益生菌发酵制备金针菇抑菌肽

抑菌肽是生物体内产生的具有抑菌功能的肽类物质。研究显示，抑菌肽不仅对细菌、真菌、病毒和肿瘤细胞等具有杀伤作用，而且还有抗寄生虫、加快伤口愈合等生理功能。抑菌肽的抗菌机理无特异性，与抗生素相比，其不易产生耐药性，且抑菌肽在杀死癌细胞的同时又不对正常细胞产生毒性作用，因此抑菌肽在绿色食品防腐剂、绿色饲料添加剂、治疗肿瘤药物和新型农药的研发等领域发展前景广阔[1-2]。

抑菌肽的制备方法主要有酶解、微生物发酵、化学合成和基因工程重组法等。酶解法是以农副产品和水产品等为原料工业化生产抑菌肽最常用的方法，但是使用此法不仅要对原料进行严格预处理，还需对蛋白水解酶进行筛选，且一些副产物的产生会降低抑菌肽分离纯化的效率。化学合成法中副产物及残留化合物较多，抑菌肽的分离纯化步骤繁琐，反应过程中会有大量有机溶剂的参与，处理不当会对环境造成污染。基因工程重组法制备的抑菌肽与天然抑菌肽相比存在差异，因此其抑菌活性与天然抑菌肽有所不同，此外制备过程中产生的细菌内毒素不易被排除，表达出的产物包涵体居多。微生物发酵法是利用微生物生长代谢过程中产生的蛋白酶将基质中蛋白水解成小分子活性肽的方法，具有生产工艺简便、副产物少、易于推广的优点[3-4]。

金针菇（Flammulina velutipes），又名金钱菌、冬菌，属担子菌纲。作为世界四大食用菌之一的金针菇，其子实体内不仅含多种矿物质、维生素、黄酮类化合物、多糖及膳食纤维等成分[5-8]，而且富含蛋白质，是活性肽开发和生产的极好原料[9-12]，但目前尚未见有关利用固态发酵法制备金针菇抑菌肽的研究，所以本研究尝试通过益生菌发酵金针菇制备抑菌肽，以期为金针菇的应用研究提供新方向，为金针菇抑菌肽的工业化生产提供参考。

1 材料

1.1 主要材料

金针菇：市售；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）：绥化学院微生物实验室提供。

1.2 主要试剂

牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；牛血清蛋白标准品（分析纯）：北京酷尔化学科技有限公司；考马斯亮蓝G-250、柠檬酸三铵、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁（均为分析纯）：天津市光复科技发展有限公司。

1.3 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器（LX-100 型）：深圳良谊实验室仪器有限公司；紫外可见分光光度计（752 型）：上海菁华科技仪器有限公司；水浴恒温振荡器（SHA-B型）：上海新乘仪器设备有限公司；万能粉碎机（JR-750A 型）：浙江金华永康市云达机械设备厂；高速冷冻离心机（TGL-20bR 型）：上海安亭科学仪器厂；数显电热恒温培养箱（HPX-9162 MBE 型）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；酸度计（pHS-3C 型）：上海雷磁仪器有限公司；牛津杯（内径6 mm）：上海鲁硕实业有限公司；超滤离心管（截留分子量分别为3 kDa 和10 kDa）：美国Millipore 公司。

2 方法

2.1 抑菌肽产率的测定方法

抑菌肽质量的测定采用考马斯亮蓝G-250 染色法，按照文献[13]中所述步骤进行操作。抑菌肽产率（Y，%）计算公式如下。

式中：m1 为抑菌肽质量，g；m 为金针菇用量，g。

2.2 抑菌肽抑菌性的检测

2.2.1 菌悬液的制备

将装有牛肉膏蛋白胨培养液的锥形瓶灭菌后分别接入3 种待测菌种，然后放置在水浴恒温振荡器中，于37 ℃下以150 r/min 培养约24 h，取菌悬液于600 nm 处测定吸光值，当吸光值为0.1 时停止培养，此时菌体浓度约为1×106～1×107 CFU/mL[14]。

