多糖是指由10 个或10 个以上的单糖通过糖苷键连接而成的大分子物质，广泛存在于动植物和微生物中[1]，可分为动物多糖、植物多糖或真菌多糖[2]。大量研究发现，多糖具有抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗凝血[5]、调节肠道菌群等生物活性功能。不同提取方法、样品来源均会影响多糖的生物活性和结构特征[6]。常用的多糖提取方法有水提法、酶解辅助提取法、超声波辅助提取法、酸碱浸提法和微波辅助提取法等。
淡竹叶（Lophatherum gracile Brongn.）是多年生草本植物的茎叶，是一种药食同源的食材，属被子植物门、单子叶植物纲、禾本科、淡竹叶属，通常生长在山坡下阴湿处，广泛分布在我国长江以南地区[7]。淡竹叶别名有碎骨子、山鸡米、迷身草和竹叶卷心等。对淡竹叶的记载首次出现在《滇南本草》，《本草纲目》首次记录了淡竹叶的形态特征。淡竹叶性味甘淡，可作药用，具有清热止渴、利尿通淋的功效，通常应用于热病烦渴、小便短赤涩痛、痛头风、吐血等病症的治疗，民间大多使用淡竹叶茎叶制作凉茶来饮用。淡竹叶也可直接食用，可与粥一起煮食或者将淡竹叶煮水饮用。淡竹叶中含有大量的黄酮类、多糖类、氨基酸、叶绿素、微量元素等成分，使淡竹叶具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤等作用[8-10]。
研究者对淡竹叶的研究大部分集中在淡竹叶的化学成分分析和营养价值方面，而对淡竹叶多糖热稳定性和抗氧化活性的研究鲜有研究。由于水提法具有操作简单、成本较低和不会对多糖结构造成破坏的优点，本研究选用水提法来提取淡竹叶多糖，并通过单因素试验和响应面法对提取工艺条件进行优化，分离纯化后得到一种新型的淡竹叶多糖（Lophatherum gracile Brongn.polysaccharide，LGP），分析其热稳定性和抗氧化活性，为淡竹叶多糖的实际生产应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
淡竹叶：市售；三氯甲烷、三氟乙酸、无水乙醇、正丁醇、甲醇：江天化工技术股份有限公司；T 系列葡聚糖：北京索莱宝科技有限公司；间羟基联苯、考马斯亮蓝-G250、牛血清蛋白：北京索莱宝科技有限公司；葡聚糖凝胶Sephadex G-200：上海源叶生物科技有限公司；单糖标品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸等）：美国Sigma 公司；所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DZF-6020 型电热恒温鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；SE-750 型高速粉碎机：浙江永康市圣象电器有限公司；TDZ5-WS 型低速离心机：长沙湘仪仪器有限公司；FD-1A-50 型冷冻干燥机：上海比朗仪器制造有限公司；RE-52A 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；1200 型高效液相色谱（high performance liquid chromatograph，HPLC）仪：安捷伦科技有限公司；UV-2550PC 型紫外可见光分光光度计、60Plus 型差示扫描量热仪：日本岛津公司；HGC-12A 型氮吹仪：天津市恒奥科技发展有限公司；ICS-5000 型离子色谱仪：戴安中国有限公司；TGA-Q500 型热重分析仪：美国TA 公司；Synergy HTX 型多功能酶标仪：美国博腾公司。
1.3 淡竹叶多糖的提取工艺优化
1.3.1 淡竹叶的预处理
将淡竹叶放入烘箱进行干燥，粉碎成粉末状后用80 目筛网过滤，淡竹叶粉末在索氏抽提装置中使用石油醚进行脱脂处理，之后在60 ℃鼓风干燥箱中进行干燥，时间为72 h[11]。
1.3.2 淡竹叶粗多糖的提取工艺流程
处理后的淡竹叶脱脂粉末与蒸馏水按照一定的液料比在100 ℃条件下多次萃取，冷却至室温后进行离心（4 000 r/min 离心15 min）、过滤，将上清液合并，用旋转蒸发仪将其体积浓缩至原来的1/4 后与无水乙醇按照比例进行混合，放入4 ℃冰箱过夜，第2 天对混合液进行离心处理，小心倒掉上清液，获得的醇沉沉淀物即为淡竹叶粗多糖[12]。粗多糖得率（D，%）按照下面的公式进行计算。
式中：M1 为淡竹叶粗多糖质量，g；M2 为淡竹叶粉末样品质量，g。
1.3.3 单因素试验
提取温度定为100 ℃，考察液料比、提取时间、提取次数和醇沉浓度4 个因素对淡竹叶粗多糖得率的影响。
