肿瘤是目前严重威胁人类健康和生命安全的疾病之一。2019年我国癌症中心数据统计报告显示，全国每年恶性肿瘤发病约392.9 万人，死亡约233.8 万人，而且恶性肿瘤发病率还在持续上升[1]，寻找治疗肿瘤的药物迫在眉睫。目前，临床上治疗肿瘤的办法主要有手术治疗、化疗、放疗、免疫治疗、分子靶向治疗等。手术治疗主要适用于良性肿瘤和未发生远处转移的恶性肿瘤；化疗和放疗这两种治疗方法都伴随着药物毒性，会产生严重的不良反应；虽然靶向治疗和免疫治疗在各种临床环境中远远优于传统疗法，但它们仍然受到先天和后天耐药机制的困扰，限制了许多患者的治疗效果[2]。近些年来，从天然产物中发现越来越多的抗肿瘤成分，合理选用可辅助治疗肿瘤的特殊症状和并发症，不仅与西医放化疗配合有效，而且可单独应用治疗肿瘤[3-4]。
昆布是海带科植物海带（Laminaria japonica Aresch.）或翅藻科植物昆布（Ecklonia kurome Okam.）的干燥叶状体，是大宗海洋中药品种，具有软坚散结、利水退肿、消痰功效[5]。勿日汗等[6]对昆布的应用方剂进行整理发现，含有昆布的方剂约有180 首，其中用于治疗瘿瘤病的方剂占总方数的40%，治瘿瘤方中昆布的使用频率为63.5%，因此，临床上常用昆布的软坚散结之功效对肿瘤进行干预治疗[7]。目前昆布抗肿瘤研究主要集中在昆布多糖、岩藻黄质等有效成分，昆布多糖即褐藻胶是昆布发挥抗肿瘤作用的主要成分，褐藻胶由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannur-onic acid，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通过1→4 糖苷键杂聚在一起组成[8]。研究表明，M 段、G 段是海洋藻类抗肿瘤的有效部位，目前发现褐藻胶寡糖抗肿瘤作用涉及多种机制，包括肿瘤细胞的增殖和转移、免疫调节等[9]。褐藻胶寡糖具有天然无毒、对机体的副作用小等特点，已经成为目前研究的热点。昆布利用传统水提得到的昆布水提物中古洛糖醛酸和甘露糖醛酸得率偏低，其抗肿瘤活性IC50 大多在300 μg/mL 以上，甚至达到1 mg/mL[10-11]。为提高昆布的资源利用率，本课题组借鉴槐耳-黄芪菌质、雷灵菌质的开发经验，采用中药双向发酵技术，对昆布进行双向发酵研究。中药双向发酵是指以药用真菌为发酵菌种，以中药材作为药性基质，该基质在为真菌提供营养物质的同时，又与真菌在生长过程中产生的各种代谢产物相互作用、相互影响，使整个发酵具有“双向性”[12]。
桑黄是锈革孔菌科真菌粗毛纤孔菌[Inonotus hispidus（Bull.）P.Karst.]的干燥子实体，是一种名贵的药食两用真菌，具有散结化饮、活血止血、健脾止泻的功效[13]。在生物抗癌领域，桑黄是国际公认的最具抗癌功效的真菌之一[14]。
本研究利用昆布和桑黄配伍组合的抗肿瘤功效[15-16]，利用双向发酵技术优化制备桑黄-昆布双向发酵菌质，阐明菌质中有效成分含量的变化，并采用磺酰罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）比色法测定桑黄-昆布双向发酵菌质对人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞HeLa、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖的影响，初步评价桑黄-昆布双向发酵菌质的抗肿瘤活性，以期提高昆布的抗肿瘤功效及利用率，为拓展其在药食同源功能食品的开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑黄：临清清源正本生物医药科技有限公司；昆布：亳州市佰世信中药饮片有限公司；L-阿拉伯糖、半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、D-无水葡萄糖、D-半乳糖醛酸（纯度均>98%）：中国食品药品检定研究院；D-葡萄糖醛酸、D-氨基半乳糖盐酸盐、D-氨基葡萄糖盐酸盐（纯度均≥99%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；D-甘露糖醛酸、L-古罗糖醛酸（纯度均为98%）：青岛博智汇力生物科技有限公司；人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞HeLa、HUVECs：中科院上海细胞库；RPMI 1640 培养液、DMEM高糖培养液、Mc-COY’S 5A 培养液：浙江森瑞生物科技有限公司；SRB（S1402）：上海生物工程有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：Merk 公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、三氯乙酸（tric-hloroacetic acid，TCA）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