2.2.2 抑菌试验

采用抑菌圈法测定金针菇抑菌肽对3 种常见菌种（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌）的抑菌活性。在牛肉膏蛋白胨固体平板上加入0.1 mL 菌悬液并涂布均匀，每个平板上用无菌镊子放置6 个灭菌后的牛津杯。取经0.22 μm 微孔滤膜过滤的金针菇抑菌肽溶液0.1 mL 加入已编号的牛津杯中，以滴加无菌生理盐水的牛津杯作为阴性对照。37 ℃下恒温培养24 h 后观察统计抑菌圈直径。

2.3 金针菇抑菌肽的制备及益生菌的筛选

菌种活化：枯草芽孢杆菌的活化方法同2.2.1；酿酒酵母用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基于28 ℃下振摇培养36 h，转速150 r/min；黑曲霉用查氏培养基在恒温培养箱中28 ℃下培养5 d，至孢子成熟后用无菌水制成孢子悬液。培养后适当稀释使酿酒酵母菌体浓度和黑曲霉孢子浓度约为1×108 CFU/mL（采用血球计数板直接计数法计数）[15]。

称取3 g 蔗糖和40 g 金针菇粉（由洗净的金针菇子实体于50 ℃下烘干后用万能粉碎机粉碎并过80 目筛制得）充分混匀，装入500 mL 锥形瓶中并加入150 mL蒸馏水，于121 ℃灭菌20 min。待培养基冷却后将活化好的3 种菌的菌悬液或孢子悬液2 mL 接种至固体培养基中，混合均匀后进行发酵。其中枯草芽孢杆菌的发酵温度设置为37 ℃，酿酒酵母和黑曲霉菌的发酵温度设置为28 ℃，发酵时间均为96 h。发酵过程中每24 h振荡一次。发酵完成后加入蒸馏水搅拌均匀，3 500 r/min离心20 min，取上清液，用pH 沉淀法获取金针菇抑菌肽。将金针菇抑菌肽沉淀用蒸馏水复溶后测其抑菌性。筛选出所产抑菌肽的抑菌活性最强的菌种[16-19]。

2.4 沉淀法分离金针菇活性肽最佳pH 值的筛选

当发酵完成后，向发酵瓶中加入蒸馏水并搅拌均匀，然后离心取上清液，采用酸度计分别在pH3、4、5、6、7、8、9 进行测试（利用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl调pH 值），分别测定在各pH 值所获得的金针菇肽沉淀物的抑菌性。筛选出最适合沉淀抑菌肽的pH 值。

2.5 单因素试验设计

2.5.1 液料比对金针菇抑菌肽产率的影响

称取40 g 金针菇粉和3 g 蔗糖混匀装于锥形瓶中，依次按液料比（蒸馏水体积/金针菇粉质量）3.25∶1、3.75∶1、4.25∶1、4.75∶1、5.25∶1（mL/g）添加蒸馏水，将培养基在121 ℃灭菌20 min。冷却后用筛选出的最适菌种接种，置于28 ℃下发酵96 h。发酵完成后加入蒸馏水搅拌均匀，3 500 r/min 离心20 min 后取上清液，用沉淀法在最适pH 值下获取金针菇抑菌肽，依次测定金针菇抑菌肽产率。

2.5.2 发酵时间对金针菇抑菌肽产率的影响

称取40 g 金针菇粉和3 g 蔗糖混匀装于锥形瓶中，液料比为3.75∶1（mL/g），接菌后在28 ℃下分别发酵24、48、72、96、120 h，之后的处理方法同2.5.1，依次测定金针菇抑菌肽产率。

2.5.3 发酵温度对金针菇抑菌肽产率的影响

称取40 g 金针菇粉和3 g 蔗糖混匀装于锥形瓶中，液料比设置为3.75∶1（mL/g），将接菌后的培养基分别置于23、28、32、37、40 ℃下培养96 h。依次测定金针菇抑菌肽产率。

2.5.4 金针菇用量对金针菇抑菌肽产率的影响

分别称取10、20、40、60、80 g 金针菇粉和3 g 蔗糖，液料比为3.75∶1（mL/g），将接菌后的培养基置于28 ℃下发酵96 h。依次测定金针菇抑菌肽产率。