1）液料比分别设定为10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g），浸提2 h，提取次数为2，醇沉浓度为60%。
2）提取时间分别设定为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，液料比为30 ∶1（mL/g），提取次数为2，醇沉浓度为60%。
3）提取次数分别设定为1、2、3、4、5，浸提2 h，液料比为30 ∶1（mL/g），醇沉浓度为60%。
4）醇沉浓度分别设定为40%、50%、60%、70%、80%，液料比为30 ∶1（mL/g），浸提2 h，提取次数为2。
1.3.4 响应面因素水平设计
根据Box-Behnken 原理，选取液料比、提取时间和醇沉浓度为自变量，淡竹叶粗多糖得率（Y）为响应值，做三因素三水平响应面设计，优化淡竹叶粗多糖的提取工艺。响应面因素水平设计见表1。
表1 响应面因素水平设计
Table 1 Factors and levels of response surface design
水平因素A 液料比/（mL/g） B 提取时间/h C 醇沉浓度/%-110∶11.050 0 30∶12.060 1 50∶13.070
1.4 淡竹叶多糖的分离纯化
1.4.1 淡竹叶粗多糖的分子量分布
准确称取淡竹叶粗多糖2 mg，溶于2 mL 超纯水中，使用漩涡混匀仪将粗多糖充分溶解，过0.22 μm 滤膜，使用高效液相色谱仪对淡竹叶粗多糖的分子量分布进行检测分析。检测条件：选用RID 检测器，设置检测器的温度为35 ℃，柱温设定为30 ℃，进样量为20 μL（1 mg/mL），流动相使用超纯水，流速设置为0.6mL/min。
1.4.2 淡竹叶多糖的纯化
将淡竹叶粗多糖溶液去除酒精后，用蒸馏水复溶，通过离心（8 000 r/min，10 min）去除杂质。然后用sevag法[正丁醇∶三氯甲烷=4 ∶1（体积比）]去除粗多糖中的蛋白质[13]，除去蛋白质后使用旋转蒸发仪去除sevag 试剂，之后用蒸馏水在4 ℃条件下透析3 d（截留相对分子量为10 000 Da）。用冷冻干燥机进行干燥收集多糖，收集后的多糖用蒸馏水配制成20 mg/mL 的多糖溶液，过膜后用Sephadex G-200 凝胶柱（1.6 cm×40 cm）进一步纯化多糖，收集洗脱曲线最高峰的那一管，冷却干燥后得到淡竹叶多糖，命名为LGP。
1.4.3 淡竹叶多糖（LGP）的纯度鉴定
1.4.3.1 基本成分测定
以D-葡萄糖作为标品，采用苯酚-硫酸法测定淡竹叶粗多糖和LGP 的总糖含量[14]；还原糖含量测定采用3，5-二硝基水杨酸法[15]；以半乳糖醛酸为标品，多糖中糖醛酸含量的测定采用间羟基连苯法[16]；以牛血清蛋白为标品，用考马斯亮蓝法测定多糖中的蛋白质含量[17]。
1.4.3.2 LGP 的分子量测定
LGP 的相对分子量使用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法测定。将1 mg 的淡竹叶多糖样品溶于1 mL 的超纯水中，使用漩涡混匀仪涡旋后过0.22 μm 滤膜，使用高效液相色谱仪检测。将T 系列（T-3、T-10、T-70、T-100、T-300、T-500、T-2000）葡聚糖标准品配制成1 mg/mL的溶液，根据其分子量和保留时间绘制标准曲线，将测得的LGP 的保留时间代入标准曲线计算得到LGP的相对分子量[18]。
1.4.3.3 LGP 的紫外全波段扫描
准确称取1 mg 的LGP，溶于10 mL 蒸馏水中，配制成浓度为0.1 mg/mL 的淡竹叶多糖溶液，空白对照组选用蒸馏水，使用紫外分光光度计进行检测，选取的波长范围为200～400 nm。
1.5 淡竹叶多糖的单糖组成测定
1.5.1 多糖降解
称取5 mg 的LGP，将其溶于1 mL 的三氟乙酸（2 mol/L）中，混匀后在油浴锅（110 ℃）中油浴3 h，反应结束后在室温条件下自然冷却，使用氮气将溶液吹干。为了除去多糖溶液中残留的三氟乙酸，需要加入0.5 mL 甲醇后再使用氮吹仪吹干，反复3 次直至完全除净。
1.5.2 检测单糖组成
单糖组成通过离子色谱法（ion chromatography，IC）来测定，参考文献[19]的方法对检测结果进行分析。使用超纯水将完全溶解后的多糖溶液稀释成浓度为0.1 mg/mL 的溶液。准确称取岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸10 种单糖标品各1 mg，使用超纯水将其配制成浓度为0.05 mg/mL 的单糖标品混合溶液。制备得到的多糖溶液与单糖标品分别使用0.22 μm 滤膜和RP-10 柱处理后，采用离子色谱仪检测。
