雪莲菌（Tibetan kefir grains，TKGs），又称藏灵菇，是一种天然混菌发酵系统，通过大自然长期驯化，逐步形成由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多种微生物组成的稳定共生的群落，其作为传统发酵剂在青海和西藏等地已有几百年的食用历史[1]。雪莲菌生长形状无规律且不规则，多数呈球状或米粒状，逐渐生长为花椰菜状，颗粒直径大小从10 mm 到40 mm 不等，颜色从白色到浅黄色，由大约86%的水分和14%的干物质组成，干物质包括多糖、蛋白质、脂肪和灰分，其来源不同成分含量可能有所不同[2-5]。雪莲菌的质地具有一定的弹性和黏稠感，其黏稠感来源于胞外多糖、脂质和蛋白质组成的天然凝胶基质结构[2]。这种凝胶基质结构由雪莲菌中的乳酸菌产生，乳酸菌可以分泌表层蛋白和由葡萄糖、半乳糖通过糖苷键连接的胞外多糖——开菲尔多糖[6]。雪莲菌化学成分十分复杂，具有多种功能活性成分[7]，其发酵乳也具有多种功能活性，如调节肠道菌群、抗氧化、抑制有害菌群生长等[8]。
硒（Se）是人体必需的微量元素之一，其存在形式主要分为无机硒和有机硒[9]。在自然界中，无机硒包括硒酸盐和亚硒酸盐，有机硒以硒氨基酸和硒蛋白为主[10]。硒具有多种重要的生理功能，如抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力和调节肠道菌群等[11-12]。机体主要是通过食物摄取硒元素[13]。饮食硒摄入不足可能会导致硒缺乏症，从而引起克山病、大骨节病等[14]。因此，通过膳食合理地补充硒元素成为目前的研究热点，而微生物富硒因其时间短、效率高、安全可控等特点受到广泛关注。
大量研究证明，微生物可以将无机硒生物转化为有机硒或纳米硒[15]，相较于无机硒，有机硒和纳米硒的生物利用率更高[16]。因此，富硒微生物具有更高效地为机体补充硒元素的潜力。多种益生菌都可以吸收和转化无机硒，如酵母菌、乳酸菌和双歧杆菌等[17-19]。雪莲菌作为一种复杂的混菌基质，主要有乳酸菌、酵母菌和醋酸菌，同时含多种益生菌[20]。基于此特点，雪莲菌可能具有较好的吸收和转化硒的潜力。本文通过雪莲菌富硒条件的优化，确定最佳的富硒时间、富硒温度、富硒方式和培养条件等，将雪莲菌与硒有机结合，制备出具有较高生物功能活性的富硒雪莲菌，为雪莲菌的创新型应用提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
雪莲菌：本试验所用菌种来自西藏拉萨农户家中。亚硒酸钠（分析纯）：上海国药化学试剂有限公司；纯牛奶：内蒙古蒙牛乳业股份有限公司；浓硝酸、浓盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硼氢化钾、氢氧化钠、氢氧化钠、K3[Fe（CN）6]、氨基水杨酸、无水乙醇（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）试剂、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]试剂：北京Solarbio 科技公司。
微波消解仪（Multiwave PRO）：奥地利Anton Paar Gmbh 公司；液相-原子荧光光度计（LC-AFS-8530）：北京海光仪器有限公司；多功能酶标仪（VictorX3）：美国PE 公司；真空冷冻干燥机（FD5-3）：金西盟科技有限公司；电热石墨消解仪（BHW-09A45）：上海博通化学科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种活化
参考文献[21]将雪莲菌菌种活化培养。雪莲菌在4 ℃无菌牛奶中保藏。菌种活化时，将保藏的菌种通过筛网滤出，无菌纯水洗涤数次，并接种至无菌纯牛奶中，于28 ℃恒温静置培养24 h。
1.2.2 总硒含量测定