2.6 响应面试验设计

以单因素试验结果为依据，通过Design-Expert 8.0.6 软件的Box-Behnken 试验设计，进行响应面分析，以获得金针菇抑菌肽的最佳制备条件[20-23]。因素水平见表1。

2.7 金针菇抑菌肽的分级分离

将在最适发酵条件下获得的金针菇抑菌肽用沉淀法分离，然后用蒸馏水复溶后先经0.22 μm 微孔滤膜过滤，再用截留3 kDa 和10 kDa 两种分子量的超滤离心管进行离心，将金针菇抑菌肽分离成3 个截留分子量区间，即小于3 kDa、3～10 kDa、大于10 kDa。研究不同分子量肽的抑菌性。

2.8 数据处理

每组试验均重复3 次，所得数据采用Excel 2010进行分析处理并制图。

3 结果与分析

3.1 抑菌肽质量的标准曲线绘制

由试验数据绘制的抑菌肽质量的标准曲线如图1所示。

由图1 可知，得到的线性回归方程为y=0.007 3x＋0.025 3，R2=0.994 0。

3.2 筛选试验结果

发酵结束后，在金针菇固体培养基中并未见到酿酒酵母的菌落生长，可见金针菇固体培养基不适合酿酒酵母的生长。枯草芽孢杆菌可以在金针菇基质上正常生长，但发酵产物在各pH 值沉淀得到的肽均不具有抑菌活性。黑曲霉的筛选数据如表2 所示。

由表2 可以看出，黑曲霉的发酵产物在pH4 处的沉淀物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌活性，且抑菌圈直径较大；在pH8 处的沉淀物只对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有抑菌活性，且抑菌圈直径较小。因此pH4 为最适合沉淀抑菌肽的pH 值。

3.3 单因素试验结果

3.3.1 液料比对金针菇抑菌肽产率的影响

不同液料比条件下金针菇抑菌肽产率变化趋势如图2 所示。

由图2 可知，随着蒸馏水体积逐渐增大，抑菌肽产率出现先升高后降低的趋势。液料比为3.75∶1（mL/g）时，抑菌肽产率最高。这可能是由于固态发酵中基质的湿润和致密程度会影响菌体生长和代谢速度，从而影响抑菌肽产率。蒸馏水体积过大，水分含量过高，会导致培养基底部出现结块，难以进行氧气的交换，从而不利于黑曲霉菌丝生长；蒸馏水体积过小，水分含量过低，则会阻碍金针菇中能源物质溶解，妨碍基质中营养物质的输送，也会影响黑曲霉生长，使蛋白酶的产量下降，从而使抑菌肽产率降低[24]。因此选择液料比3.75∶1（mL/g）进行后续试验。

3.3.2 发酵时间对金针菇抑菌肽产率的影响

不同发酵时间条件下金针菇抑菌肽产率变化趋势如图3 所示。

由图3 可知，在24 ～96 h 时，随着发酵时间延长，抑菌肽产率逐渐升高，在发酵96 h 时达到最大值，但在此之后，产率呈下降趋势。这可能是由于黑曲霉在发酵时间为24 ～96 h 时生长旺盛，蛋白质水解酶分泌能力强，从而促进了抑菌肽的积累。而随着发酵时间延长，菌体细胞大量繁殖，培养基中营养物质不断被耗尽，菌体生长逐渐进入衰亡期，造成蛋白质水解酶分泌量减少，而另一方面肽逐渐被菌体降解利用，从而使抑菌肽产率下降。因此选择发酵时间96 min 进行后续试验。

3.3.3 发酵温度对金针菇抑菌肽产率的影响

不同发酵温度下金针菇抑菌肽产率变化趋势如图4 所示。

由图4 可知，随着发酵温度的升高，金针菇抑菌肽的产率出现先升高后降低的趋势，在28 ℃时达到最大值。这是由于温度适当升高会使黑曲霉生长代谢加快，产生的蛋白酶量多且活性强，金针菇抑菌肽的产率提高，但是温度过高不适宜黑曲霉菌丝的生长，甚至会导致菌丝体进入休眠期，不利于发酵，从而使抑菌肽产率下降[24]。因此选择发酵温度28 ℃进行后续试验。

