过氧化氢（H2O2）是一种绿色且不含氯的杀菌和漂白剂。目前，H2O2 已经被广泛应用于食品行业，如奶制品、啤酒、水果蔬菜、水产保鲜等[1-2]。据粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会报道，人体肠道细胞中的酶会快速分解少量的H2O2，而不产生毒理学影响。然而，摄入含有过量H2O2 的食物可能会引起细胞内H2O2 代谢水平异常，甚至导致炎症、心脑血管疾病和糖尿病等健康问题[3-4]。因此食品中H2O2 的残留检测受到研究者们广泛关注。
目前已经开发出许多方法用于检测H2O2，如电化学法[5-6]、荧光法[7-8]和比色法[9-10]。Song 等[11]在氧化铟锡电极上负载了纳米氧化锡，并通过聚硫氨酸改性制备了一种光电化学传感器，在0.03～8 mmol/L 范围内呈良好的线性关系，检出限为0.003 mmol/L。Tang 等[12]利用苯丙噻唑与H2O2 荧光发光的特性制备了一种化学传感器用于检测H2O2。在0～60 μmol/L（R2=0.994）表现出良好的线性关系，检测限为1.0×10-6 mol/L。这些传统方法虽然可以提供高的灵敏度和广泛的应用范围，但仍存在一些不足，如检测仪器比较昂贵、需要专业的操作技能、样品预处理复杂、材料合成工艺不成熟等。随着生物学研究的发展，生物酶也常被用于H2O2 的检测[13]。酶法检测H2O2 具有能够定性定量检测、快速、操作简单、选择性高的特点。Tian 等[14]利用H2O2 会抑制抗坏血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase，AAO）氧化抗坏血酸的特点，开发出一种利用个人血糖仪定量分析H2O2 的方法。该方法可以在2.5～5×103 μmol/L 的线性范围内实现对H2O2 的检测，检测限为2.5 μmol/L。
非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO）是一种来自于真菌的血红素氧化酶[15]，其能够利用H2O2将2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]快速氧化为ABTS+。而ABTS+具有可定量、易于检测的特点。2004 年来源于茶树菇（Agrocybe aegerita）的AaeUPO 首次被Ullrich 等[16]发现并报道。目前，在基因组测序的真菌中已经发现数千个UPO 序列，但只有少数野生型酶和少数重组表达的UPO 已被表征并用于实验室规模的研究[17-18]。而重组发酵获得的UPO 存在表达量低，无法大规模制备的困境。
针对上述问题，本文对已经成功表达AaeUPO 的毕赤酵母GS115 进行发酵工艺优化，提高毕赤酵母中AaeUPO 的重组表达量。通过摇瓶水平单因素试验和正交试验确定最佳培养基成分，利用5 L 发酵罐发酵优化工艺条件并实现初步的放大生产。然后将AaeUPO应用于对H2O2 的高效检测，以期为食品中H2O2 的检测提供新的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
AaeUPO 菌株：由河北工业大学生物催化与转化实验室构建的基因工程菌P.pastoris/pPIC9k/PaDa-I；甲醇、ABTS、甘油：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾：天津市风船化学试剂科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、生物素、无氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）：北京奥博星生物技术有限责任公司。
BMGY 培养基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素4×10-4 g/L、甘油10 g/L，使用100 mmol/L磷酸钾缓冲溶液配制。BMMY 培养基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素4×10-4 g/L、甲醇10 g/L，使用100 mmol/L 磷酸钾缓冲溶液配制。其中，YNB、生物素和甲醇在培养基灭菌（121 ℃下灭菌锅灭菌）后使用0.22 μm 水系滤膜除菌后加入。
1.2 仪器与设备