将所测样品预冻后进行真空冷冻干燥，完成后记录样品质量，将样品置于消解罐中，加入5 mL 浓硝酸，120 ℃预消解40 min。结束后向消解罐中加入1 mL浓硝酸和1 mL 体积分数30%过氧化氢，并将消解罐放入微波消解仪中，设置程序为120 ℃保持1 min，150 ℃保持5 min，180 ℃保持10 min，最后冷却至60 ℃保持20 min。结束后将消解罐打开泄压，移至电热石墨消解仪中160 ℃赶酸1 h 至消解罐中保留1 mL的液体，冷却后向消解罐中加入5 mL 体积分数为50%盐酸进行还原，110 ℃还原30 min。将消解罐内液体倒入50 mL 容量瓶中，用体积分数为40%盐酸溶液定容至50 mL，必要的进行稀释测量。根据标准曲线计算样品的总硒含量（Z，μg/g）。
式中：C1 为样品消解定容稀释后的溶液浓度，μg/L；T 为样品测量前的稀释倍数；V 为样品消解后的定容体积，mL；M1 为样品富硒后生物量，g。
1.2.3 指标测定
1.2.3.1 富硒率的测定
根据标准曲线计算出样品的总硒含量，再根据富硒过程中加入的总硒含量计算富硒率（X，%）。
式中：C1 为样品消解定容稀释后的溶液浓度，μg/L；T 为样品测量前的稀释倍数；V 为样品消解后的定容体积，mL；S1 为富硒培养基中加入的无机硒量，μg。
1.2.3.2 生物量及生物量增长率的测定
将培养结束后的富硒雪莲菌从培养基中滤出，收集菌体并用无菌纯水洗涤数次，于-20 ℃预冻3 h，然后进行真空冷冻干燥，结束后立即进行称量并记录质量，生物增长率（S，%）计算公式如下。
式中：M1 为样品富硒后生物量，g；M2 为样品富硒前生物量，g。
1.2.3.3 无机硒含量的测定
向待测样品中加入8 mL 50%盐酸，通过600 W 功率进行超声45 min，超声结束后将样品放入沸水中，沸水浴30 min。然后通过8 000 r/min 离心30 min。离心结束取上清液，取上清液1 mL 进行总硒含量测定，根据稀释倍数和总硒含量标曲计算样品无机硒含量。
1.2.3.4 有机硒含量的计算
样品有机硒含量（Y，μg）和有机硒占比（B，%）计算公式如下。
式中：S1 为样品总硒总量，μg；S2 为样品无机硒含量，μg。
1.2.4 菌体透析
菌体透析用于除去富硒雪莲菌菌体表面附着的无机硒。将0.1 g 菌体与10 mL 的无菌纯水混合，置于分子量为100 Da 的透析袋中。将透析样品放入无菌纯水中静置透析，每2 h 换一次透析外液，透析48 h 后收集透析袋中的液体和菌体。将液体与菌体于-80 ℃预冻过夜，然后真空冷冻干燥后用于下一步试验或测量。
1.2.5 富硒条件优化
1.2.5.1 富硒温度、富硒时间、亚硒酸钠添加时间
设定富硒温度为20、25、28、30、35、37 ℃下富硒24 h，接种量为1%，培养基中的亚硒酸钠质量浓度为15 μg/mL，培养基体积为15 mL，考察不同富硒温度对富硒雪莲菌总硒含量的影响。
设定富硒时间为6、12、24、36、48 h，富硒温度为28 ℃，接种量为1%，培养基中的亚硒酸钠质量浓度为15 μg/mL，培养基体积为60 mL。考察不同富硒时间对富硒雪莲菌总硒含量的影响。
设定亚硒酸钠添加时间为雪莲菌接种后、3、6、9、12 h，富硒温度为28 ℃，接种量为1%，培养基中亚硒酸钠质量浓度为45 μg/mL，培养基体积为60 mL。考察不同亚硒酸钠添加时间对富硒雪莲菌总硒含量的影响。
1.2.5.2 培养方式和富硒方式
分为静置培养和160 r/min 摇床培养，富硒温度为28 ℃，接种量为1%，培养基中亚硒酸钠质量浓度为45 μg/mL，亚硒酸钠添加时间为3 h，培养基体积为60 mL。考察不同培养方式对富硒雪莲菌总硒含量、富硒率、生物量及有机硒占比的影响。
设定富硒方式分为驯化和非驯化，富硒温度为28℃，接种量为1%，培养基中亚硒酸钠质量浓度为45 μg/mL，亚硒酸钠添加时间为3 h，培养基体积为60 mL。驯化过程为梯度富硒驯化，即3 μg/mL 富硒24 h、6 μg/mL富硒24 h、9 μg/mL 富硒24 h、12 μg/mL 富硒24 h、15 μg/mL 富硒24 h。非驯化过程为菌体在45 μg/mL富硒24 h。
1.2.5.3 富硒底物浓度
初步设定富硒底物浓度为15、30、45、60、75 μg/mL，富硒温度为28 ℃，接种量为1%，培养基体积为60 mL。考察不同富硒底物浓度对富硒雪莲菌生物量、总硒含量及透析后总硒含量占比的影响。
