饮用水水质与人类健康密切相关。目前城市居民的饮水大多来自市政供水，少数郊区居民仍采用自备井水。市政供水水质除了受到出厂水的影响，管网输水及水箱储存过程也会产生污染；自备井水则会受到当地地质、人为污染等因素影响[1]。随着城镇化的发展以及居民对饮用水品质需求的与日俱增，微生物污染成为十分重要的饮水安全问题。致病微生物在水中长期存在并大量繁殖，其致病毒力因子可以在水中扩散传播，直接影响人体健康。
微生物学指标是目前用于饮用水生物性污染评价的重要指标，也是流行病学中水质安全的保障[2]。根据GB 5749—2022《生活饮用水卫生标准》，水质微生物指标包括总大肠菌群、大肠埃希氏菌以及菌落总数。此外，微生物群落的丰度和多样性受水体环境的直接影响，一定程度上反映了水生态系统的健康情况[3-5]。对饮用水中微生物群落进行解析，既能评估微生物群落的多样性，又能识别公共卫生关注的微生物类群，更好地评估饮用水的微生物安全性，从而评估大规模介水传染病暴发的风险[6]。现有研究主要集中在饮用水水质指标监测方面，对于饮用水微生物群落结构的研究较少。本文为了解水质指标、微生物污染情况和群落结构在不同类型饮用水中的变化特征及相关性，对城市城区管网末梢水、楼宇水箱水和城市郊区自备井水进行采样，测定理化指标以及微生物群落结构，以期为更好地保障居民饮用水健康提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 采样点与水样收集
针对城市城区管网末梢水、楼宇水箱水和城市郊区自备井水3 种饮用水进行现场采样。其中，自备井水（n=5），具体编号为WW_1、WW_2、WW_3、WW_4、WW_5；楼宇水箱水（n=3），具体编号为TW_1、TW_2、TW_3；管网末梢水（n=4），具体编号为MW_1、MW_2、MW_3、MW_4。共12 个水样。
1.2 检测项目
按照GB/T 5750《生活饮用水标准检验方法》对水样进行采集、保存、运输及检验。水样检测指标：感官性状和一般化学指标[pH 值、浑浊度、总溶解固体（total dissolved solids，TDS）、Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Cl-、SO42-]、毒理指标（Pb2+、Cd2+、F-、NO3--N）、微生物指标（菌落总数、总大肠菌群、大肠埃希氏菌）。
1.3 DNA 提取与Illumina MiSeq 高通量测序
采用DP328 DNA 提取试剂盒提取，按照试剂盒说明书进行样品DNA 提取。将提取到的基因组DNA，对16S rDNA V3-V4 区进行扩增，以3 组样品：自备井水、楼宇水箱水、管网末梢水共12 个水样所提取的DNA原液作为聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）模板，利用细菌16S rDNA 通用引物进行扩增。通用引物序列为B314F：（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），B785R：（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR 进行2 轮扩增，第1 轮反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；25 个循环；72 ℃后保温5 min，于4 ℃保存。第2 轮反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，8 个循环；72 ℃后保温5 min，于4 ℃保存。反应结束后配制2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，胶回收按照QIAquick Gel Extraction Kit 操作流程进行，进行Illumina MiSeq 高通量测序。
1.4 数据处理
使用Mothur 软件对数据进行序列过滤，去除平均质量得分≤20 的序列，去除含N 的序列，去除同聚体过长（>10 bp）的序列；去除引物错配过多（≥4 bp）的序列，并去除引物序列；去除过短（≤200 bp）和过长（≥500 bp）的序列；使用UCHIME 法以Gold 数据集作为参比，去除嵌合体（chimera），以得到用于后续分析的优质序列。
使用USEARCH 根据序列相似度将序列聚类为操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），相似度高于97%的序列聚类为一个OTU，OTU 聚类时将稀有序列（singleton）弃去。通过Mothur 软件计算各水样的丰富度和多样性指数。使用PyNAST 将3 组水样的OTU序列比对到SILVA 数据库，用UniFrac 生成群落间距离矩阵，通过主成分分析绘制二维主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）图。通过Excel 软件对细菌相对丰度进行统计，解析微生物群落组成。
