胶色谱法测定，测定方法参考曹猛[15]的方法，测定其出峰时间、重均分子量（weight average molecular weight，Mw）、数均分子量（number average molecular weight，Mn）、峰值分子量（peak average molecular weight，Mp）。
1.3.6 胶网藻纯化多糖的单糖组成测定
胶网藻多糖酸水解：向装有5 mg样品的10 mL具塞试管中加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，充氮气密封，置于120℃烘箱中水解5 h。取出放置冷却至室温，将三氟乙酸旋干，加入2 mL无水甲醇溶解并旋干（重复2次）以除去三氟乙酸。用超纯水溶解后即得胶网藻纯化多糖水解液。
衍生化：配制0.3 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L PMP-甲醇溶液和0.3 mol/L HCl溶液，取300 μL多糖水解液，先加 300 μL NaOH 溶液，再加 300 μL PMP-甲醇溶液混匀，置于70℃水浴50 min，取出冷却至室温，加300μLHCl溶液中和。加2mL三氯甲烷振荡2 min，8 000 r/min离心，取上层水相，重复此步骤3次得上层水相，过0.22 μL滤膜即可上样[16]。
单糖标准品的配制：分别配制4 mmol/L的甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖，按照上述衍生法进行衍生，过0.22 μL滤膜即可上样。
色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate AQC18（4.6mm×250 mm，5 μm）； 流动相为0.02 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）:乙腈=83:17（体积比）；流速 1 mL/min；检测波长 254 nm，柱温 30℃，进样量 10 μL。
1.4 数据处理
每个试验均做3次平行，使用SPSS 23软件对数据进行处理，并采用SPSS 23软件中的独立样本T检验进行显著性分析，使用GraphPad Prism 8软件绘图。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖含量标准曲线
葡萄糖标准曲线如图1所示。
由图1可知，回归方程为Y=0.011X+0.003 9，R2=0.997 3。
图1 葡萄糖含量标准曲线
Fig.1 Standard curve of glucose content
2.2 胶网藻粗多糖纯化与抗氧化活性比较
2.2.1 胶网藻粗多糖DEAE-52柱层析结果及理化性质
胶网藻粗多糖DEAE-52柱层析结果及理化性质见图2和表2。
图2 胶网藻粗多糖DEAE-52纤维素柱层析洗脱曲线
Fig.2 Elution curves of crude Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography
PC-1、PC-2、PC-3、PC-4 分别表示由 0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl洗脱液洗脱下来的4种多糖组分。
表2 胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10的4个纯化组分的化学组成
Table 2 Chemical composition of the polysaccharides from Dictyosphaerium sp.1A10
注：-表示反应阴性。
组别 总糖含量/% 蛋白质含量/%糖醛酸含量/%三氯化铁反应PC-1 75.86±1.18 1.84±0.14 1.04±0.17 -PC-2 70.57±1.69 1.08±0.12 2.47±0.25 -PC-3 68.67±1.77 1.02±0.13 4.83±0.17 -PC-4 73.34±1.07 0.87±0.09 17.66±0.38 -
从图2可以看出，胶网藻粗多糖经过纤维素柱层析，得到5个洗脱峰，其中在NaCl溶液浓度为0.1 mol/L时，有2个洗脱峰，考虑到0.1 mol/L洗脱浓度下的第1个洗脱峰的A620 nm值过低，难以进行后续试验，因此舍弃这个洗脱峰。胶网藻粗多糖经过纤维素柱层析总共得到4个多糖组分。由表2可知，这4个组分中，总糖含量和糖醛酸含量均有差异，其中PC-1的糖醛酸含量最低，符合其用超纯水洗脱出来的情况，可以认为PC-1是中性多糖。而PC-4的糖醛酸含量最高，可能是因为其对应的洗脱液的盐浓度较高，使得酸性多糖被洗脱出来[17]。而4种多糖组分的三氯化铁反应均呈阴性，表明4种多糖组分均不含酚类物质。最后4种多糖组分的蛋白质含量极低，可以认为经过3次Sevage法除蛋白操作后，多糖组分中的蛋白质去除得较干净。
2.2.2 胶网藻多糖4种组分抗氧化活性比较
胶网藻多糖4种组分抗氧化活性测定结果见图3。
图3 多糖组分抗氧化活性
Fig.3 Antioxidant activities of polysaccharides
a.DPPH自由基清除率；b.ABTS+自由基清除率；c.铁离子还原能力；d.羟自由基清除率。
