骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量降低及骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加的代谢性骨病[1]，基本发病机制是成骨细胞与破骨细胞的功能失衡，骨吸收远大于骨形成，导致骨量丢失。近年来随着人均寿命的延长以及老龄人口的增加，骨质疏松的发病率也日益增高。传统中医理论认为骨质疏松，以肾虚为主，血瘀为害，互为因果，血瘀是骨质疏松症的促进因素，若气血两虚，则影响骨的营养及骨代谢[2]，且现代研究也证实微血管改变是瘀血证的病理基础，瘀血是引起骨质疏松性骨痛的重要机制之一。
丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎，性味苦，微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀，通经止痛的功效[3]，目前国内外关于丹参的辅助降血脂、提高耐缺氧、对化学性肝损伤有辅助保护和抗氧化等功能研究较多，而对其增加骨密度方面的功效研究较少。丹参作为活血化瘀的中药，能改善微循环，目前已有网络药理学研究表明丹参可通过多条通路直接或间接参与细胞分化和凋亡、氧化应激、炎症反应等影响骨代谢[4-5]，在传统的中医药实践方面，中药材通常采用水提煎煮的方式进行，丹参的水溶性成分具有强抗氧化性，可起到预防动脉粥样硬化[6]、保护心血管[7]等作用，成为丹参提取物研究的主要热点之一。近年来，研究发现丹参水溶性成分可通过促进成骨细胞增殖、分化和表达[8-9]、促进骨胶原合成[10]、促进骨钙素生成[11]来促进骨形成，亦可通过抑制抗酒石酸酸性磷酸酶活性[12]、抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路[13]、抑制肿瘤坏死因子-α 的表达[14]来抑制骨吸收[15]，还能通过调节骨髓微循环[16]、调节脂质代谢[17]等调节骨代谢。前期已有学者采用去卵巢模型研究丹参水提物对牙槽骨的影响[18-19]，取得了积极的结果。本研究以丹参水提物为研究对象，采用去卵巢大鼠为模型，通过观察股骨质量、股骨及胫骨骨小梁形态学变化，探讨丹参提取物对骨代谢的影响，以期为丹参用于开发增加骨密度的功能性食品提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
基础饲料、实验大鼠：斯贝福（北京）生物技术有限公司[许可证号为SCXK（京）2016-0002]；水合氯醛（>99%）：上海麦克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙液、β-雌二醇：北京索莱宝生物科技有限公司；青霉素：华北制药厂；丹参：市售。
FA2004 型分析天平：METTLER TOLEDO 公司；TDL-8002 恒温水浴锅：天津市中环实验电炉有限公司；SX-2-8-12 马弗炉：沈阳长白电炉厂；Olympus CKX41显微镜：日本奥林巴斯株式会。
1.2 提取物制备
丹参提取物制备方法：称取丹参（符合2020 版《中华人民共和国药典》一部标准），采用水提方式提取，工艺为料液比1 ∶8（kg/L），提取3 次，过滤，合并提取液，浓缩，干燥制得丹参提取物，每克丹参提取物相当于丹参生药2.86 g。
1.3 实验动物的选择
实验选用健康雌性3月龄SPF 级SD 大鼠，体质量250～300 g，饲养于天津科技大学实验动物中心。饲养环境：（23±3）℃，相对湿度55%～75%，12 h 明暗循环。大鼠被放置在白色塑料笼中，每笼4 只，每组2 笼。实验期间为动物提供充足的食物和水。本研究的所有实验程序均按照天津科技大学动物实验伦理委员会批准的方案进行。
1.4 分组与模型的建立
将SD 大鼠随机分为6 组，每组8 只，分别为假手术组（sham operation，SHA）、模型组（model，MOD）、丹参提取物低剂量组（Salvia miltiorrhiza extract low-dose，SL）、丹参提取物中剂量组（Salvia miltiorrhiza extract medium-dose，SM）、丹参提取物高剂量组（Salvia miltiorrhiza extract high-dose，SH）、雌激素组（estrogen，E2）。大鼠适应性喂养1 周之后进行建模，向大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，腹部固定于鼠板上，于肋缘与脊柱交界处向下备皮，在离脊柱约1 cm 处切开皮肤，剥开肌肉组织，用止血钳拉出游离的脂肪组织，找到粉红色的卵巢，在其与子宫连接处用3 号线结扎，剪去卵巢组织，止血，并向腹腔内滴入青霉素注射液，再做肌层、皮肤的缝合。假手术组仅摘除卵巢附近的脂肪组织。各组大鼠单笼饲养，术后3 d 腹腔注射青霉素注射液，术后1 周进行阴道图片检查，确认卵巢完全摘除，卵巢摘除不完全者弃用。实验模型建立并恢复1 周后开始给药。根据前期预实验结果，假手术组和模型组每天灌胃等量的生理盐水，SL、SM、SH 组每天分别灌胃63、83 mg/kg 和107 mg/kg 的丹参提取物，雌激素组每天灌胃1 mg/kg β-雌二醇。各实验组连续给药12 周。
1.5 体质量和摄食量记录