台式高速离心机（TG18G）：盐城市凯特实验仪器有限公司；5 L 玻璃发酵罐（GS-F2005AG）：上海顾信生物科技有限公司；智能恒温摇床（HNY-202T）：天津欧诺仪器股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（GI54T）：致微（厦门）仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-1100）：上海美普达仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酶活测定方法
将AaeUPO 粗酶液200 μL 与柠檬酸缓冲液（100 mmol/L，pH4.4）1 560 μL 混合并加入40 μL H2O2（2 mmol/L）反应30 s，于420 nm 处测量混合液吸光度，将结果与ABTS 溶液标准曲线对照。每分钟催化形成1 μmol ABTS+的AaeUPO 的量定义为1 U。粗酶液酶活（A，U/mL）的计算公式如下。
式中：B 为绝对酶活，U；V 为粗酶液体积，mL。
1.3.2 AaeUPO 摇瓶培养方法
将甘油菌（1%接种量）接种至BMGY 培养基中，在恒温摇床中在30 ℃、220 r/min 条件下培养16～18 h，当培养基菌液在600 nm 处的吸光度大于2.0 后对菌液离心（25 ℃，7 000 r/min）。用BMMY 培养基对毕赤酵母重悬，在30 ℃、220 r/min 条件下进行诱导表达，随后每隔24 h 添加1 次甲醇，持续5 d。诱导结束后离心（25 ℃，8 000 r/min）发酵液，收集上清液对AaeUPO 活性进行检测。
1.3.3 AaeUPO 发酵罐培养方法
在5 L 发酵罐中配制一定体积的BMGY 培养基并灭菌，将摇瓶培养的种子液按照一定体积分数接入到5 L 发酵罐中。固定转速为400 r/min，通气量为6 L/min，罐内温度设置为30 ℃。培养24 h 待甘油耗尽后饥饿处理1 h，加入甲醇继续培养5 d，之后每隔12 h 检测1 次相关指标，每隔24 h 添加甲醇。
1.3.4 H2O2 标准曲线测定
将200 μL AaeUPO 粗酶液溶于1 560 μL pH4.4 的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，加入200 μL ABTS 溶液，再依次加入40 μL 一系列不同浓度的H2O2 溶液，混合后反应3 min，于420 nm 处测定吸光度。
1.3.5 摇瓶水平单因素试验
以BMGY 培养基扩大培养，BMMY 培养基诱导表达。对培养基中的主要成分进行优化，以AaeUPO 酶活作为评价标准。选取培养基初始pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、甲醇浓度（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%）、酵母粉浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和蛋白胨浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）4 个因素，进行单因素优化试验。
1.3.6 摇瓶水平正交试验
选取影响较大的因素设计四因素三水平正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests
水平A 甲醇浓度/% B 培养基初始pH 值 C 蛋白胨浓度/%10.755.01.5 21.005.52.0 31.256.02.5
1.3.7 5 L 发酵罐水平试验的优化
利用优化后的培养基条件，进行5 L 发酵罐放大试验，依次从接种量（8%、10%、12%）、诱导温度（28、30、32 ℃）、甲醇添加方式（分批加入、流加）对发酵过程进行优化。
1.4 干扰试验及加标回收试验
干扰试验方法：在0.25 mmol/L 的Fe2（SO4）3、K2SO4、（NH4）2SO4 和0.5 mmol/L 的ZnSO3、Na2CO3 溶液中分别加入H2O2 使其终浓度为50 μmol/L，检测混合后溶液中的H2O2 浓度。
加标回收试验方法：在蒸馏水、矿泉水、啤酒中分别加入终浓度0、10、20、30 μmol/L 的H2O2 标准溶液，混匀后对样品进行测定。回收率（P，%）计算公式如下。
式中：M 为加标试样测定值，μmol/L；M0 为试样测定值，μmol/L；Q 为加标量，μmol/L。
1.5 数据处理
采用Origin 2021 对数据进行处理并作图。
2 结果与分析
2.1 AaeUPO 的蛋白电泳结果
聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）结果如图1所示。
图1 AaeUPO 的蛋白电泳图