由图3a可以看出，在浓度为0.5 mg/mL时，不同多糖组分对DPPH自由基清除率均较低，粗多糖和PC-4的DPPH自由基清除率高于PC-1、PC-2和PC-3，低于VC。在浓度为2.0 mg/mL时，PC-1的清除率超过粗多糖，达到（73.95±2.23）%，仅次于 PC-4，PC-4的清除率最好，达到（87.94±1.26%），基本上接近阳性对照组VC，表明PC-4对DPPH自由基具有较好的清除能力。Xiao等[19]研究毛竹叶水溶性多糖在浓度为4.0 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到85.9%，与浓度为2.0 mg/mL胶网藻多糖组分PC-4的DPPH自由基清除率接近。
从图3b可以看出，不同的多糖组分对ABTS+自由基的清除率随着多糖浓度的上升而上升，当浓度为1.0 mg/mL～2.0 mg/mL时，多糖组分PC-4和粗多糖对ABTS+自由基的清除率明显比其他多糖组分更高，而PC-1、PC-2和PC-3对ABTS+自由基的清除率较低。当浓度为2.0 mg/mL时，PC-4对ABTS+自由基的清除率达到（37.45±4.50）%，虽远不及同浓度下阳性对照组VC对ABTS+自由基的清除率，但是胶网藻多糖组分PC-4对ABTS+自由基具有一定的清除能力。徐韧博[18]研究松塔多糖组分PKP清除ABTS+自由基的能力，发现其在浓度为5.0 mg/mL时，ABTS+自由基清除率接近40%，相比之下，浓度为2.0 mg/mL的胶网藻多糖组分PC-4，其ABTS+自由基清除能力与浓度为5.0 mg/mL的松塔多糖组分PKP清除ABTS+自由基的能力接近。
在铁离子还原能力测定试验中，测得FeSO4浓度标准曲线回归方程为Y=1.78X+0.15，R2=0.997。由图3c可以看出，不同的多糖组分的铁离子还原能力随着多糖浓度的上升而增强。在整个浓度范围内，粗多糖和PC-4的铁离子还原能力相当，均明显高于PC-1、PC-2和PC-3，在浓度为2.0 mg/mL时，PC-4的铁离子还原能力超过粗多糖，达到（322.89±11.89）μmol/L，对应吸光值为0.73±0.02，与国琦等[20]研究的浓度为4.0 mg/mL黑松露多糖组分TSP-3的吸光值（0.56）相近，表明它们的还原能力接近。胶网藻多糖组分PC-4的铁离子还原能力低于阳性对照组VC。
由图3d可以看出，在羟自由基清除率方面，粗多糖和4个多糖组分的清除效果均较低，其中PC-1、PC-2和PC-3的清除率远低于PC-4和粗多糖。和阳性对照组VC相比，在浓度为2.0 mg/mL时，PC-4清除率达到（27.94±1.86）%，约为同浓度下VC的清除率的一半，表明PC-4具有一定的羟自由基清除能力。沈巳焱[21]研究的红松松塔多糖在4 mg/mL的羟自由基清除率为26.9%，与PC-4的羟自由基清除率相近。
综合上述抗氧化活性试验，确定4种多糖组分中PC-4的抗氧化能力较高，因此选择PC-4进行交联琼脂糖凝胶CL-6B柱层析进一步纯化。
2.2.3 胶网藻多糖组分琼脂糖凝胶CL-6B柱层析结果
胶网藻多糖组分琼脂糖凝胶CL-6B柱层析结果见图4。
图4 胶网藻多糖琼脂糖凝胶CL-6B柱层析洗脱曲线
Fig.4 Elution curves of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide by Sepharose CL-6B column chromatography
从图4可以看出，PC-4的琼脂糖凝胶CL-6B柱层析洗脱曲线为单一峰，且峰形较为对称。测定得到该多糖组分的回收率为81.42%，可以认为收集得到的多糖纯度较高。洗脱曲线和曹猛[15]及李旭东等[12]的研究结果相似。合并峰对应的洗脱液，冷冻干燥，命名为PCP-4多糖组分，用于基本结构分析。
2.2.4 胶网藻多糖组分PCP-4紫外光谱分析
胶网藻多糖组分PCP-4紫外光谱图见图5。
图5 胶网藻多糖组分PCP-4紫外光谱图
Fig.5 Ultraviolet spectrum of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide PCP-4
由图5可知，多糖组分PCP-4在260 nm和280 nm处没有明显的吸收峰，又因为核酸和蛋白质的紫外吸收峰分别为260 nm和280 nm，因此可以认为PCP-4的核酸和蛋白质去除得较干净。
2.2.5 胶网藻多糖组分PCP-4红外光谱分析
胶网藻多糖组分PCP-4红外光谱图见图6。
图6 胶网藻多糖组分PCP-4红外光谱图
Fig.6 Infrared spectrum of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide PCP-4
由图6可知，PCP-4在3 414.06 cm-1处的峰为OH氢键的伸缩振动引起的[22]，2 937.25 cm-1处的峰是由—CH2—的C—H对称伸缩振动引起的[23]，1 651.32 cm-1和1 639.85 cm-1处的峰为羟基的不对称伸缩振动引起的[24]，1 407.94 cm-1处的峰为羧基的对称振动引起的，这个峰是多糖的特征峰[25]，表明有糖醛酸存在[26]，1 388.50 cm-1处的峰主要是C—H的变角振动引起的[27]，1 242.57 cm-1处的峰属于S=O伸缩振动引起的，表明含有硫酸基[28]，1 052.14 cm-1处的峰为C—O—C的伸缩振动引起的，表明含有吡喃糖存在[29]。综上，红外光谱表明PCP-4具有糖类化合物的特征峰，可以判断PCP-4为糖类化合物，且PCP-4含有糖醛酸和硫酸基，可以认为PCP-4是酸性多糖。
2.2.6 胶网藻多糖组分PCP-4的高效凝胶色谱结果
