如何通过便利而经济的生产方式得到有机硒或单质硒已成为近些年的研究热点[1]。本课题组前期通过基因工程方法构建了一株谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）基因重组乳酸菌NZ9000/pNZ8148-GPx（简称NG1），利用了微生物廉价易得、方便培养、生长较快、产率较高的优势。虽然无机形态的Na2SeO3 通过微生物的内部代谢可转化为有利于人体吸收的成分[2]，但高浓度的Na2SeO3 会影响菌株的正常生长[3]；因NG1 应用了乳酸菌中最具代表性的乳酸链球菌素诱导控制的基因表达系统（nisin-inducible controlled gene expression，NICE）[4]，故乳酸链球菌素（Nisin）的诱导量是影响菌株发酵生产力的重要因素[5]；再者，每种细菌都有最适合自身生长的温度和pH 值[6]，而pH 值是乳酸菌在发酵生产上得以应用的重要影响因素[7]。因此，以上4 个因素的优化问题将成为NG1 工程菌得以开展后续发酵和应用研究的前提。
因乳酸菌具有富硒能力[8]，而益生菌富有维持肠道菌群生态平衡、抑菌、抗氧化等益生功能，故富硒乳酸菌具有益生菌和补硒的双重功效[9]。Fuller[10]最早提出了“最好的菌种来源是分离自同种动物的胃肠道”的观点。鉴于动物胃内高胆盐、强酸性的环境，势必要求益生菌种具备相应的抗逆功能。由于谷胱甘肽过氧化物酶本身具有抗氧化、抗炎等作用[11-12]，本试验所用GPx 重组乳酸菌有望成为集乳酸菌、乳酸菌代谢物和谷胱甘肽过氧化物酶三者优势于一体的新菌株。通过NG1 菌株体外的H2O2、胆盐和酸度耐受试验可评估其抗逆功能；通过与未导入GPx 基因的重组乳酸菌NZ9000/pNZ8148（简称NG0）的对比，可判断外源GPx基因的导入对乳酸菌抗逆性能的影响。总之，本文对GPx 基因重组乳酸菌NG1 的培养温度、初始pH 值、Na2SeO3 浓度和Nisin 浓度4 个生长条件进行优化，并对其体外抗逆功能指标进行分析，以期为后续发酵生产以及定殖于人体胃肠道内的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
乳酸菌NG1：广西大学轻工学院食品生物技术实验室保存的NZ9000/pNZ8148-GPx 重组乳酸菌；乳酸菌NG0：广西大学轻工学院食品生物技术实验室保存的NZ9000/pNZ8148 重组乳酸菌。
1.1.2 试剂
牛肉粉、酵母浸粉、大豆胨、蛋白胨、酪蛋白胨、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸钠、硫酸镁（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；氯霉素、乳酸链球菌素（均为生物级）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亚硒酸钠（生物级）：美国Sigma-Aldrich 公司；胆汁酸盐（生物级）：大连美仑生物技术有限公司；30%过氧化氢（优级纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
pH 计（A111）：美国Thermo Fisher Scientific 公司；立式自动压力蒸汽灭菌器（GI80TW）：厦门致微仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-2F）：苏州安泰空气技术有限公司；酶标仪（M200 PRO）：瑞士TECAN 公司；超纯水机（Mili-QAdvantageA10）：美国Millipore 公司；振荡培养箱（ZQZY-85CS）：上海知楚仪器有限公司；电热恒温培养箱（DHP-9082）：上海齐欣科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基和试剂的配制
1.3.1.1 培养基的配制
M17 培养基：5 g/L 牛肉粉、2.5 g/L 酵母浸粉、5 g/L大豆胨、2.5 g/L 蛋白胨、2.5 g/L 酪蛋白胨、19 g/L β-甘油磷酸钠、0.5 g/L 抗坏血酸钠和0.25 g/L 硫酸镁，pH7.0～7.4。配制固体平板时在此基础上加15 g/L 琼脂粉。各成分按照比例加入后用蒸馏水定容至所需体积，并经103.4 kPa、115 ℃高压灭菌20 min 后使用。