3.3.4 金针菇用量对金针菇抑菌肽产率的影响

不同金针菇用量下金针菇抑菌肽产率变化趋势如图5 所示。

由图5 可以看出，随着金针菇用量的增加，金针菇抑菌肽的产率呈现出先升高后下降的趋势，在20 g 时达到最大值。这是因为菌种处于对数期生长时，对氧气需求量较高，当发酵瓶中金针菇培养基用量过高时，培养瓶内氧气不足继而造成黑曲霉生长繁殖速率减慢，金针菇抑菌肽产率下降；当发酵瓶中金针菇培养基用量过低时，无法为后续发酵过程提供充足营养，造成黑曲霉发酵产生的抑菌肽被菌体利用，使抑菌肽产率降低。因此选择金针菇用量20 g 进行后续试验。

3.4 响应面试验结果

根据单因素试验结果，进行四因素三水平的Box-Behnken 设计，响应面试验结果见表3。

方差分析结果见表4。

利用软件Design-Expert 8.0.6 进行数据分析，进行二次多元回归拟合，得到二次多元回归方程为R=-1 115.343 23＋228.498 89A＋4.768 85B＋32.984 36C＋3.537 93D -0.580 83AB -1.511 11AC -0.041 333AD -0.018 958BC＋7.89583×10-3BD-0.048815CD-17.30533A2-0.011 027B2-0.429 51C2-0.052 889D2。

由表4 可知，模型的P＜0.000 1，表明该回归方程模型高度显著，且模型失拟值P=0.098 1＞0.05，不显著，相关系数R2=0.955 3，R2Adj=0.910 6，说明模型拟合程度较好，可以用此模型来分析和预测黑曲霉发酵制备金针菇抑菌肽的工艺条件。B、AB、A2、B2、C2、D2 对金针菇抑菌肽产率的影响高度显著，C、D 的影响极显著，AC、BD、CD 的影响显著。

响应曲面见图6～图11。

从图6～图11 可以看出，图8 和图9 中曲面图的等高线近乎圆形，说明A 与D 间以及B 与C 间交互作用影响不显著，其余4 个曲面图中的等高线均为椭圆形，说明图中两个因素交互作用影响显著。又由于等高线通常向影响相对大的因素轴向聚集，综合表4 的F 值可知，4 个因素的影响程度排序为B＞C＞D＞A。

预测此工艺的最优条件为液料比3.50∶1（mL/g）、发酵时间109.59 h、发酵温度28.28 ℃、金针菇用量27.21 g。在此条件下预测金针菇抑菌肽的产率为59.94%。为了试验操作方便，将条件校正为液料比3.5∶1（mL/g）、发酵时间109.6 h、发酵温度28 ℃、金针菇用量27.21 g。为检验该预测条件的可靠性，进行3 次验证试验，得到金针菇抑菌肽的产率为（61.25±1.14）%。实测值与预测值相差较小，表明所建模型与实际情况高度拟合，此响应面法优化的黑曲霉发酵制备金针菇抑菌肽的工艺可靠。

3.5 金针菇抑菌肽分级分离的结果

3 个截留分子量区间抑菌肽的抑菌性见表5。

由表5 可知，肽分子量越小，抑菌性越强。截留分子量小于3 kDa 的抑菌肽抑菌活性最强。

4 结论

本文对益生菌发酵金针菇基质制备抑菌肽的条件进行了优化。试验结果表明，黑曲霉为最适发酵菌种；沉淀法分离金针菇抑菌肽的最适pH 值为4；最佳发酵条件为液料比3.5∶1（mL/g）、发酵时间109.6 h、发酵温度28 ℃、金针菇用量27.21 g，在此条件下得到金针菇抑菌肽的产率为（61.25±1.14）%。此外，本文还对金针菇抑菌肽进行了分级分离和活性比较。结果表明，截留分子量小于3 kDa 的肽抑菌活性最强。此研究成果将为金针菇抑菌肽的开发利用奠定基础。在下一步的工作中，将扩大益生菌的筛选范围，并对沉淀法分离金针菇抑菌肽的pH 值筛选范围进一步细化，还将对抑菌肽的相对分子质量及氨基酸组成做进一步的鉴定和分析。