2 结果与分析
2.1 水体的理化性质
不同类型饮用水的常规水质指标如表1所示。
表1 不同类型饮用水的常规水质指标
Table 1 Conventional water quality indicators of different types of drinking water
总溶解固体TDS/（mg/L）检测指标 pH 值 浑浊度/NTU NO3--N/（mg/L）自备井水 7.43～7.87菌落总数/（CFU/mL）总大肠菌群/（CFU/100 mL）大肠埃希氏菌/（CFU/100 mL）Fe3+/（mg/L）Mn2+/（mg/L）Cu2+/（mg/L）Zn2+/（mg/L）Pb2+/（mg/L）Cd2+/（mg/L）F-/（mg/L）Cl-/（mg/L）SO42-/（mg/L）2.889～6.406楼宇水箱水0.13～0.31 207～348 18～2400～500～20.011～0.059 0.004～0.050低于检出限0～0.20 低于检出限低于检出限0.324～0.482 10.271～42.503 19.688～155.976 2.381～8.672管网末梢水7.55～7.85 0.20～0.33 181～337 未检出未检出未检出0.025～0.039 0.004 0～0.001 低于检出限低于检出限低于检出限0.376～0.409 13.641～57.639 39.009～79.429 2.081～8.760饮用水卫生标准限值7.52～7.85 0.18～0.27 161～3360～29未检出未检出0.022～0.071 0.004 0～2.218 0～0.32 低于检出限低于检出限0.318～0.414 10.094～57.380 36.820～79.143 6.50～8.50 1.001 000100不应检出不应检出0.300 0.100 1.0001.000.010.051.000 250.000 250.000 10.000
由表1 可知，3 种类型饮用水的水质常规指标检测结果略有不同。自备井水中检测出菌落总数为18～240 CFU/mL，超过饮用水卫生标准限值（100 CFU/mL）；同时还检测出总大肠菌群和大肠埃希氏菌，说明自备井水中存在一定的微生物污染。微生物指标中菌落总数是评价水受到污染的参考指标，水体受污染的程度越高，水中的菌落总数就越高[7]，总大肠菌群超标表明可能存在肠道传染病菌[8]，而大肠埃希氏菌则是水体受粪便污染的重要指示菌[9]。造成自备井水微生物指标不合格的原因可能包括污水排放随地表水或雨水渗入地下、自备井与厕所等粪水距离较近、地面存在动物粪便被粪水污染等[10]。因此，需要加强自备井水的净化消毒以及日常监管维护。
所采集的管网末梢水样中，某采样点的Cu2+浓度最高达2.218 mg/L，超过饮用水卫生标准限值（1.000 mg/L）。长期饮用含铜超标的水会导致生物体的肝脏和肾脏受到严重的损害，造成严重的疾病[11]。研究表明出厂水会受到配水系统本身的影响，比如管道材料[12]、管道腐蚀[13]和松散沉积物的再悬浮[14]等。本研究管网末梢水Cu2+超标的原因可能是该采样点的输配水设施材质造成金属离子析出[15]或是与管道老化锈蚀有关[16]。因此，需要慎重选择运输管道的材质，并加强输水管网体系的后期运行维护，保障居民的安全用水。其余检测指标均未见超标现象，均符合GB 5749—2022《生活饮用水卫生标准》。综上所述，本研究中楼宇水箱水的水质最优，其次为管网末梢水和自备井水，这与相关的研究结果相符[15]。
2.2 微生物群落结构分析
2.2.1 微生物群落Alpha 多样性分析
各水样的丰富度和多样性指数如表2所示。
表2 Alpha 多样性指数统计表
Table 2 Statistical table of Alpha diversity indexes
类型水样名称序列数OTUChao1 指数丰富度覆盖率/%香农指数辛普森指数自备井水WW_152 38283092488799.794.000.058 WW_252 6681 7791 9001 94199.475.260.020 WW_345 7531 2861 3921 41999.524.750.030 WW_441 8251 2881 4731 47199.374.710.033 WW_543 80759366864299.803.380.092楼宇水箱水TW_158 97759366465399.842.290.348 TW_260 72455464161599.853.110.111 TW_358 92460868766499.842.950.144管网末梢水MW_145 0699201 0601 05699.594.100.052 MW_247 76161975469699.753.160.122 MW_347 32073386881799.723.570.092 MW_454 1501 4911 6271 64699.524.910.026