驯化过程中设定驯化富硒质量浓度分为两种梯度，第一种梯度为3、6、9、12、15 μg/mL；第二种梯度为9、18、27、36、45 μg/mL。富硒温度为28 ℃，接种量为1%，培养基中亚硒酸钠质量浓度为45 μg/mL，亚硒酸钠添加时间为雪莲菌接种后3 h，培养基体积为60 mL。考察驯化过程中不同富硒底物浓度对富硒雪莲菌总硒含量、富硒率、生物量及有机硒占比的影响。
1.2.6 抗氧化活性测定
1.2.6.1 样品前处理方式
取雪莲菌和富硒雪莲菌各0.5 g，向其中加入5 mL蒸馏水，将菌体涡旋10 min，再通过过滤收集液体，获得菌悬液。
1.2.6.2 DPPH 自由基清除率测定
DPPH 自由基清除率测定方法参考文献[22]并稍作修改。试验所用DPPH 溶液的浓度为0.1 mol/L，用无水乙醇溶解。每0.1 mL 样品与0.9 mL DPPH 溶液混合，在室温下放置在黑暗中60 min，然后使用酶标仪在517 nm 处测量其吸光度。根据吸光度计算DPPH 自由基清除率（X1，%），计算公式如下。
式中：A1 为样品与DPPH 溶液反应后吸光度；A2为无水乙醇与DPPH 溶液混合后吸光度；A3 为样品与无水乙醇混合后吸光度。
1.2.6.3 ABTS＋自由基清除率测定
根据文献[23]的方法稍加修改。将7 mm ABTS 水溶液与2.45 mmol/L K2S2O8 等体积混合，室温静置12 h。12 h 后，用蒸馏水将ABTS 溶液稀释至734 nm 处的吸光度为0.70±0.02。将0.1 mL 不同浓度的样品溶液和0.9 mL ABTS 溶液混合。在室温黑暗条件下反应30 min后，于732 nm 处测量吸光度。ABTS＋自由基清除率（X2，%）计算公式如下。
式中：A1 为样品与ABTS 溶液反应后吸光度；A2为蒸馏水与ABTS 溶液混合后吸光度；A3 为样品与蒸馏水混合后吸光度。
1.2.6.4 羟自由基清除率测定
按照文献[24]的方法改进后进行测定。取2 mL 样品与1 mL 9 mmol/L FeSO4 和2 mL 8.8 mmol/L H2O2 均匀混合，放置10 min 后加入2 mL 9 mmol/L 水杨酸溶液，于37 ℃反应30 min，测510 nm 吸光度。羟自由基清除率（X3，%）计算公式如下。
式中：A1 为样品反应后吸光度；A2 为蒸馏水代替样品混合后吸光度；A3 为样品与蒸馏水代替H2O2 混合后吸光度。
1.3 数据分析
数据采用Microsoft Excel 软件进行统计，方差分析和显著性分析采用SPSS 18.0，结果以平均值±标准差表示，采用Duncan's 检验和独立样本T 检验计算统计学差异的显著性，P＜0.05 为显著。
2 结果与讨论
2.1 总硒含量的测定
使用原子荧光光谱法测量硒标准溶液的总硒含量，拟合建立硒标准曲线，如图1 所示。
图1 硒的标准曲线
Fig.1 Standard curve of selenium
由图1 可知，硒标准溶液样品硒浓度保持在0～20 μg/L 范围内。回归方程R2 达到0.999 8，说明仪器所测量的硒浓度和荧光强度的线性关系较好，在此线性关系范围内，可用于样品总硒含量的测定。
2.2 富硒温度、富硒时间和亚硒酸钠添加时间的确定
富硒温度、富硒时间和亚硒酸钠添加时间对总硒含量的影响见图2。
图2 富硒温度、富硒时间和亚硒酸钠添加时间对总硒含量的影响
Fig.2 Effects of temperature，time and sodium selenite addition time on total selenium content