Fig.1 Electrophoretic diagram of AaeUPO protein
M.Marker；1.AaeUPO 酶液。
由图1 可知，在大约46 kDa 处有明显的目的条带，这与AaeUPO 的理论大小相符。表明AaeUPO 在毕赤酵母中成功重组表达，接下来对其发酵条件进行优化。
2.2 培养基优化结果
2.2.1 甲醇浓度对AaeUPO 表达的影响
甲醇浓度对AaeUPO 表达的影响见图2。
图2 甲醇浓度对AaeUPO 表达的影响
Fig.2 Effect of methanol concentration on expression of AaeUPO
由图2 可知，当甲醇浓度为1.00%时，毕赤酵母对AaeUPO 表达情况最好，粗酶液酶活达到了13.1 U/mL。诱导表达阶段，毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源。甲醇浓度低，诱导效果差，得不到足够的碳源，菌株生长缓慢。当甲醇浓度过高时，甲醇作为一种有机小分子又会对毕赤酵母产生毒害作用[19]。此外，甲醇代谢产生的甲醛、甲酸等小分子也会对生物体的正常代谢产生影响。因此，后续选用1.00%甲醇浓度作为最佳培养条件。
2.2.2 培养基初始pH 值对AaeUPO 表达的影响
培养基初始pH 值对AaeUPO 表达的影响见图3。
图3 培养基初始pH 值对AaeUPO 表达的影响
Fig.3 Effect of pH of medium on AaeUPO expression
由图3 可知，随着培养基初始pH 值的增加，粗酶液酶活呈先升高后降低的趋势。pH5.5 时粗酶液酶活最高，达到14.3 U/mL。毕赤酵母的生长pH 值范围为2.0～7.5，最适生长pH 值为4.8～5.2。pH 值过高不利于毕赤酵母的生长。此外，当pH 值较高时培养基中蛋白水解酶的活性较高，会导致AaeUPO 的分解[20]。而过低的pH 值对目标基因的表达不利，影响培养基中粗酶液的活性。因此，选取pH5.5 作为最佳培养基初始pH值。
2.2.3 营养物质对AaeUPO 表达的影响
营养物质对AaeUPO 表达的影响见图4。
图4 营养物质对AaeUPO 表达的影响
Fig.4 Effect of nutrients on AaeUPO expression
（a）蛋白胨浓度；（b）酵母粉浓度。
由图4 可知，随着酵母粉浓度和蛋白胨浓度的增加，粗酶液中AaeUPO 的活性呈现先上升后下降的趋势，但酵母粉浓度的影响不明显。当蛋白胨浓度为2.0%时，粗酶液酶活最高。随后对酵母粉浓度进行优化，酵母粉浓度为1.5%时，粗酶液酶活达到最高值，为15.6 U/mL。当酵母粉和蛋白胨浓度较低时，毕赤酵母生长缓慢，酶活性较低；浓度较高时，培养基中会存在大量的氨基酸，对目标基因的表达产生不利的影响。综上，最佳的蛋白胨浓度为2.0%、最佳的酵母粉浓度为1.5%。
2.2.4 正交优化试验结果分析
正交试验设计与结果见表2。
表2 正交试验设计与结果
Table 2 Design and results of orthogonal tests
试验号A 甲醇浓度因素粗酶液酶活/（U/mL）B 培养基初始pH 值C 蛋白胨浓度D 空列1111110.643 2122213.819 313339.732 421239.658 5223117.314 6231214.911 7313210.106 8321313.997 9332115.387 k111.39810.13514.44813.184 k213.96115.04312.94512.955 k313.16313.34311.12912.384 R2.5634.9083.3190.080
由表2 可知，影响发酵过程的主次顺序为培养基初始pH 值>蛋白胨浓度>甲醇浓度。通过比较k 值可以得到最佳组合为A2B2C1，即甲醇浓度1.00%、培养基初始pH5.5、蛋白胨浓度1.5%。
2.2.5 验证试验
对A2B2C1 与A2B2C3 进行验证，组合A2B2C1 粗酶液酶活为18.2 U/mL，高于组合A2B2C3，因此为最优组合。
2.3 5 L 发酵罐发酵条件优化
2.3.1 接种量对AaeUPO 表达的影响
接种量对AaeUPO 表达的影响见图5。
图5 接种量对AaeUPO 表达的影响
Fig.5 Effect of inoculation amount on AaeUPO expression
由图5 可知，接种量会影响菌体的生长曲线。接种量越高，相同时间内发酵罐中的菌体浓度就越大。但通过酶活的测定结果可以看出，并不是接种量越高，最终发酵完成的酶活力就越高。接种量会对毕赤酵母的对数成长阶段产生影响。接种量过低，发酵培养时间过长，发酵过程中动力的消耗会增加，并且有染杂菌的风险。接种量过高会导致发酵前期菌体生长过于旺盛，代谢产物增多，造成菌体的早衰。此外，接种量过高也会消耗大量的营养物质，从而影响对目的蛋白的合成。综上，以10%作为最适接种量。