1.6 淡竹叶多糖热稳定性的测定
1.6.1 LGP 的差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）测定
精准称取4 mg 的LGP 样品，用压片机处理后放入样品池中，使用差示扫描量热分析仪在25～200 ℃范围进行检测，升温速率为10 ℃/min。
1.6.2 LGP 的热重（thermogravimetric analyzer，TGA）测定
称取LGP 样品5 mg，将其放入托盘中，托盘边缘不能有余留，使用热重分析仪测定LGP 的热稳定性。测定条件如下：通入的气体为氮气，设置仪器温度范围为25～600 ℃，升温速率为20 ℃/min。
1.7 淡竹叶多糖的抗氧化活性测定
准确称取淡竹叶纯多糖100 mg，使用10 mL 蒸馏水将其溶解，得到10 mg/mL 的淡竹叶多糖溶液，之后分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、3.2、6.4、8.0 mg/mL的淡竹叶多糖溶液。选用VC 作为阳性对照。
1.7.1 LGP 对DPPH·的清除能力
参考文献[20]的方法，向试管中分别加入1 mL 不同浓度的淡竹叶多糖溶液，再加入5 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/L），充分混合后在避光条件下反应30 min，设置酶标仪参数，检测其在517 nm 处的吸光度。按照式（2）计算DPPH 自由基的清除率（RDPPH，%）。
式中：Ai 为样品+DPPH 溶液的吸光度；Aj 为样品+蒸馏水的吸光度；A0 为蒸馏水+DPPH 的吸光度。
1.7.2 LGP 对·OH 的清除能力
取8 支干净的10 mL 试管，向其中添加不同浓度的LGP 溶液（1 mL），再依次加入等体积的FeSO4（6 mmol/L）、水杨酸-乙醇溶液（6 mmol/L）和H2O2 溶液（6 mmol/L），混合均匀后在37 ℃恒温水浴中反应30 min，使用酶标仪检测其在510 nm 处的吸光度[21]。按照式（3）计算·OH 的清除率（ROH，%）。
式中：Ai 为加入样品溶液的吸光度；Aj 为将H2O2替换成去离子水的吸光度；A0 为将样品替换成去离子水的吸光度。
1.7.3 LGP 的ABTS+自由基的清除能力
将7 mmol/L 的ABTS 溶液与2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液等体积混合，避光反应24 h，向混合液中加入无水乙醇，将其吸光度调节至0.70±0.02，得到ABTS 工作液。分别加入不同浓度的LGP 溶液（0.4 mL），然后加入4 mL 的ABTS 工作液，反应5 min，测量其在734 nm处的吸光度[22]。按照式（4）计算ABTS＋自由基清除率（RABTS+，%）。
式中：Ai 为样品+ABTS 工作液的吸光度；Aj 为样品+蒸馏水的吸光度；A0 为蒸馏水+ABTS 工作液的吸光度。
1.7.4 LGP 的还原力测定
向试管中加入不同浓度的LGP 溶液（0.5 mL）和2.5 mL 的磷酸冲液缓（0.2 mol/L，pH6.6），最后加入2.5 mL 的铁氰化钾溶液（1%），50 ℃恒温水浴20 min，室温静置反应10 min，再加入三氯乙酸（2.5 mL，10%），将混合物离心（3 000 r/min，10 min）以获得上层。取2.5 mL 的上层溶液，向其中加入蒸馏水（2.5 mL）和0.1%氯化铁（0.5 mL），反应10 min，选择酶标仪测定其在700 nm 处的吸光度[23]。按照式（5）计算LGP 的还原能力（ΔA）。
式中：A 为样品组的吸光度；A0 为VC 组的吸光度。
1.8 数据分析
试验重复3 次以上，数据用平均值±标准差表示。使用SPSS 26.0 软件对数据进行分析；统计学显著性选择单因素方差分析（ANOVA）说明；使用Origin 2018 软件处理图表。P<0.05 表明具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 不同液料比对淡竹叶粗多糖得率的影响
在多糖提取过程中，如果提取液所占比例太小可能会造成多糖不能被完全提取，而且对原料中的活性成分也会造成一定的损失；但若提取液所占比例过多，又会造成不必要的浪费，增加生产成本。液料比对粗多糖得率的影响见图1。
图1 液料比对粗多糖得率的影响
Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of crude polysaccharide