体质量及摄食量自给药开始后进行记录，其体质量每周称量1 次，共计12 周，摄食量每天测量1 次并记录。观察各组摄食量与给药前后体质量的变化。
1.6 子宫系数测定
大鼠处死前12 h 进行断水断粮，处死后，将大鼠子宫上附着的脂肪剥离干净，吸取多余液体后称量子宫质量，计算子宫系数，观察各组子宫系数的变化，计算公式如下。
X=U/W×1 000
式中：X 为子宫系数，g/kg；U 为子宫质量，g；W 为大鼠体质量，g。
1.7 股骨计量学指标
股骨湿重：剥离大鼠右侧股骨，将附着的肌肉和筋膜剔除干净，吸取多余液体后用天平进行称量。
股骨干重：将剥离的大鼠右侧股骨脱脂72 h，随后在100 ℃环境中烘干8 h，并置于干燥器中放置30 min后进行称量。
股骨灰重：取烘干后的股骨，放入550 ℃马弗炉中8 h，取出后置于干燥器中冷却，精密称定股骨的灰重。
1.8 形态学观察
参照赵恒侠等[20]的研究方法，分别取大鼠左侧胫骨、股骨,除净周围附着的肌肉和筋膜组织，然后将骨组织置于10%福尔马林溶液中固定，EDTA 脱钙预处理后进行脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色、封片等步骤，分别获得大鼠股骨和胫骨切片。最后，通过光学显微镜采集图片，观察胫骨和股骨的骨小梁损伤程度。
1.9 统计学分析
本实验统计方法采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，结果均以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）评估各组间差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 体质量与摄食量
各组大鼠体质量自开始给药时进行记录，各组结果见表1。
表1 各组大鼠给药前后体质量及摄食量
Table 1 Body weight and food intake of rats in each group g
注：## 表示与SHA 组比较具有极显著性差异（P＜0.01）；* 表示与MOD 组比较具有显著性差异（P＜0.05）。
分组初始体质量最终体质量平均摄食量SHA262.75±32.14336.52±29.4125.67±3.23 MOD266.30±33.12 415.41±25.69##26.78±2.58 SL264.33±32.89385.69±28.61*25.69±2.96 SM266.38±25.22382.31±20.91*27.69±2.44 SH258.63±26.30378.83±31.03*26.33±2.12 E2258.49±34.26372.31±34.07*26.88±3.31
如表1所示，初始体质量各组间没有显著差异（P＞0.05），平均摄食量各组间无统计学差异（P＞0.05）。12周后体质量与SHA 组比较，MOD 组体质量极显著增加（P＜0.01），较SHA 组增加23.45%。与MOD 组比较，SL、SM、SH 与E2 组体质量均显著降低（P＜0.05），较模型组分别降低了7.98%、8.58%、9.57%、10.38%，说明丹参提取物能抑制去卵巢大鼠体质量的增加。
2.2 子宫系数
各给药组对去卵巢大鼠子宫系数的影响结果如图1所示。
图1 不同受试物对去卵巢大鼠子宫系数的影响
Fig.1 Effects of different drugs on uterine coefficients of ovariectomized rats
不同小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。
由图1 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 组的子宫系数分别为2.15、0.93、1.42、1.78、2.06、2.73 g/kg。与SHA 组比较，MOD、SL、SM 组的子宫系数显著降低（P＜0.05），较假手术组分别降低了57.02%、33.94%、17.25%，E2 组较假手术组显著升高了26.50%（P＜0.05），SH 组与SHA 组无显著差异（P＞0.05）。与MOD 组比较，SL、SM、SH 组和E2 组子宫系数均显著升高（P＜0.05），分别升高了18.24%、60.19%、63.73%和194.29%，且观察到丹参提取物给药剂量与子宫系数的增加呈正相关。与E2 组比较，丹参提取物各剂量组均显著降低（P＜0.05）。综上，丹参提取物各剂量组均可改善去卵巢大鼠的子宫系数，并且对子宫的刺激作用明显小于雌激素，而雌激素对子宫有明显的刺激作用。
2.3 股骨计量学指标
各给药组对股骨湿重、股骨干重和股骨灰重的影响结果如图2所示。
图2 不同受试物对去卵巢大鼠股骨湿重、干重和灰重的影响
Fig.2 Effects of different drugs on the wet weight，dry weight，and ash weight of femur in ovariectomized rats
A.股骨湿重；B.股骨干重；C.股骨灰重。不同小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。