GM17 培养基：将已灭菌冷却的葡萄糖和M17 培养基混合，使葡萄糖终浓度为0.5%。
GM17（Cr+）培养基：添加了氯霉素（终浓度为12.5 μg/mL）的GM17 培养基。
1.3.1.2 试剂的配制
25 mg/mL 氯霉素：将氯霉素按配比溶于无水乙醇中，过膜除菌，冻藏待用。
100 mg/mL Na2SeO3：将Na2SeO3 按配比溶于无菌超纯水中，过膜除菌，冻藏待用。100 μg/mL Nisin：将Nisin 按配比溶于0.05%醋酸中，过膜除菌，冻藏待用。
1.3.2 菌株的常规活化培养
取实验室保存的NG1 和NG0 原始菌种，均采用分区划线法接种于GM17（Cr+）平板上，30 ℃、过夜静置培养；挑取单菌落并接种至GM17（Cr+）液体培养基中，装液量为7 mL/30 mL 直型瓶，30 ℃、过夜静置培养，活化2～3 代后即可作为菌液使用。
1.3.3 生长曲线的测定
以1%接种量将活化后的NG1 菌液接种于GM17（Cr+）液体培养基中，装液量为100 mL/250 mL，30 ℃静置培养24 h；每隔2 h 取样测定一次发酵液中乳酸菌NG1 在600 nm 处的吸光值（OD600 值）；以菌株培养时间为横坐标，OD600 值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。
1.3.4 生长条件的单因素优化试验
以GM17（Cr+）为基础培养基，分别考察培养温度（30、35、37、40 ℃）、液体培养基的初始pH 值（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0）、Na2SeO3 浓度（0、20、40、60、80、100、120 μg/mL）、Nisin 浓度（0、1、5、10、20、30、40、50 μg/mL）对乳酸菌NG1 生长的影响，即通过该菌株培养至对数生长后期（即按1%接种量扩培后养菌至18 h）能达到的最大OD600 值来获取最优的单因素培养条件。
1.3.5 响应面法优化培养条件
在单因素试验的基础上，选取对乳酸菌NG1 生长影响较显著的三因素三水平，继续以培养温度（A）、初始pH 值（B）和Na2SeO3 浓度（C）为考察变量，以菌液OD600 值（Y）为响应值，并通过Design-Expert 8.0.6 软件的Box-Behnken 设计完成响应面分析试验[13-14]。因素水平见表1。
表1 响应面试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface method
水平因素A 培养温度/℃ B 初始pH 值C Na2SeO3 浓度/（μg/mL）-1357.020 0377.540 1408.060
1.3.6 体外耐受试验
用30% H2O2 原溶液及其稀释液配制含H2O2 浓度分别为0、0.1、0.4、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L 的GM17（Cr+）液体培养基；配制含胆汁酸盐浓度分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%的GM17（Cr+）液体培养基；用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 分别调配pH 值为2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 的GM17（Cr+）液体培养基。分别取以上3 种模拟胃肠道极端环境[15]的培养基200 μL 于酶标板孔中，将NG1 以1%的接种量完成接种，做两组平行；30 ℃静置胁迫培养约18 h，测定菌液对数后期的OD600 值；以NG0 为空白对照，同时以响应面试验筛选出的最优生长条件胁迫培养NG1作为对照组。
1.3.7 菌体耐受能力测定
测定不同胁迫条件下的菌液对数生长后期（即按1%接种量扩培后养菌至18 h）的OD600 值，计算菌种不同胁迫条件下的耐受能力，公式[16]如下。
N=（X/K）×100
式中：N 为耐受能力，%；X 为胁迫条件下菌液的OD600 值；K 为空白培养基的OD600 值。
2 结果与分析
2.1 生长条件的单因素优化结果