由图1 可知，本研究选取的液料比范围为10 ∶1～50 ∶1（mL/g）。当液料比在10 ∶1～30 ∶1（mL/g）内时，淡竹叶粗多糖的得率增加效果明显，这可能是因为液料比数值小于30 ∶1（mL/g）时，淡竹叶内外渗透压随液料比的增加而增加，使多糖向提取液的方向释放[24]。而当液料比大于30 ∶1（mL/g）时，淡竹叶粗多糖的得率增长缓慢，但是一直处于增长状态，这可能是因为不断增加溶剂体积，会使淡竹叶中的多糖不断溶出，直至趋于平衡[25]。因此，出于节约能源和成本的考虑，选择液料比为10 ∶1、30 ∶1、50 ∶1（mL/g）进行响应面分析。
2.1.2 不同提取时间对淡竹叶粗多糖得率的影响
提取时间对粗多糖得率的影响见图2。
图2 提取时间对粗多糖得率的影响
Fig.2 Effect of extraction time on the yield of crude polysaccharide
如图2所示，随着提取时间从0.5 h 延长到2.0 h，淡竹叶多糖的得率从（2.52±0.09）%增加至（4.72±0.14）%，继续延长提取时间，多糖得率有所降低。这可能是因为绝大部分多糖在2.0 h 内被提取出来，而2.0 h后粗多糖的得率降低，原因可能是由于多糖的结构在持续的高温作用下遭到破坏导致的[26]。因此，选择提取时间1.0、2.0 h 和3.0 h 进行后续的响应面分析。
2.1.3 不同提取次数对淡竹叶粗多糖得率的影响
提取次数对粗多糖得率的影响见图3。
图3 提取次数对粗多糖得率的影响
Fig.3 Effect of extraction times on the yield of crude polysaccharide
由图3 可知，在选定的范围内（1～5 次）淡竹叶粗多糖的得率随着提取次数的增加而显著增加，而当提取次数为3 时，淡竹叶粗多糖的得率为（4.73±0.11）%，继续增加提取次数，多糖得率变化不明显，趋于平缓。这可能是由于淡竹叶中的多糖已大部分溶解，再增加提取次数不仅对多糖的得率无明显影响[27]，还可能会使多糖的结构发生改变，同时也会使其它杂质溶出[28]。因此，从节约能源的角度来看，确定提取3 次为最佳提取次数。
2.1.4 不同醇沉浓度对淡竹叶粗多糖得率的影响
醇沉浓度对粗多糖得率的影响见图4。
图4 醇沉浓度对粗多糖得率的影响
Fig.4 Effect of ethanol concentration for precipitation on the yield of crude polysaccharide
由图4 可知，当醇沉浓度小于60%时，淡竹叶粗多糖的得率随醇沉浓度的增加而显著增加。当醇沉浓度为60%时，淡竹叶粗多糖的得率为（4.53±0.10）%，继续增大醇沉浓度，多糖得率增长较少。因此，从考虑成本和节约能源来看，选择醇沉浓度为50%、60%和70%进行后续响应面优化试验。
2.2 响应面试验
利用Design Expert 10.0.7 软件，参照Box-Behnken Design 原理，选择液料比（A）、提取时间（B）、醇沉浓度（C）为自变量，响应面试验设计与结果见表2。方差分析结果见表3。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface experiments
试验号A 液料比/（mL/g）粗多糖得率/%1 10∶11.0602.20 250∶11.0603.35 3 10∶13.0603.09 4 50∶13.0603.20 5 10∶12.0501.60 6 50∶12.0503.20 7 10∶12.0702.56 8 50∶12.0702.70 9 30∶11.0502.60 1030∶13.0502.56 1130∶11.0702.67 1230∶13.0704.10 1330∶12.0604.65 1430∶12.0604.25 1530∶12.0604.89 1630∶12.0604.76 1730∶12.0604.58 B 提取时间/h C 醇沉浓度/%
表3 方差分析结果
Table 3 Results of analysis of variance
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