参考文献：

[1] 王凤萍. 苦荞抗菌肽的制备、应用及抑菌机理的研究[D]. 昆明:昆明理工大学, 2018.WANG Fengping. Study on preparation, application and antibacterial mechanism of antibacterial peptides from Tartary buckwheat[D].Kunming: Kunming University of Science and Technology, 2018.

[2] 许志平, 侯小琴, 孙力军, 等. 纳豆芽孢杆菌NT-6 酶解猪肉骨粉生产抗菌饲用肽的工艺优化[J]. 广东农业科学, 2020, 47(10): 149-157.XU Zhiping, HOU Xiaoqin, SUN Lijun, et al. Optimization of enzymolysis technology for meat and bone meal by Bacillus natto NT-6 to produce antimicrobial peptide[J]. Guangdong Agricultural Sci -ences, 2020, 47(10): 149-157.

[3] 张志焱, 赵倩, 于佳民, 等. 一株枯草芽孢杆菌产抗菌肽培养基筛选及发酵工艺优化的研究[J]. 中国畜牧兽医, 2019, 46(4): 1217-1226.ZHANG Zhiyan, ZHAO Qian, YU Jiamin, et al. Selection of culture medium and optimization of fermention conditions for Bacillus subtilis producing antimicrobial peptides[J]. China Animal Husbandry &Veterinary Medicine, 2019, 46(4): 1217-1226.

[4] 刘丽莉, 梁严予, 孟圆圆, 等. 微生物发酵法制备牛骨抗菌肽的工艺条件优化[J]. 河南科技大学学报(自然科学版), 2018, 39(6):72-78, 8.LIU Lili, LIANG Yanyu, MENG Yuanyuan, et al. Optimization of process conditions for bovine antimicrobial peptides prepared by microbial fermentation method[J]. Journal of Henan University of Science and Technology (Natural Science), 2018, 39(6): 72-78, 8.

[5] 王桂林, 杨宇, 李国辉, 等. 金针菇多糖生物活性研究进展[J]. 中国食用菌, 2021, 40(12): 10-13, 18.WANG Guilin, YANG Yu, LI Guohui, et al. Research progress on the biological activities of Flammulina velutipes polysaccharide[J].Edible Fungi of China, 2021, 40(12): 10-13, 18.

[6] 刘学成, 王文亮, 弓志青, 等. 金针菇膳食纤维改性、理化性质及抗氧化、降血脂活性[J]. 食品科学, 2021, 42(23): 90-98.LIU Xuecheng, WANG Wenliang, GONG Zhiqing, et al. Modification, physicochemical properties and lipid-lowering and antioxidant activity of dietary fiber from Flammulina velutipes[J]. Food Science,2021, 42(23): 90-98.

[7] 刘兰庆, 汪鋆植, 倪炎. 金针菇黄酮类化合物的体外抗氧化活性研究[J]. 生物化工, 2018, 4(6): 62-65.LIULanqing,WANGJunzhi,NIYan.Antioxidantactivityof flavonoids in Flammulina velutipes in vitro[J]. Biological Chemical Engineering,2018, 4(6): 62-65.

[8] 谭一罗, 杨和川, 苏文英, 等. 金针菇活性成分及药理活性研究进展[J]. 江苏农业学报, 2018, 34(5): 1191-1197.TAN Yiluo, YANG Hechuan, SU Wenying, et al. Research progress on bioactive composition and pharmacological activity of Flammulina velutipes[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2018, 34(5):1191-1197.

[9] 刘宗奇, 武晨剑, 袁学文, 等. 白色和黄色金针菇子实体营养成分与挥发性物质比较[J]. 食用菌学报, 2021, 28(3): 102-111.LIU Zongqi, WU Chenjian, YUAN Xuewen, et al. Comparison of nutrients and volatile compounds between fruiting bodies of white and yellow Flammulina filiformis[J]. Acta Edulis Fungi, 2021, 28(3): 102-111.