培养温度、初始pH 值、Na2SeO3 浓度和Nisin 浓度对乳酸菌NG1 的生长影响如图1所示。
图1 不同培养温度、初始pH 值、Na2SeO3 浓度、Nisin 浓度下乳酸菌NG1 的生长曲线
Fig.1 NG1 growth curves under different temperatures，pH values，Na2SeO3 concentrations，and Nisin concentrations
a.培养温度；b.初始pH 值；c.Na2SeO3 浓度；d.Nisin 浓度。
由图1a 可知，在14 h 前，乳酸菌NG1 在37 ℃的培养温度下生长略有滞后，40 ℃下生长明显滞后；30 ℃和35 ℃
条件下生长趋势比较一致；但培养至18 h 时，37 ℃培养的菌体在对数末期的OD600 值最大。故确定NG1 的最适生长温度为37 ℃。
由图1b 可知，乳酸菌NG1 在pH3.0 和pH4.0 条件下生长被严重抑制；随着培养基初始pH 值升高，NG1生长状况越来越好；至pH7.5 时，NG1 生长速率和OD600值均为最高，在18 h 也是最高值；而pH 值高于7.5后，随着碱度增大，菌体生长速率逐渐减缓；在pH 值为10.0 的培养基中，NG1 也能正常生长。综上，pH7.5 为NG1 的最适生长初始pH 值，且NG1 适宜生长培养基为弱碱性，即菌体对碱性环境的耐受能力强于酸性环境。
由图1c 可知，前20 h 内，不同Na2SeO3 浓度（0～120 μg/mL）对乳酸菌NG1 的生长影响整体呈抑制趋势，但相对于其它组，40 μg/mL 的富硒浓度下NG1 生长状况最好；故确定NG1 最适生长的Na2SeO3 浓度为40 μg/mL。这比乳杆菌株JZ-07[17]和鼠李糖乳杆菌ATCC 53103[18]的最佳富硒诱导剂量10 μg/mL 高，但与布氏乳杆菌922-11[19]的最佳富硒诱导剂量43～46 μg/mL相近。
由图1d 可知，Nisin 的加入量为0～50 μg/mL 时对NG1 生长影响不明显，生长趋势大体一致，OD600 值也相差不大。因此，Nisin 浓度不作为后续响应面优化和验证的考察因素。
2.2 响应面试验设计结果与分析
2.2.1 响应面试验的设计与方差分析
NG1 生长条件的响应面设计分析结果见表2。
表2 NG1 生长条件优化响应面试验设计与结果
Table 2 Design and result of response surface method for growth condition optimization of NG1
序号因素OD600 值A 培养温度 B 初始pH 值 C Na2SeO3浓度预测值 实际值1-1-100.680.71 21-100.270.21 3-1100.710.77 41100.520.49 5-10-10.910.84 610-10.360.38 7-1010.810.79 81010.750.82 90-1-10.600.64 1001-10.640.65 110-110.640.63 120110.890.85 130000.760.71 140000.760.82 150000.760.76 160000.760.79 170000.760.74
对表2 数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程为Y=0.76-0.15A+0.071B+0.073C+0.055AB+0.12AC+0.052BC-0.10A2-0.12B2+0.046C2。对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。
表3 模型回归方程方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度均方F 值P 值 显著性模型0.46090.05112.29 <0.01**A0.18010.18043.96 <0.001**B0.04110.0419.75 <0.05*C0.04210.04210.10 <0.05*AB0.01210.0122.91 0.132 0 AC0.06010.06014.42 <0.01**BC0.01110.0112.65 0.147 7 A20.04410.04410.52 <0.05*B20.05810.05813.84 <0.01**C28.717×10-318.717×10-3 2.09 0.191 2残差0.02974.164×10-3失拟项0.02237.275×10-3 3.98 0.107 9 不显著纯误差 7.320×10-341.830×10-3总和0.4916