MQD-B1T 全温振荡培养箱：上海旻泉仪器有限公司；ZHJH-C1115B 垂直流超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；LDZH-150KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；Aglient 1260Ⅱ型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；ME204E 万分之一天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GL 冷冻高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HWS-26 水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；101-2AB 型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SCIENTZ-18N 型冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；N-1100 型旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；SpectraMax-i3 多功能酶标仪：上海艾研生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 桑黄-昆布双向发酵体系的建立
1.3.1.1 培养基的配制
前期优化的桑黄最佳培养工艺为3%蔗糖、2%酵母浸粉、0.3%硫酸镁、0.6%磷酸二氢钾、0.1%硫酸铜，在此基础上添加一定量的昆布，进行桑黄-昆布双向发酵。
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，去皮洗净后切小块，沸水煮30 min后4 层纱布滤过，滤液加20 g 葡萄糖及15 g 琼脂，定容至1 L。
液体种子培养基：蔗糖2%、酵母浸粉1%、硫酸镁0.3%、磷酸二氢钾0.6%。
基础培养基：蔗糖3%、酵母浸粉2%、硫酸镁0.3%、磷酸二氢钾0.6%、硫酸铜0.1%。
1.3.1.2 菌种活化
将保存的桑黄菌株接种于PDA 培养基上，每个平板接入1 块体积约0.1 cm3 的桑黄菌种，置于26 ℃培养箱中恒温培养14 d，备用。
1.3.1.3 液体培养
于250 mL 锥形瓶装入液体种子培养基100 mL，接入活化后的桑黄菌种4 块，每块约0.1 cm3，于28 ℃、160 r/min 的摇床条件下培养7 d，得桑黄液体菌种子。
1.3.1.4 桑黄-昆布双向发酵菌质的制备
取粉碎后的昆布粉末4 g 置于250 mL 锥形瓶中，加入100 mL 基础培养基，搅拌均匀，放入121 ℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min，得双向发酵培养基；待其冷却至室温，接种10 mL 桑黄种子液，在28 ℃，160 r/min的摇床条件下培养9 d，10 000 r/min 离心10 min，沉淀用蒸馏水洗涤2 次，合并上清液，即得桑黄-昆布双向发酵菌质，浓缩后冷冻干燥，备用。
1.3.1.5 昆布水提物的制备
取4 g 粉碎后的昆布，加100 mL 蒸馏水，100 ℃回流提取1 h，提取2 次，合并两次提取液，10 000 r/min离心10 min，取上清液，即得昆布水提物，浓缩后冷冻干燥，备用。
1.3.2 化学成分含量测定
1.3.2.1 总糖含量测定
采用硫酸-蒽酮比色法测定总糖含量[17]。分别取昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质精密称定，加蒸馏水制成质量浓度为0.1 mg/mL 的溶液，10 000 r/min离心10 min，取上清液，待测。精密吸取样品溶液2 mL，迅速精密加入0.1%硫酸-蒽酮溶液6 mL，立即摇匀，沸水浴15 min，立即至冰浴中冷却15 min，取出，于625 nm 波长处测定吸光度，根据葡萄糖标准溶液曲线计算其总糖含量。
1.3.2.2 单糖组成分析
标准品溶液的制备：取L-阿拉伯糖、半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、D-无水葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-氨基半乳糖盐酸盐、D-氨基葡萄糖盐酸盐、D-甘露糖醛酸、L-古罗糖醛酸标准品精密称定，加水制成质量浓度为0.5 mg/mL 的混合标准品溶液，待测。取100 μL 上述混合标准品溶液，分别加入0.3 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各100 μL，混匀，至70 ℃恒温水浴90 min，冷却，加入100 μL、0.3 mol/L 盐酸溶液中和。继而加入500 μL氯仿，涡旋30 s，离心去除有机相，重复3 次。取水相，即得对照品溶液[18]。
供试溶液的制备：取昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质精密称定，加水制成质量浓度为5.0 mg/mL的待测样品溶液，备用。精密吸取样品溶液200 μL，加入2 mol/L 的TFA 溶液200 μL，封管后，置100 ℃恒温烘箱5 h；精密吸取水解液200 μL，加入200 μL 甲醇，氮气吹干，重复2 次。加入100 μL 水溶解，后续反应步骤同标准品溶液制备，即得供试品溶液。
色谱条件：色谱柱采用日本半井公司COSMOSIL Packed 5 C18-PAQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）的色谱柱；流动相为0.1 mol/L KH2PO4-NaOH 缓冲溶液（A）和乙腈（B），18%B 等度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。
各单糖组分相对含量分析：采用外标一点法进行计算，求得各单糖组分含量[19]。
1.3.2.3 总酚含量测定