[10] 陆欢, 王瑞娟, 刘建雨, 等. 不同品种金针菇的营养成分分析与评价[J]. 食品与机械, 2021, 37(6): 69-75, 96.LU Huan, WANG Ruijuan, LIU Jianyu, et al. Analysis and evaluation of nutrient components of different strains of Flammulina filiformis[J]. Food & Machinery, 2021, 37(6): 69-75, 96.

[11] 王慧, 郭东方, 王鑫. 金针菇的营养保健功能及开发利用现状[J].中国食用菌, 2021, 40(11): 11-14, 24.WANG Hui, GUO Dongfang, WANG Xin. Nutritional health function of Flammulina velutipes and its development and utilization status[J]. Edible Fungi of China, 2021, 40(11): 11-14, 24.

[12] 党仪安, 王文亮, 弓志青, 等. 食用菌生物活性肽制备及功能活性研究进展[J]. 食品工业, 2019, 40(8): 228-231.DANG Yian, WANG Wenliang, GONG Zhiqing, et al. Advances in preparation and functional activity of bioactive peptide from edible fungus[J]. The Food Industry, 2019, 40(8): 228-231.

[13] 郭蔼光, 郭泽坤. 生物化学实验技术[M]. 北京: 高等教育出版社,2007.GUO Aiguang, GUO Zekun. Biochemical experimental technology[M]. Beijing: Higher Education Press, 2007.

[14] 王广慧, 谭吉丽, 杜艳超, 等. 复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的纯化及活性测定[J]. 中国饲料, 2020(7): 32-37.WANG Guanghui, TAN Jili, DU Yanchao, et al. Purification and activity determination of flavonoids from Flammulina velutipes extracted by complex enzyme-assisted high pressure method[J]. China Feed, 2020(7): 32-37.

[15] 刘潇, 郭丽娜, 马海乐, 等. 枯草芽孢杆菌和黑曲霉固态发酵制备核桃多肽的工艺条件优化[J]. 现代食品科技, 2018, 34(8): 130-137.LIU Xiao, GUO Lina, MA Haile, et al. Optimization of the process conditions of walnut meal peptides by solid state fermentation -Bacillus subtilis and Aspergillus niger[J]. Modern Food Science and Technology, 2018, 34(8): 130-137.

[16] 刘建成. 棉粕寡肽发酵制备及其生物活性和营养特性研究[D].石河子: 石河子大学, 2018.LIU Jiancheng. Preparation of cottonseed peptides by fermentation and study on their biological activity and nutrition characteristics[D]. Shihezi: Shihezi University, 2018.

[17] 佡思涵. 纳米蛹虫草基质发酵制备活性肽及其降血糖活性研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2018.XIAN Sihan. Preparation of bioactive peptides from nanometer Cordyceps powder by fermentation and its hypoglycemic activity research[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2018.

[18] 冒鑫哲, 彭政, 周冠宇, 等. 枯草芽孢杆菌高产角蛋白酶发酵条件优化[J]. 食品与发酵工业, 2020, 46(17): 138-144.MAO Xinzhe, PENG Zheng, ZHOU Guanyu, et al. Optimized fermentation for improving keratinase production by Bacillus subtilis WB600[J]. Food and Fermentation Industries, 2020, 46(17): 138-144.

[19] 李萌, 李丽, 张坦, 等. 枯草芽孢杆菌固态发酵产脂肽培养基优化及脂肽的初步鉴定[J]. 食品工业科技, 2019, 40(6): 198-204.LI Meng, LI Li, ZHANG Tan, et al. Optimization of lipopeptide production medium by solid-state fermentation of Bacillus subtilis and preliminary identification of lipopeptide[J]. Science and Technology of Food Industry, 2019, 40(6): 198-204.