表3 结果表明：模型P=0.001 6<0.01，失拟项P=0.107 9＞0.05，说明模型显著；判定系数R2=0.940 5，接近于1，即实际值和预测值接近，说明模型拟合性较好；调整判定系数R2Adj=0.864 0，说明该模型能够解释86.40%试验数据的变化；变异系数为9.46%（<10%），说明模型的可信度和精确度较高。因此，可用此模型分析与预测NG1 在不同条件下的生长状况。一次项A、交互项AC、二次项B2 影响极显著（P<0.01）；一次项B和C、二次项A2 影响显著（P<0.05）；交互项AB 和BC、二次项C2 影响不显著（P>0.05）。
2.2.2 响应面的交互作用分析
培养温度、初始pH 值、Na2SeO3 浓度3 个因素两两之间交互作用的响应面图如图2所示。
图2 不同培养温度、初始pH 值、Na2SeO3 浓度交互作用对NG1生长影响的响应曲面与等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between different cultivation temperatures，initial pH values，and Na2SeO3 concentrations on the growth of NG1
由图2 可知，随着单因素培养温度或培养基初始pH 值的升高，乳酸菌NG1 生长均呈现先加快后放缓的趋势，且均存在极高值点；随着单因素Na2SeO3 浓度升高，菌体生长状况越来越好。此外，因响应面3D 曲面图坡度和等高线反映了因素间交互作用的强弱[20]，那么通过对比可以判断三因素间只有AC 交互作用极显著，且与模型方差分析结果一致。
2.2.3 最优生长条件的确定
运用Design-Expert 8.0.6 软件设计三因素三水平试验方案，以及分析试验数据和建立模型后，对回归方程求解得到模型最大值，即最优生长条件：培养温度36 ℃，初始pH7.6，Na2SeO3 浓度59 μg/mL，此时菌体OD600 值预测为0.86。在预测最佳培养条件下进行诱导试验，做3 个重复，所得菌体的实际OD600 值为0.87，与预测值接近，说明该模型合理可行的。
2.3 乳酸菌NG1 的富硒强度和色差
不同浓度Na2SeO3 对乳酸菌富硒色泽的影响如图3所示。
图3 添加不同浓度的Na2SeO3 对乳酸菌富硒色泽的影响
Fig.3 Effect of different concentrations of Na2SeO3 on Se-enriched colour of lactic acid bacteria
由图3 可知，在单因素和响应面试验过程中，在不同无机硒（Na2SeO3）浓度的富硒培养条件下，随着菌体生长，不同菌液培养体系因为析出红色单质硒而呈现不同程度的红色[21]。在其他培养条件统一时，即在培养温度30 ℃、培养基初始pH7.3 和不加Nisin 条件下，菌体的红色会随加入的Na2SeO3 浓度升高而变深，即富硒作用加强。
2.4 NG1 抗逆功能的测定结果
NG1 在不同浓度H2O2、胆汁酸盐以及不同酸度下的耐受力和生长OD600 值分别如表4～表6 和图4所示。
表4 NG1 在不同浓度H2O2 下的耐受力
Table 4 Tolerance of NG1 in different concentrations of H2O2
H2O2 浓度/（mmol/L）耐受能力/%NG0（常规培养） NG1（常规培养） NG1（优化培养）0.198.092.8112.3 0.492.787.7109.1 0.788.791.4116.9 1.091.794.5108.1 1.589.685.653.2 2.086.427.919.9 2.564.624.721.0 3.027.527.618.9 4.025.523.318.7 5.021.722.418.3 6.020.320.118.7
表5 NG1 在不同浓度胆汁酸盐下的耐受力
Table 5 Tolerance of NG1 in different concentrations of bile acid salts