由图2A 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 组的股骨湿重分别为1.22、1.02、1.10、1.15、1.16、1.24 g。与SHA组比较，MOD、SL 组股骨湿重显著降低（P＜0.05），分别降低了15.91%、9.65%，SM、SH 组和E2 组均无显著差异（P＞0.05）。与MOD 组比较，SL、SM、SH 组和E2 组的股骨湿重均显著升高（P＜0.05），分别升高了7.45%、12.45%、13.31%和20.76%，且随着丹参提取物剂量增加，股骨湿重也逐渐增加。与E2 组比较，SM、SH 组无显著差异（P＞0.05），表明丹参提取物中、高剂量对股骨湿重的增加与雌激素相当，且接近SHA 组。
由图2B 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 各组的股骨干重分别为0.72、0.52、0.62、0.66、0.64、0.69 g，与SHA组比较，MOD、SL、SH 组的股骨干重显著降低（P＜0.05），较SHA 分别降低27.97%、13.29%、10.31%，SM 和E2组均无显著差异（P＞0.05）。与MOD 组相比，各给药组的股骨干重均显著升高（P＜0.05），SL、SM、SH 和E2组的股骨干重较MOD 组分别升高20.38%、27.91%、24.51%和33.50%。与E2 组比较，SL、SM、SH 组均无显著差异（P＞0.05），表明丹参提取物各剂量组对股骨干重的增加效果与雌激素相当。
由图2C 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 各组的股骨灰重分别为0.43、0.31、0.36、0.37、0.39、0.42 g。与SHA 组比较，MOD、SL、SM 和SH 组的股骨灰重均显著降低（P＜0.05），较SHA 组分别降低27.65%、15.59%、13.24%、8.24%，E2 组无显著差异（P＞0.05）。与MOD 组相比，SL、SM、SH 和E2 组的股骨灰重均显著升高（P＜0.05），各组灰重较MOD 组分别升高16.67%、19.92%、26.83%和35.37%，且丹参提取物给药剂量与股骨灰重的增加呈正相关（P＜0.05）。与E2 组比较，SL、SM 组有显著差异（P＜0.05），SH 组无显著差异（P＞0.05）。
综上，丹参各组均可增加去卵巢大鼠股骨湿重、股骨干重和股骨灰重，丹参提取物中剂量组和高剂量组对股骨湿重的增加效果与雌激素相当，且已接近假手术组。
2.4 骨形态学观察
股骨形态学结果如图3所示，胫骨形态学结果如图4所示。
图3 不同受试物对去卵巢大鼠股骨形态学影响
Fig.3 Effects of different drugs on the morphology of femur in ovariectomized rats
图4 不同受试物对去卵巢大鼠胫骨形态学影响
Fig.4 Effects of different drugs on the morphology of tibia in ovariectomized rats
由图3 可知，SHA 组显示骨组织形态正常，股骨骨小梁密集，结构连接成网状，排列致密有序，粗细均匀，基本结构未见异常；MOD 组骨组织形态出现明显病理学改变，表现为骨小梁稀疏，断裂，排列紊乱，结构模糊，并可见游离末端；不同给药组股骨骨组织形态学变化较模型组均有明显改善，各给药组骨小梁无明显断裂，排列尚规则，且宽度接近正常，表明丹参各给药组和雌激素组均可以改善去卵巢大鼠股骨骨小梁结构。
由图4 可知，SHA 组显示骨组织形态正常，胫骨骨小梁密集，结构连接成网状，排列致密有序，粗细均匀，基本结构未见异常；MOD 组骨组织形态出现明显病理学改变，表现为骨小梁稀疏，断裂，排列紊乱，结构模糊，并可见游离末端；不同给药组胫骨骨组织形态学变化较模型组均有明显改善，可看出各给药组骨小梁无明显断裂，排列尚规则，且宽度接近正常，表明丹参各给药组和雌激素组均可以改善去卵巢大鼠胫骨骨小梁结构。
3 讨论与结论
去卵巢模型大鼠由于体内雌激素水平降低，骨代谢呈负平衡状态，骨吸收相对增强，骨量逐渐丢失，形成骨质疏松，去卵巢动物的体质量快速增长是为抵抗去卵巢后对骨骼影响的一种自身保护性反应，可以部分抑制模型大鼠的骨量丢失。股骨干重、湿重、灰重的降低，骨小梁的断裂，也直接反映了去卵巢模型骨量的丢失[21]。本研究发现，与去卵巢模型组大鼠比较，不同剂量的丹参提取物均能显著降低大鼠体质量、改善大鼠的子宫系数、增加股骨湿重、干重和灰重（P＜0.05），并且能够改善股骨及胫骨骨小梁结构，此外，与假手术组比较，雌激素组的子宫系数显著增加（P＜0.05），而前期也有研究表明长期使用雌激素对生殖系统造成损害[22]，本研究结果也进一步印证了长期使用雌激素可对子宫会产生强刺激，从而导致诱发严重疾病的可能性，而丹参各组对子宫的影响要明显弱于雌激素组（P＜0.05），这也就表明虽然丹参存在雌激素样作用，但对子宫的刺激明显减小。除了去卵巢动物模型外，丹参也对糖皮质激素模型引起的骨质疏松同样有效[23-24]，说明丹参可对不同类型的骨质疏松起到增加骨密度的作用。综上所述，丹参提取物可提高去卵巢大鼠骨质量，改善骨微结构，且对子宫刺激作用小，对缓解骨质疏松具有积极作用，对股骨湿重的增加与雌激素相当且接近于假手术组，表明丹参提取物具有增加骨密度的功效。
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