[20] 杨晓婷, 徐力, 田永强. 响应面优化黑曲霉和酿酒酵母发酵豆粕的条件[J]. 草原与草坪, 2020, 40(5): 102-107, 115.YANG Xiaoting, XU Li, TIAN Yongqiang. Optimization of soybean meal fermentation conditions by using response surface methodology[J]. Grassland and Turf, 2020, 40(5): 102-107, 115.

[21] 于莹, 宿小杰, 周德庆, 等. 响应面法优化紫贻贝免疫活性肽的制备工艺[J]. 中国海洋药物, 2021, 40(6): 21-29.YU Ying, SU Xiaojie, ZHOU Deqing, et al. Optimization of preparation technology of immunomodulatory peptides from Mytilus edulis by response surface methodology[J]. Chinese Journal of Marine Drugs,2021, 40(6): 21-29.

[22] 王睿文, 黄旭萍, 时梦, 等. 响应面法优化余甘子果实总黄酮提取工艺[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(24): 9521-9529.WANG Ruiwen, HUANG Xuping, SHI Meng, et al. Optimization of flavonoids extraction technique from Phyllanthus emblica fruit by response surface methodology[J]. Journal of Food Safety & Quality,2021, 12(24): 9521-9529.

[23] 闫舒雅, 郭素萍. 响应面法优化桦褐孔菌发酵产多糖工艺[J]. 食品与发酵科技, 2021, 57(6): 49-53.YAN Shuya, GUO Suping. Optimization of fermentation process of Inonotus obliquus polysaccharides by response surface methodology[J]. Food and Fermentation Sciences & Technology, 2021, 57(6): 49-53.

[24] 许赣荣, 胡鹏刚. 发酵工程[M]. 北京: 科学出版社, 2013.XU Ganrong, HU Penggang. Fermentation engineering[M]. Beijing:Science Press, 2013.

Preparation of Bacteriostatic Peptides from Flammulina velutipes by Fermentation of Probiotics

WANG Guanghui，WEI Yadong，YU Dehan，ZHANG Tengxiao，WANG Bin
（College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua University，Suihua 152061，Heilongjiang，China）

Abstract：In order to obtain a higher yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes，this paper optimized the process conditions for preparing bacteriostatic peptides by solid-state fermentation of probiotics on F.velutipes，and used ultrafiltration to grade and compare the activity of bacteriostatic peptides. Using F. velutipes as the fermentation substrate，with the antimicrobial activity of the bacteriostatic peptides against Escherichia coli，Staphylococcus aureus，and Salmonella as the indicator，three probiotics including Bacillus subtilis，Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger were screened，and the optimal pH value for separating and precipitating bacteriostatic peptides was selected. Then，the effects of four factors including liquid-to-solid ratio，fermentation time，fermentation temperature，and amount of F. velutipes on the yield of F. velutipes bacteriostatic peptides were investigated by single-factor and response surface experiments. The results showed that A. niger was the optimal strain for solid-state fermentation to produce F. velutipes bacteriostatic peptides. The optimal pH for precipitating bacteriostatic peptides was 4；the optimal fermentation conditions were as follows: liquidto-solid ratio of 3.5∶1（mL/g），fermentation time of 109.6 h，fermentation temperature of 28 ℃，and amount of F.velutipes of 27.21 g. Under these conditions，the yield of F. velutipes bacteriostatic peptides was（61.25±1.14）%.Bacteriostatic peptides with a molecular weight less than 3 kDa had the strongest activity.

Key words：Flammulina velutipes；bacteriostatic peptides；solid-state fermentation；probiotics；ultrafiltration

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.18.017

基金项目：黑龙江省省属高等学校基本科研业务费基础研究项目（YWK10236200203）

作者简介：王广慧（1973—），女（汉），教授，硕士，研究方向：食用菌中生物活性物质。

引文格式：

王广慧，魏雅冬，于德涵，等. 益生菌发酵制备金针菇抑菌肽[J]. 食品研究与开发，2023，44（18）：125-132.

WANG Guanghui，WEI Yadong，YU Dehan，et al. Preparation of Bacteriostatic Peptides from Flammulina velutipes by Fermentation of Probiotics[J]. Food Research and Development，2023，44（18）：125-132.

加工编辑：冯娜

收稿日期：2022-06-21