胶网藻多糖组分PCP-4的高效凝胶色谱结果见表3。
表3 胶网藻多糖组分PCP-4的高效凝胶渗透色谱结果
Table 3 High performance gel permeation chromatography（HPGPC）result of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide PCP-4
出峰时间/min多分散系数（Mw/Mn）21.24 121 762 115 750 111 468 1.05重均分子量（Mw）/Da数均分子量（Mn）/Da峰值分子量（Mp）/Da
如表3所示，PCP-4多糖组分为单个峰，其中PCP-4的多分散系数为1.05，接近1，可以表明PCP-4多糖的分子量分布均匀。
2.2.7 胶网藻多糖组分PCP-4单糖组成结果
衍生化混合单糖标准品和胶网藻多糖组分PCP-4的高效液相色谱图见图7。
如图7所示，衍生化混合单糖标准品的高效液相色谱图出峰效果较好，将其与单个单糖标准品的高效液相色谱图进行对比，可以得知峰对应的单糖成分。
图7 衍生化混合单糖标准品和胶网藻多糖组分PCP-4的高效液相色谱图
Fig.7 High performance liquid chromatography（HPLC）chromatograms of standard monosaccharides and PCP-4
a为标准单糖混合物，b为PCP-4水解产物；1～9依次为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。
经过酸水解和衍生化后的胶网藻多糖组分PCP-4与单糖标准品进行出峰时间比较，并对峰面积计算摩尔比值。胶网藻多糖组分PCP-4由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖组成，甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖的摩尔比为9.26:40.62:0.93:5.98:2.01:1.70。可见胶网藻多糖组分PCP-4主要由鼠李糖、甘露糖和半乳糖醛酸组成，还有少量的葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖。
2.2.8 胶网藻多糖组分PCP-4的体外抗氧化活性分析
胶网藻多糖组分PCP-4的体外抗氧化活性分析结果见表4。
如表4所示，多糖组分PCP-4在4种抗氧化活性测定中，均表现出一定的抗氧化活性，PCP-4较多糖组分PC-4的抗氧化活性有一定的提升，但无显著性差异（P＞0.05）。有报道表明其它藻类多糖的DPPH自由基清除率表现较好，如小球藻胞外多糖CPEPS-A1在浓度为1.0 mg/mL时DPPH自由基清除率达到（93.89±0.09）%[30]， 栅藻多糖 DAP3在浓度为 5.0 mg/mL时DPPH 自由基清除率达到（91.86±1.31）%[26]，相较这两种藻，胶网藻PCP-4在浓度为2.0 mg/mL下具有较好的DPPH自由基清除率。PCP-4具有一定的ABTS+自由基清除能力，有文献报道，叶托马尾藻多糖在浓度为2.0 mg/mL时的ABTS+自由基清除率约为30%[31]。PCP-4也具有一定的羟自由基清除能力，和文献报道的普通念珠藻相似，清除率随着PCP-4浓度的增加而增加，但总的清除率很低，普通念珠藻多糖在浓度为2.0 mg/mL时的羟自由基清除率为20%左右[32]。浓度2.0 mg/mL的PCP-4铁离子还原力对应的吸光度为0.74±0.03，高于5 mg/mL浓度下的褐藻多糖EGPS3-A的吸光度（0.13±0.04）[33]。
表4 多糖组分PCP-4与PC-4的抗氧化活性比较
Table 4 Comparison of antioxidant activity between PCP-4 and PC-4
注：同列不同字母表示样品间差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。
组别浓度/（mg/mL）DPPH自由基清除率/%ABTS+自由基清除率/%羟自由基清除率/%铁离子还原力/（μmol/L）PCP-4 2.0 87.94±1.24a 43.76±1.64a 32.16±1.16a 328.77±17.04a PC-4 2.0 88.46±1.98a 37.45±4.55a 27.94±1.86a 322.89±11.89a
3 结论
采用超声辅助提取法提取胶网藻粗多糖，并对粗多糖进行DEAE-52纤维素柱层析分离得到4个组分PC-1、PC-2、PC-3和PC-4，对抗氧化活性较高的多糖组分PC-4进行Sepharose CL-6B凝胶柱层析进一步纯化得到胶网藻多糖组分PCP-4。其中PCP-4对DPPH自由基清除具有明显的效果，对ABTS+自由基和羟自由基具有一定的清除效果，且清除率随浓度的增大而上升，同时还具有一定的还原能力。PCP-4的Mw为121 762 Da。PCP-4含有吡喃糖、糖醛酸和硫酸基，为酸性多糖。PCP-4主要由鼠李糖、甘露糖和半乳糖醛酸组成，还有少量的葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖，其中甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖的摩尔比为9.26:40.62:0.93:5.98:2.01:1.70。
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