来源平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型15.6591.7425.43 0.000 2**A1.1311.1316.45 0.004 8**B0.5710.578.290.023 7*C0.5410.547.830.026 6*AB0.2710.273.950.087 1 AC0.5310.537.790.026 8*BC0.5410.547.900.026 1*A24.7914.7970.07 <0.000 1**B21.5111.5122.11 0.002 2**C24.5914.5967.15 <0.000 1**残差0.4870.068失拟项0.2530.0821.420.360 4净误差0.2340.058合计16.1316
结果表明，各自变量之间存在的二次多项式关系为Y=4.626+0.375A+0.266B+0.259C-0.26AB-0.365AC+0.368BC-1.067A2-0.599B2-1.044C2。
如表3所示，失拟项的F 值和P 值分别为1.42 和0.360 4，这表明该模型拟合不显著。模型的R2Adj 为0.932，说明该模型可以解释大部分（93.2%）的变化，表明所建立的多项式模型方程具有普遍有效性和准确性。方差分析的结果表明，淡竹叶粗多糖得率的二次多项式模型是极显著的，除液料比和提取时间的交互作用对淡竹叶多糖得率的影响不显著外，其余各因素对粗多糖得率影响均显著。通过F 值的大小可知，液料比对淡竹叶粗多糖得率的影响最显著，其次是提取时间，最后是醇沉浓度。
各因素相互作用及对粗多糖得率响应面3D 图和等高线图见图5。
图5 液料比、提取时间、醇沉浓度相互作用及对淡竹叶粗多糖得率的响应面3D 图和等高线图
Fig.5 Three-dimensional response surface plots and contour plots of interactions between liquid-to-solid ratio，extraction time，and ethanol concentration for precipitation on the yield of crude polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
由图5 可知，液料比和提取时间的3D 图坡度最平缓，说明液料比和提取时间的交互作用对淡竹叶粗多糖得率的影响较弱，这一结果与表3 的结果相一致。淡竹叶多糖的最优提取工艺条件为液料比32.44 ∶1（mL/g），提取时间2.24 h，醇沉浓度为61.44%，预测淡竹叶粗多糖的得率为4.67%。充分考虑到实际工业生产的需要，将得到的最优条件进行修改，最终选取液料比30 ∶1（mL/g），提取时间2 h，醇沉浓度60%，在此条件下进行重复3 次，淡竹叶粗多糖得率为（4.54±0.26）%，其与预测值之间的相对误差为0.13%<5%，说明模型建立成功且修正后的提取条件具备较高的可行性。
2.3 淡竹叶粗多糖的分子量分布
淡竹叶粗多糖的高效液相色谱图和洗脱曲线见图6。
图6 淡竹叶粗多糖的高效液相色谱图和洗脱曲线
Fig.6 High performance liquid chromatogram and elution curve of the crude polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
a.高效液相色谱图；b.洗脱曲线。
由图6 可知，淡竹叶粗多糖有一个明显的峰，出峰时间为9.210 min，其它两个峰较小，出峰时间分别为11.348 min 和13.422 min。由于第一个组分组分占比较大，因此选择分离第一个组分。从图中可见，有2 个明显的独立洗脱峰，还有一个洗脱峰不是很明显，分析比较通过高效液相色谱仪得到的分子量大小，可以确认第一个洗脱峰应该就是需要分离的组分，收集该组分，通过真空冷冻干燥机冻干得到淡竹叶纯多糖，命名为LGP。
2.4 LGP 的纯度鉴定
2.4.1 淡竹叶多糖的成分及含量分析
LGP 基本化学成分见表4。
表4 LGP 基本化学成分
Table 4 Basic chemical components of LGP %
注：-表示未检出。
基本化学成分 总糖含量 蛋白质含量糖醛酸含量 还原糖含量淡竹叶粗多糖 50.66±0.51 20.57±0.33 5.75±0.52-LGP93.40±0.96 1.71±0.645.50±0.78-
由表4 可得，经过分离纯化后LGP 的总糖含量为（93.40±0.96）%，蛋白质含量为（1.71±0.64）%，糖醛酸含量为（5.50±0.78）%，且不含有还原糖。综上所述，LGP是一种纯度较高，蛋白质含量较少的中性多糖。
2.4.2 淡竹叶多糖的相对分子量分析
淡竹叶叶纯化多糖的高效液相色谱图见图7。
图7 淡竹叶叶纯化多糖的高效液相色谱图