采用福林酚比色法测定总酚含量[20]。分别取昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质精密称定，加蒸馏水制成质量浓度为5 mg/mL 的溶液，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，待测。精密量取样品溶液0.5 mL，加1.4 mol/L 的福林酚试剂0.5 mL，在1～8 min 内加入30 g/L 的Na2CO3 溶液4 mL，45 ℃水浴中避光显色112 min，在765 nm 处测溶液的吸光度，根据没食子酸标准溶液曲线计算其总酚含量。
1.3.3 体外抑制肿瘤细胞增殖活性试验
1.3.3.1 细胞培养
分别将人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa 用DMEM 高糖培养液培养，人乳腺癌细胞MCF-7 和HUVECs 用RPMI 1640 培养液培养，人结肠癌细胞HCT-116 用McCOY’S 5A 培养液培养，于37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养，胰酶消化，传代，保持细胞在良好的对数生长期。
1.3.3.2 检测方法
处于对数生长期的人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞HeLa、HUVECs 分别以5 000 个/孔（180 μL/孔）接种于96 孔板，培养24 h 后，加入待测样品20 μL，待测样品分为溶剂对照组，阳性药组（阿霉素），昆布水提物组和桑黄-昆布双向发酵菌质组，阳性药的终浓度为1 μmol/L，所有待测样品终浓度100 μg/mL，每个浓度设3 个复孔，溶剂对照组加入等体积的无菌水。药物作用72 h 后，每孔加入50%冰冷的三氯乙酸固定细胞，SRB 染色后，加入150 μL/孔的Tris 溶液，于540 nm 测定其吸光度。
肿瘤细胞增殖抑制率（I，%）按下列公式计算。
I＝[（A1－A2）/A1]×100
式中：A1 为对照品在540 nm 处的吸光度；A2 为给药孔样品在540 nm 处的吸光度。
1.4 数据统计及分析
所有结果以用平均值±标准差表示，并采用Excel和SPSS 软件进行分析。采用T-test 统计分析，以P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 总糖含量检测结果
以葡萄糖为标准品，以吸光度对质量进行线性回归，得回归方程为y=0.010 6x+0.041 7（R2=0.999 9），曲线拟合性较好。测得昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质中总糖含量分别为（30.00±1.51）、（645.00±18.55）mg/g，表明在相同的昆布生药量条件下，与昆布水提物相比，桑黄-昆布双向发酵菌质总糖含量显著升高（P<0.01）。推测原因可能为桑黄在发酵过程中不断代谢产生的纤维素酶类、淀粉酶类物质分解昆布的细胞壁，促进昆布细胞中褐藻胶、褐藻淀粉、褐藻糖胶等物质的溶出，此外，昆布也促进了桑黄的生长、分裂和发育，从而提高了菌质中总糖的含量[21]。
2.2 单糖组成分析结果
混合标准品、昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）图见图1～图3。
图1 混合标准品单糖的HPLC 色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards of monosaccharides
1.古洛糖醛酸；2.甘露糖醛酸；3.甘露糖；4.D-氨基葡萄糖；5.鼠李糖；6.葡萄糖酸；7.半乳糖酸；8.氨基半乳糖；9.葡萄糖；10.半乳糖；11.木糖；12.阿拉伯糖；13.岩藻糖。
图2 昆布水提物的HPLC 色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of Eckloniae Thallus water extract
1.古洛糖醛酸；2.甘露糖醛酸；3.甘露糖；13.岩藻糖。
图3 桑黄-昆布发酵菌质的HPLC 色谱图
Fig.3 HPLC chromatogram of Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product
1.古洛糖醛酸；2.甘露糖醛酸；3.甘露糖；13.岩藻糖。
由图1～图3 可知，昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质均含有甘露糖、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸和岩藻糖。
根据外标一点法计算得到昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质中单糖的含量，见表1。
表1 昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质单糖含量测定结果
Table 1 Content of monosaccharides in Eckloniae Thallus water extract and Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product mg/g
注：以昆布生药量计，同列比较，**表示差异极显著（P<0.01）。
样品名称 古洛糖醛酸 甘露糖醛酸甘露糖岩藻糖昆布水提物 2.64±0.028.96±0.171.13±0.05 17.76±0.17桑黄-昆布双向发酵菌质15.46±0.25** 50.66±0.14** 16.37±0.26** 22.64±0.11**