由表2 可知，覆盖率为99.37%～99.85%，表明测序结果可靠，可以较为真实、准确地描述样本微生物群落信息。统计各水样在不同OTU 中的丰度信息，其中，自备井水的OTU 较多，为593～1 779 个，楼宇水箱水的OTU 较少，为593～608 个，这表明自备井水有较多的特有微生物种类。香农指数和辛普森指数表示微生物群落的多样性，香农指数越大多样性越高，辛普森指数越小多样性越高[17]。ACE 和Chao1 通常用于估计样本中微生物群落丰富度，两者值越大代表物种越多[18]。3 种类型饮用水中香农指数为自备井水＞管网末梢水＞楼宇水箱水，辛普森指数为楼宇水箱水＞管网末梢水＞自备井水，ACE 为自备井水＞管网末梢水＞楼宇水箱水，Chao1 指数为自备井水＞管网末梢水＞楼宇水箱水，上述结果表明，自备井水的微生物群落多样性与丰富度最高，而楼宇水箱水的微生物群落多样性与丰富度最低。
2.2.2 微生物群落Beta 多样性与差异细菌分析
基于Unifrac 距离的PCoA 分析能描述不同样品间是否有显著的微生物群落差异，如果两个样品的距离较近，则表示这两个样品的微生物群落组成较相似[19]。本研究中自备井水、管网末梢水和楼宇水箱水的细菌群落PCoA 分析（weighted UniFrac）如图1所示。
图1 不同类型饮用水的UniFrac 加权主坐标PCoA 分析
Fig.1 Weighted UniFrac PCoA analysis of different types of drinking water
由图1 可知，第一主成分、第二主成分的贡献率分别为76.6%、10.1%。从组间差异来看，自备井水与楼宇水箱水组间差异较大；从组内相似度来看，楼宇水箱水的3 个水样相似度最高，自备井水的5 个水样相似度最低，管网末梢水的相似度居中。自备井是农村及边远地区的一种供水方式，其分布较为分散，地理位置跨度较大，且水质易受周围环境和居民生活影响，因此组内相似度较低。而楼宇水箱水的来源为市政供水，且水箱具有建设标准及维护措施，因此组内相似度较高。
2.2.3 微生物群落组成分析
在门水平上，水样的细菌群落结构如图2所示。
图2 不同类型饮用水的门水平群落结构分布
Fig.2 Community structure distribution of bacteria at phylum level in different types of drinking water
由图2 可知，按相对丰度大于0.1%的原则，门水平上共筛选出8 个优势菌门。所有水样均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）为主，这4种门水平的相对丰度比例约占96.72%～99.18%，说明在门水平上，Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes 和Actinobacteria 为自备井水、楼宇水箱水和管网末梢水的优势菌群。已有研究表明，这些菌门广泛存在于各类水源中，与本研究结果一致。张紫薇等[20]研究发现Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes 是岗南水库的主要优势菌门。林凯宗等[21]研究表明Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria 和疣微菌门（Verrucomicrobia）是北京、黑龙江等五省自备井水的优势菌门。此外，Proteobacteria、Actinobacteria 和Firmicutes 也是水体沉积物的主要菌门，在有机物降解、碳循环以及水生态系统的循环过程中起着重要的作用[22]。本研究中自备井水、楼宇水箱水和管网末梢水的优势微生物菌门是Proteobacteria，但在自备井水中Firmicutes 的相对丰度达到8.95%～39.12%，成为第二大优势微生物种群。这主要是由于Firmicutes 与人类活动密切相关[23]，而自备井水又受人类活动扰动较大，因此Firmicutes的占比较高。
在属水平上，不同类型饮用水的群落结构分布如图3所示。
图3 不同类型饮用水的属水平群落结构分布
Fig.3 Community structure distribution of bacteria at genus level in different types of drinking water