胆汁酸盐浓度/%耐受能力/%NG0（常规培养） NG1（常规培养） NG1（优化培养）0.0541.239.753.1 0.1032.336.655.8 0.1531.934.040.9 0.2028.030.739.5 0.3032.729.511.6
表6 NG1 在不同酸度下的耐受力
Table 6 Tolerance of NG1 in different acidity
pH 值耐受能力/%NG0（常规培养） NG1（常规培养） NG1（优化培养）2.028.026.221.9 3.026.122.320.1 4.024.220.017.1 5.024.119.918.7 6.096.981.226.7
由表4 和图4a 可知，相对于NG0，0～1.5 mmol/L H2O2 浓度梯度下，NG1 的生长几乎不受影响；当H2O2浓度高于1.5 mmol/L 后，OD600 值降低明显，NG1 在两种培养条件下的生长均受到抑制，说明其H2O2 最高耐受浓度为1.5 mmol/L。当H2O2 浓度低于1.0 mmol/L时，优化培养的NG1 对H2O2 耐受能力比空白对照组明显增强。这个结果与酸粥中筛选出的乳酸菌在含1.0 mmol/L H2O2 的培养基中仍生长良好的情况[22]一致。
图4 NG1 在不同浓度H2O2、胆汁酸盐及不同酸度下的生长OD600 值
Fig.4 Growth OD600 of NG1 at different concentrations of H2O2，bile acid salts，and acidity
a.H2O2 浓度；b.胆汁酸盐浓度；c.酸度。
由表5 和图4b 可知，胆汁酸盐浓度为0.10%～0.20%时，随着胆汁酸盐浓度的升高，NG1 耐受力逐渐降低；当胆汁酸盐浓度高于0.20%时，OD600 值降低明显，优化培养的NG1 生长受到明显的抑制，常规培养的NG1 生长率也略微降低，说明其胆汁酸盐最高耐受浓度为0.20%。优化培养的NG1 在胆汁酸盐0.05%～0.20%浓度下耐受能力达到39.5%～55.8%，较对照组有明显增强。因此，NG1 同其它乳酸菌[23-24]一样对胆汁酸盐的耐受力比较高。
由表6 和图4c 可知，当pH 值低于6.0 时，OD600 值降低明显，NG0 和NG1 的生长均受到抑制，说明其酸度的最大耐受值为pH6.0；而且NG0 在pH6.0 时对酸度的耐受能力比NG1 明显增强，说明NG1 耐酸性能较弱。这一结果与李利等[25]对几株乳酸菌筛选出的pH6.0的耐酸度一致；而来自动物的很多乳酸菌在pH4.0 下仍能保持活力[26]，表示出更强的耐酸性。
综上，NG1 对H2O2 浓度、胆汁酸盐浓度、酸度的最大耐受值分别为1.5 mmol/L、0.20%、pH6.0；耐受能力排序为优化培养NG1>常规培养NG1>常规培养NG0，说明GPx 基因的导入对乳酸菌的抗H2O2 和胆汁酸盐胁迫功能有增强作用，且在最优培养条件下得到强化，但对酸度耐受性无明显增强作用。据悉，人体小肠液因含有胰蛋白酶、胆汁酸等，其pH 值约为7.6，胆汁酸盐质量分数在0.03%～0.3%之间波动[27]。故肠道pH 值并不是乳酸菌进入消化道发挥作用的阻碍因素，更多的是胰蛋白酶和胆汁酸盐的存在影响了乳酸菌的生长[28]。而人体胃液pH 值在空腹和进食后在0.9～5.0 之间波动。故胃液的强酸环境才是胁迫乳酸菌生长的主要因素。因此，乳酸菌NG1 一定程度上具备了食用价值和定植于肠道的潜能。
3 结论
本研究采用单因素试验和响应面分析法优化GPx基因重组乳酸菌NG1 的生长条件，确定了NG1 的最适生长条件为培养温度36 ℃、初始pH7.6、Na2SeO3 浓度59 μg/mL。此外，通过3 项模拟胃肠道环境的体外抗逆功能研究，确定了NG1 对各胁迫因素的最高耐受值为H2O2 1.5 mmol/L、胆汁酸盐0.20%、pH6.0。由于耐受能力排序为优化培养NG1>常规培养NG1>常规培养NG0，说明GPx 基因的导入对乳酸菌的抗H2O2 和胆汁酸盐胁迫功能有增强作用，且在最优培养条件下得到强化，但对酸度耐受性无明显增强作用。综上所述，该研究结果表明NG1 具有被食用和定植于肠道的极大潜能，同时可为更多来源的硒蛋白及富硒乳酸菌的基础研究及其在食药方面的市场应用提供重要参考。
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