由表1 可知，在相同的昆布生药量条件下，昆布经桑黄发酵后，古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和岩藻糖含量显著增加（P<0.01），分别达到（15.46±0.25）、（50.66±0.14）、（16.37±0.26）、（22.64±0.11）mg/g，推测原因可能为桑黄在昆布提供能量的情况下进行分裂、生长、繁殖和代谢，它可以针对昆布不同的成分构成的细胞壁结构，分泌各种胞外酶，如纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、蛋白酶等使昆布中的有效成分如褐藻胶、褐藻淀粉、褐藻糖胶溶出，从而提高了菌质中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和岩藻糖的含量[22]。
2.3 总酚含量检测结果
以没食子酸为标准品，以吸光度（A）对质量进行线性回归，得回归方程为y=33.21x-0.094 9（R2=0.999 2），曲线拟合性较好。计算昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质中总酚的含量分别为（2.24±0.19）、（9.94±0.57）mg/g。结果显示在相同的昆布生药量条件下，与昆布水提物比较，桑黄-昆布双向发酵菌质总酚的含量显著升高（P<0.01）。推测原因可能与总糖含量升高的原因一致。
2.4 体外抑制肿瘤细胞增殖活性实验结果
昆布水提物、桑黄-昆布双向发酵菌质对A549、HCT-116、HeLa、HUVECs、HepG2、MCF-7 细胞增殖抑制率结果如表2所示。
表2 昆布水提物和桑黄-昆布双向发酵菌质对细胞的增殖抑制率（n=3）
Table 2 Inhibition rates of cell proliferation by Eckloniae Thallus water extract and Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product（n=3）%
增殖抑制率HUVECsHCT-116 细胞A549 细胞HeLa 细胞HepG2 细胞MCF-7 细胞昆布水提物40.47±1.2911.41±0.7612.50±0.345.59±3.7415.6250±1.05-16.78±0.02桑黄-昆布双向发酵菌质49.35±2.0021.88±5.6121.33±3.817.67±2.65-4.66±0.42-5.54±4.84阿霉素93.59±0.6194.01±3.7192.21±1.2388.31±2.8692.02±0.5471.165±0.01
如表2所示，昆布水提物、桑黄-昆布双向发酵菌质和阿霉素对HUVECs、A549、HCT-116、HeLa 细胞增殖均表现出不同程度的抑制作用；对于HepG2 细胞增殖，只有昆布水提物和阿霉素表现出了抑制作用；而对于MCF-7 细胞增殖除阿霉素外，昆布水提物和双向发酵菌质均未表现抑制作用，说明桑黄-昆布双向发酵菌质具有一定的抗肿瘤作用。相同的昆布生药量条件下，桑黄-昆布双向发酵菌质较昆布水提物的抗肿瘤活性明显提高，推测可能与桑黄-昆布双向发酵菌质中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、岩藻糖等功能单糖含量升高有关。古洛糖醛酸、甘露糖醛酸是昆布中的特征性单糖，分子量低，水溶性强，稳定性高，本身无细胞毒性，对正常细胞无损伤；古洛糖醛酸、甘露糖醛酸与一般的抗肿瘤剂不同，是通过提高生物体对肿瘤细胞的防御能力和增强宿主免疫系统的功能来实现抗肿瘤作用而非直接作用于肿瘤细胞[23-25]；甘露糖则是通过干扰葡萄糖代谢阻断肿瘤的能量来源，从而抑制肿瘤细胞的生长[26-28]，另外还可调控免疫检查点分子PD-L1，达到抗癌作用[29]；岩藻糖可以参与细胞的识别与黏附、糖链的合成、肿瘤的发生与转移等[30]。桑黄-昆布双向发酵菌质在100 μg/mL 的浓度条件下，对HUVECs 的增殖抑制作用最强，达到了49.35%，HUVECs 来源于人脐静脉，是一种具有干细胞潜能的内皮细胞，可以通过抑制HUVECs 增殖，减少或阻止新血管的生成，从而抑制肿瘤生长和转移[31]。
3 结论
本研究以桑黄作为发酵菌株，昆布作为药性基质，采用双向液体发酵技术，在一定的优化条件下制备桑黄-昆布双向发酵菌质，其中两类活性成分总量分析结果表明，在相同的昆布生药量情况下，发酵处理后的菌质中总糖及总酚含量均显著增加，总糖含量由30.00 mg/g 升高到645.00 mg/g；总酚含量由2.24 mg/g升高到9.94 mg/g。发酵处理后的菌质中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和岩藻糖含量显著增加，分别由2.64、8.96、1.13、17.76 mg/g 升高到15.46、50.66、16.37、22.64 mg/g。除此之外还进行了桑黄-昆布双向发酵菌质对6 种细胞株增殖的影响研究，结果表明桑黄-昆布双向发酵菌质在100 μg/mL 的浓度条件下，对HUVECs的增殖显示出显著的抑制作用，抑制率为49.35%，同时对A549、HCT-116、HeLa 细胞增殖也表现出不同程度的抑制作用，抑制率分别为21.88%、21.33%、7.67%，说明桑黄-昆布双向发酵菌质具有一定的抗肿瘤作用。本研究为将桑黄-昆布发酵菌质开发功能食品提供了参考，后续还将进行桑黄-昆布双向发酵菌质对HUVECs 增殖抑制是否呈剂量依赖性以及对HUVECs 抑制效果的稳定性等进行深入研究。
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