由图3 可知，3 种类型饮用水的细菌覆盖242 个属，其中相对丰度大于1%的包括13 个属，3 种类型饮用水的细菌群落组成存在一定的差异性，但优势菌属均为嗜盐单胞菌属（Halomonas）、远洋杆菌属（Pelagibacterium）、大肠埃希氏-志贺菌属（Escherichia-Shigella）和涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）。其中楼宇水箱水和管网末梢水具有相似的群落结构组成，这与它们来自于相同的市政供水管网有关，楼宇水箱水由于供水前会先在蓄水池中进行贮藏再进行输送，易造成二次污染，从而导致在水质、细菌物种丰富度上与管网末梢水不同，但这并不会改变水中细菌群落的组成。就占主导的细菌种类而言，Halomonas、Pelagibacterium和Nesterenkonia 在3 种水样的平均相对丰度顺序均为楼宇水箱水>管网末梢水>自备井水。Escherichia-Shigella 在3 种水样的平均相对丰度顺序为自备井水>管网末梢水>楼宇水箱水。其中Halomonas 可以同时进行硝化和反硝化作用，具有一定的脱氮能力[24-25]，Pelagibacterium 与氟化物有关，可以作为氟化物和氟中毒的标志微生物[26]。Nesterenkonia 在高盐碱环境中被发现，且为优势放线细菌类群[27]。Halomonas、Pelagibacterium 和Nesterenkonia 的平均相对丰度均在楼宇水箱水中最高，管网末梢水次之，其原因可能与水箱的环境选择作用有关，造成优势微生物的富集[28]，同时有研究表明Halomonas 可能是来自饮用水储存和运输过程中的污染，因此其在楼宇水箱水和管网末梢水中丰度较高[29]。Escherichia-Shigella 是细菌性痢疾的病原体[30]，易造成饮用水微生物安全风险，其序列与大肠杆菌高度相似，是检测动物粪便污染的指标之一[31]。该菌属在自备井水的检出率相对较高，其原因可能是自备井水相较于楼宇水箱水和管网末梢水更易受人和动物粪便的污染。Escherichia-Shigella 的检出可能会对人类健康造成威胁，因此，需要加强自备井水的净化和消毒。
2.2.4 功能基因代谢通路分析
通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）对3 种类型饮用水基因序列进行微生物代谢功能分析，其各功能基因相对丰度如图4所示。
图4 KEGG 代谢通路功能分类图
Fig.4 KEGG function classifications of metabolism pathways
由图4 可知，在一级分类上，3 种类型饮用水的所有功能基因序列可以分为7 类，其中，新陈代谢功能模块相关的功能基因相对丰度较高且数量较多。其次是遗传信息加工、未分类、环境信息加工和细胞过程。人类疾病和生物体系统模块相关的功能基因相对丰度较低。
二级分类的功能主要集中在膜运输、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、复制和修复、能量代谢这5 种途径，这与之前的研究结果相似[32]。同时，在本研究中，基于KEGG 数据库预测的3 种类型饮用水不同代谢途径的丰度值均差距不大，表明饮用水细菌群落的代谢水平具有趋同性。这是由于代谢途径通常涉及酶催化、代谢产物合成等生物化学反应[33]，这些反应的发生不依赖于饮用水的种类，而受到更复杂因素的影响。因此，不同类型的饮用水对代谢途径的影响较小，3 种类型饮用水表现为趋同性。此外，从3 种类型饮用水中共发现6 种与人类疾病相关的途径，即传染性疾病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、免疫系统疾病和代谢性疾病，这些疾病均会导致人体健康出现问题。因此，需要关注饮用水可能带来的传染风险，加强饮用水安全的监管。
3 结论
自备井水中检测出菌落总数且超过饮用水卫生标准限值，同时还检测出总大肠菌群和大肠埃希氏菌，表明应对自备井进行定期的净化消毒和设施养护；管网末梢水中Cu2+超标，可能存在输配水设施材质老化的问题，因此需要及时进行维护与更换。自备井水的微生物群落多样性最高、组间相似度最低，楼宇水箱水微生物多样性最低、组间相似度最高，且两者间细菌群落存在差异。Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidota和Actinobacteria 为管网末梢水、楼宇水箱水和自备井水的优势菌门。Halomonas、Pelagibacterium 和Nesterenkonia 的平均相对丰度均在楼宇水箱水中最高，可能是来自饮用水储存和运输过程中的污染，致病菌Escherichia-Shigella 在自备井水中的检出率相对较高，该菌主要来源于人和动物粪便的污染，说明自备井易受人类活动的污染，需要加强自备井水的净化和消毒。3 种类型饮用水的水质和微生物群落存在一定差异，但自备井水更易受到外界环境以及人类活动等因素的影响。通过微生物代谢功能分析可知，3 种类型饮用水中均发现少量与人类疾病相关的代谢途径，这些疾病均会导致人体健康出现问题，因此，需加强饮用水安全的监管。
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