A. 富硒温度；B. 富硒时间；C. 亚硒酸钠添加时间。不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图2A 可知，随富硒温度的升高，富硒雪莲菌的总硒含量呈现先上升后下降的趋势。在28 ℃时总硒含量显著高于其他温度。这可能与雪莲菌中微生物的活性有关，当微生物处于适宜生存环境中，其活力较高，因此对硒转化的效率最高，从而使得富硒雪莲菌总硒含量较高，28 ℃即为雪莲菌的最适生存温度，当富硒温度低于或高于28 ℃时，微生物活性较低，从而出现了随着富硒温度升高，富硒雪莲菌的总硒含量先上升后下降的现象。在富硒过程中，富硒时间的把控至关重要。由图2B 可知，随着富硒时间的延长，富硒雪莲菌的总硒含量呈现逐渐上升后趋于稳定的趋势。富硒时间达到24 h 后，总硒含量并无显著上升趋势。这说明在整个富硒过程中，雪莲菌在对培养基中的无机硒进行吸收与转化，静置培养使得雪莲菌只接触到底层培养基，在富硒24 h 时，雪莲菌已对其周围培养基中的无机硒进行充分地吸收与转化。研究表明，亚硒酸钠添加时间对菌体富硒效果有一定的影响[25]。如图2C所示，在雪莲菌接种后3 h 时，添加亚硒酸钠的富硒效果最好，样品总硒含量显著高于其他时间点。这可能是因为此时雪莲菌内部的菌群正处于活性最佳状态，对培养基内环境的改变比较敏感，能积极吸收和转化无机硒。因此，选择富硒温度为28 ℃，在接种后3 h 添加亚硒酸钠并富硒24 h 进行后续试验。
2.3 富硒底物浓度优化结果
培养基中亚硒酸钠的浓度会极大影响富硒雪莲菌的总硒含量。底物浓度对总硒含量、透析后总硒含量占比和生物量的影响见图3。
图3 富硒底物浓度对总硒含量、透析后总硒含量和生物量的影响
Fig.3 Effects of substrate concentration on the total selenium content，the total selenium content after dialysis，and biomass
A.总硒含量；B.生物量。不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3A 可知，培养基中亚硒酸钠的浓度越高，富硒雪莲菌的总硒含量越高，可见雪莲菌对亚硒酸钠有很强的吸收和吸附能力。通过将富硒样品进行透析，将样品表面吸附的无机硒除去，发现透析后样品的总硒含量占原样品的总硒含量的比例随富硒底物浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。这可能是雪莲菌菌体自身结构导致。富硒底物浓度太高时，雪莲菌将大量无机硒吸附在菌体表面，而并非吸收进菌体内部。雪莲菌是多糖-脂质-蛋白质组成的一种具有黏弹性的基质，微生物则嵌在基质表面或内部。而一些生物大分子，即多糖、脂质和蛋白质可以吸附和包裹无机硒和硒纳米颗粒[26]。当雪莲菌接触到无机硒时，多糖-脂质-蛋白质基质首先充分包裹和结合无机硒，再由微生物进行转化。因此，亚硒酸钠浓度较低时，无法使微生物充分吸收和接触无机硒，从而限制其发挥转化的作用；而随着富硒底物浓度的升高，在富硒底物浓度为45 μg/mL 时，微生物充分发挥其吸收和转化有机硒的作用；当富硒浓度再升高，雪莲菌更多是吸附无机硒，也可能将无机硒转化为单质硒而不是有机硒。
由图3B 可知，随着富硒底物浓度的增加，富硒雪莲菌的生物量呈先升高后下降的趋势。富硒浓度升高过程中，促进了雪莲菌的生长，而在浓度过高时，则抑制雪莲菌的生长。为确保富硒雪莲菌的具有较高有机硒含量和菌活性，选择富硒底物浓度为45 μg/mL。
2.4 富硒培养方式的确定
在传统制作工艺中，雪莲菌发酵一直通过静置发酵进行培养，微生物无法充分与培养基进行接触，菌活性会受限。因此本研究对比静置发酵与摇床培养对总硒含量、富硒率、生物量和有机硒占比的影响，结果见表1。
表1 培养方式对总硒含量、富硒率、生物量和有机硒占比的影响
Table 1 Effects of culture method on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage
注：* 表示具有显著差异，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01；*** 表示具有高度显著差异，P＜0.001；n.s.表示无显著差异，P＞0.05。
培养方式总硒含量/（μg/g）生物量/g富硒率/%有机硒占比/%静置培养2 647.51±173.370.12±0.0111.80±0.1275.81±3.02摇床培养3 194.24±126.33*0.14±0.01***15.58±1.42**75.84±2.04n.s.