Fig.7 High performance liquid chromatogram of the purified polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
如图7所示，色谱图中出现了一个狭窄的对称峰，这表明LGP 的相对分子量分布均匀。根据保留时间（7.562 min）计算得LGP 的相对分子量为2.32×106 Da。
2.4.3 淡竹叶多糖的紫外全波长扫描结果分析
淡竹叶多糖的紫外可见光扫描谱图见图8。
图8 淡竹叶多糖的紫外可见光扫描谱图
Fig.8 UV-Vis scanning spectrum of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
如图8所示，淡竹叶多糖在260 nm 和280 nm 处有较弱的紫外可见吸收峰，这意味着淡竹叶多糖可能含有少量核酸和蛋白质，这与2.4.1 的化学分析结果一致。
2.5 LGP 的单糖组成分析
使用离子色谱仪对LGP 的单糖组成进行检测，与标品对照分析。标准品和LGP 的完全水解产物的保留时间如图9所示。
图9 离子色谱图
Fig.9 Ion chromatograms
1.岩藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.半乳糖；5.葡萄糖；6.木糖；7.甘露糖；8.核糖；9.半乳糖醛酸；10.葡萄糖醛酸。a.单糖标品混合液；b.淡竹叶多糖。
图9 表明，淡竹叶多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成，其中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖含量相对较高，其余的单糖和糖醛酸含量较少。计算得出LGP 中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为0.115 ∶2.453 ∶3.176 ∶0.780 ∶1.000 ∶0.430 ∶0.239 ∶0.018。根据LGP 的离子色谱图可知LGP 含有少量糖醛酸，这与间羟基联苯法的结论一致。
2.6 淡竹叶多糖热稳定性分析
2.6.1 LGP 的差示扫描量热（DSC）分析
LGP 的DSC 分析见图10。
图10 LGP 的DSC 分析
Fig.10 Differential scanning calorimetry of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
由图10 可知，LGP 在76.4 ℃出现一个吸热峰，这个过程主要是由于固态构型的崩解与突变造成的。在之后的升温过程中多糖没有出现放热峰，这表明淡竹叶多糖有较好的热稳定性[29]。
2.6.2 LGP 的热重（TGA）测定
LGP 的TGA 分析见图11。
图11 LGP 的TGA 分析
Fig.11 Thermogravimetry analysis of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
由图11 可得，LGP 的TGA 分解过程大致可分为3 个阶段。第一阶段在50 ℃左右，失重率为13.66%，这一阶段是淡竹叶多糖样品失去由于物理作用吸附在多糖上的水分，这表明LGP 上会吸附着少量水分。第二阶段，温度变化范围为200～400 ℃，此阶段失重最为明显，失重率达到了65.02%，淡竹叶多糖在该温度范围内发生了剧烈的分解，从而使淡竹叶多糖样品重量显著降低。第三阶段，温度变化范围是450～600 ℃，此阶段样品的重量变化趋于平缓，为缓慢碳化阶段，大部分样品在此阶段内分解为灰分和无机成分。综上所述，LGP 在200 ℃内具有良好的热稳定性，这与DSC结果相一致。
2.7 淡竹叶多糖的抗氧化活性测定
2.7.1 LGP 对DPPH·的清除能力
淡竹叶多糖对DPPH 自由基清除能力试验结果见图12。
图12 淡竹叶多糖对DPPH 自由基清除能力
Fig.12 DPPH radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
由图12 可知，淡竹叶多糖在0～8 mg/mL 浓度范围内具有一定的DPPH·的清除能力[30]。VC 和淡竹叶多糖浓度为8 mg/mL 时清除作用最强，清除率分别为96.5%、50.0%。经计算，LGP 和VC 的IC50 值分别为8.710 mg/mL和1.148 mg/mL，这说明LGP 具有一定的DPPH·清除能力，但效果远弱于VC。LGP 的DPPH·清除能力与其分子量和单糖组成有关[31-32]。Lo 等[33]发现，阿拉伯糖与葡萄糖的比例越高，香菇多糖的抗氧化能力越低。因此，半乳糖和阿拉伯糖是影响LGP 清除DPPH 自由基的关键因素。由于LGP 是一种大分子多糖，而且LGP的半乳糖含量与阿拉伯糖和葡萄糖的比例较高，所以其DPPH·清除能力较弱。