由表1 可知，摇床富硒的样品总硒含量和富硒率显著较高。通过摇床培养，菌体得以充分接触培养基，使得生物量显著高于静置培养条件下的富硒雪莲菌。而培养方式对富硒样品中有机硒占比没有影响，还需要通过其他优化方式改善。
2.5 富硒方式的确定
有研究表明，定向驯化富硒可以提升硒耐受能力和富硒能力，提高有机硒含量[27]。为提升富硒雪莲菌的有机硒含量，本研究通过梯度驯化雪莲菌富硒，富硒方式对总硒含量、富硒率、生物量和有机硒占比的影响见表2。
表2 富硒方式对总硒含量、富硒率、生物量和有机硒占比的影响
Table 2 Effects of selenium enrichment methods on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage
注：*** 表示具有高度显著差异，P＜0.001。
富硒方式总硒含量/（μg/g）生物量/g富硒率/%有机硒占比/%驯化富硒2 194.41±58.49***0.43±0.04***35.42±4.36***84.57±1.45***非驯化富硒3 194.24±126.330.14±0.0115.58±75.8475.84±2.04
由表2 可知，富硒驯化使雪莲菌的生物量、富硒率和有机硒占比得到了极显著的提高，由于其生物量的显著提高，根据其生物量所得的总硒含量则会有一定程度的下降。结果表明，驯化富硒是一种有效提高菌体对硒耐受能力、富硒能力和硒转化效率的方法，此方法可以让雪莲菌慢慢接受含硒培养基的生存环境，并主动吸收和转化无机硒，显著提升富硒雪莲菌有机硒占比。
2.6 驯化过程中富硒底物浓度的确定
驯化过程中富硒底物浓度对总硒含量、富硒率、生物量和有机硒占比的影响见表3。
表3 驯化过程中富硒底物浓度对总硒含量、富硒率、生物量和有机硒占比的影响
Table 3 Effects of substrate concentration during domestication on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage
注：* 表示具有显著差异，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01；*** 表示具有高度显著差异，P＜0.001。
驯化最高浓度/（μg/mL）总硒含量/（μg/g）生物量/g富硒率/%有机硒占比/%152 194.41±48.490.43±0.04***35.47±0.78*84.57±1.45**459 683.73±175.55***0.27±0.0231.68±1.6375.42±1.01
由表3 可知，提高富硒驯化浓度梯度对其生物量的增长产生了抑制效果，其富硒率和有机硒占比都显著降低。试验结果表明，高浓度梯度中，18 μg/mL 的富硒浓度时菌体就出现了红色，而在低浓度梯度中并未出现红色。以上结果可知，提高富硒驯化浓度梯度，会抑制整体富硒效果，高浓度梯度富硒不仅会抑制菌体生长，降低富硒率，还会使菌体产生大量单质硒，使有机硒占比显著降低。因此确定富硒驯化浓度底物为3、6、9、12、15 μg/mL。
2.7 富硒雪莲菌优化后的基本参数
通过富硒条件优化，确定富硒雪莲菌制备的条件：富硒温度为28 ℃、富硒时间为24 h、亚硒酸钠添加时间为雪莲菌接种后3 h，通过160 r/min 摇床培养，以3、6 、9、12、15 μg/mL 梯度驯化富硒。由此得到的富硒雪莲菌的基本参数，见表4。
表4 富硒雪莲菌基本参数
Table 4 Basic parameters of selenium-enriched Tibetan kefir grains
注：*** 表示优化前后的参数具有高度显著差异（P＜0.001）。
项目总硒含量/（μg/g）生物量增长率/%富硒率/%有机硒占比/%优化前182.99±3.006.64±1.877.00±0.3766.39±3.37优化后2 194.41±58.49***262.22±34.59***35.47±0.78***84.57±1.45***
2.8 抗氧化能力分析
硒和雪莲菌均具有一定的抗氧化活性[28-29]，富硒雪莲菌的抗氧化能力测定结果见图4。
图4 抗氧化能力
Fig.4 Antioxidant capacity
*** 表示具有高度显著差异（P＜0.001）。
如图4 所示，富硒雪莲菌的抗氧化活性显著高于雪莲菌。富硒后的雪莲菌抗氧化活性较高可能是菌体本身的抗氧化活性与硒结合的结果。经过微生物将硒进行生物转化后，有机形式的硒的抗氧化活性更高[30]。
3 结论
本试验通过雪莲菌对无机硒进行吸收和转化，最终确定了富硒条件为富硒温度为28 ℃，富硒时间为24 h，亚硒酸钠添加时间为雪莲菌接种后3 h，通过160 r/min摇床培养，以3、6、9、12、15 μg/mL 梯度驯化富硒。富硒雪莲菌的菌活性、富硒率、有机硒增长比提高。优化后的富硒雪莲菌，总硒含量为（2 194.41±58.49）μg/g，生物量增长率为（262.22±34.59）%，富硒率（35.47±0.78）%，有机硒占比（84.57±1.45）%。同时富硒雪莲菌的抗氧化活性显著高于雪莲菌，达到了硒和雪莲菌有机结合的效果。制备所得的富硒雪莲菌具有更高的抗氧化活性，可进一步提升雪莲菌的开发利用价值，对扩展雪莲菌的实际应用和创新研究具有重要意义。
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