2.7.2 LGP 对·OH 的清除能力
生命体中最具氧化性能的自由基为·OH，若不快速及时清除，会破坏机体的腑脏器官[34]。淡竹叶多糖对·OH 的清除能力见图13。
图13 淡竹叶多糖对·OH 的清除能力
Fig.13 OH radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
由图13 可知，淡竹叶多糖的羟基自由基清除能力与浓度呈正相关。VC 和淡竹叶多糖浓度为8 mg/mL时清除作用最强，清除率分别为99.6%、64.4%，计算得到LGP 和VC 的IC50 值分别为3.947 mg/mL 和0.305 mg/mL，这说明LGP 具有较好的·OH 的清除能力。LGP 对·OH 的清除能力较强与其单糖组成中木糖的含量较高有关[35]。
2.7.3 LGP 的ABTS＋自由基的清除能力
淡竹叶多糖对ABTS＋自由基清除能力见图14。
图14 淡竹叶多糖对ABTS＋自由基清除能力
Fig.14 ABTS＋radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
由图14 可知，淡竹叶多糖具有良好的ABTS＋自由基清除能力。当浓度增加到8.0 mg/mL 时，清除率达到74.8%，接近于VC。经计算，LGP 和VC 的IC50 值分别为1.134 mg/mL 和0.068 mg/mL，由此可见，淡竹叶多糖对ABTS＋由由基具有较强的清除作用，这一般与LGP 中的半乳糖含量较高有关[36]。Sharma 等[37]将部分纯化后的辣木叶多糖与其粗提取物进行了比较，结果表明由于纯化后的辣木多糖具有较高的半乳糖含量（38.08%），所以纯化后的辣木多糖具有较好的ABTS+·清除能力。
2.7.4 LGP 的还原力测定
多糖分子中存在的苷羟基可在一定条件下可以异变为羰基结构，因而具有还原性。吸光度反映物质的还原能力，吸光度越大，待测物质的还原能力越强[38]。淡竹叶多糖的还原能力见图15。
图15 淡竹叶多糖的还原能力
Fig.15 Reducing ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.
由图15 可知，在选定的浓度范围内淡竹叶多糖具有一定的还原能力，但始终弱于同等质量浓度下VC 的还原能力。淡竹叶多糖的还原能力随多糖浓度的增加而增强，当浓度增加到8.0 mg/mL 时，还原力达到0.574。Wang 等[39]发现糖醛酸中的COOH 和Fe2+之间形成的跨桥是多糖具有Fe2+螯合能力的原因。Zhang 等[40]发现糖醛酸含量与还原能力呈正相关。由于LGP 的糖醛酸含量较低，所以其还原能力也较弱。
3 结论
本研究通过单因素试验和响应面相结合的方法得到了淡竹叶多糖的最优提取工艺条件为液料比30 ∶1（mL/g），提取时间2 h，醇沉浓度60%，在上述提取工艺条件下，淡竹叶粗多糖的得率（4.54±0.26）%。分离纯化后的淡竹叶多糖LGP 经测定可得其总糖、蛋白质和糖醛酸含量分别为（93.40±0.96）%、（1.71±0.64）%、（5.50±0.78）%，平均相对分子量为2.32×106 Da。LGP 主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为0.115 ∶2.453 ∶3.176 ∶0.780 ∶1.000 ∶0.430 ∶0.239 ∶0.018。利用DSC 和TGA 对淡竹叶多糖的热稳定性进行探究，结果证实LGP 在200 ℃以内具有良好的热稳定性。
对淡竹叶多糖LGP 进行了抗氧化活性试验，结果表明淡竹叶多糖对DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS+自由基均具有一定的清除能力，且清除能力大小顺序为ABTS+自由基>羟基自由基>DPPH 自由基，由此可得淡竹叶多糖是一种潜在的天然抗氧化剂，可应用于食品、药品等领域。通过总还原力测定结果可得其还具有一定的还原能力。本研究所得的淡竹叶多糖是一种得率较高、相对分子量较大且具有良好热稳定性的多糖，可作为一种新型的天然抗氧化剂，本研究也为淡竹叶多糖的生产应用提供了理论支持。
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