2.3.2 诱导温度对AaeUPO 表达的影响
诱导温度对AaeUPO 表达的影响见图6。
图6 诱导温度对AaeUPO 表达的影响
Fig.6 Effect of induction temperature on AaeUPO expression
由图6 可知，当发酵培养168 h、诱导温度为30 ℃时AaeUPO 的表达量最高。毕赤酵母最适生长温度为30 ℃，当温度为28 ℃和32 ℃时菌体生长缓慢。发酵过程中的菌体生长、目的蛋白合成以及发酵液的理化性质均会受诱导温度的影响。诱导温度过高或过低都不利于菌体的正常生长和目标基因的表达，最终选择30 ℃作为最佳诱导温度。
2.3.3 甲醇添加方式对AaeUPO 表达的影响
甲醇添加方式对AaeUPO 表达的影响见图7。
图7 甲醇添加方式对AaeUPO 表达的影响
Fig.7 Effect of methanol adding method on expression of AaeUPO
由图7 可知，甲醇添加方式也会对毕赤酵母的表达有很大的影响。将分批加入甲醇（即每隔24 h 添加1 次）的方式优化为流加甲醇的方式，获得的粗酶液最终酶活由20.8 U/mL 提升至25.1 U/mL。毕赤酵母表达阶段以甲醇作为唯一碳源，但当甲醇浓度过高时会对毕赤酵母活性造成损伤，进而影响酶活。通过流加甲醇可以实现甲醇长时间低浓度供应，既保证了碳源的供给，又能减少高浓度甲醇对菌株的损伤。
2.4 优化前后粗酶液酶活的对比
优化前后粗酶液酶活的对比结果见图8。
图8 优化前后的粗酶液酶活
Fig.8 Comparison of activities of crude enzyme before and after optimization
由图8 可知，优化前粗酶液酶活仅有13.1 U/mL。经过在摇瓶水平对培养基成分进行优化，最高酶活为18.2 U/mL。在最佳培养基的条件下，进行5 L 发酵罐放大试验，并对发酵条件及工艺进行优化。最优的发酵条件为甲醇浓度1.00%、培养基初始pH5.5、蛋白胨浓度1.5%、酵母粉浓度1.5%、接种量10%、诱导温度30 ℃、流加甲醇。优化后得到的最高酶活为25.1 U/mL，细胞湿重244 g/L。相较于未优化单位粗酶液酶活提升了91.6%，对中试具有一定的指导意义。
2.5 AaeUPO 在H2O2 检测中的应用
2.5.1 H2O2 标准曲线的绘制
H2O2 标准曲线见图9。
图9 H2O2 标准曲线
Fig.9 Working curve of H2O2
由图9 可知，采用AaeUPO 检测H2O2，在H2O2 浓度5～80 μmol/L 范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=0.028 37x+0.006 71，相关系数R2=0.994 62。按照试验方法平行20 次测定空白试剂，标准偏差为0.04，并由此计算出H2O2 最低检测限为5 μmol/L。
2.5.2 干扰试验
当H2O2 浓度为50 μmol/L 时，设定相对误差不大于5%。添加10 倍浓度的Fe3+、Zn2+、K+、Na+、NH4+、CO32-、SO42-、SO32-均不会影响测定结果。
2.5.3 加标回收试验
对3 个试剂样品进行相同程序的加标回收试验，分析结果见表3。
表3 样品回收试验
Table 3 Sample recovery experiment
注：-表示数值低于0.1。
样品加标量/（μmol/L）（μmol/L） 回收率/% 标准偏差/%蒸馏水0---109.595.40.9 2018.693.21.3 3028.896.11.1矿泉水0---109.393.00.8 2019.195.72.1 3028.695.31.7啤酒06.4-1.4 1015.288.42.2 2023.485.12.6 3032.787.72.5加标测定值/
由表3 可知，在蒸馏水和矿泉水中未检测到H2O2，在啤酒中检测到H2O2 浓度为6.4 μmol/L。此外，3 种不同浓度的H2O2 加标回收试验的回收率为85.1%～96.1%，表明使用AaeUPO 检测H2O2 具有很好的适用性，可用于实际样品的检测。
3 结论
本试验通过摇瓶水平发酵优化了甲醇浓度、培养基初始pH 值、酵母粉浓度和蛋白胨浓度，通过正交试验确定了毕赤酵母摇瓶水平高效表达AaeUPO 的基本发酵条件：甲醇浓度1.00%、培养基初始pH5.5、蛋白胨浓度1.5%、酵母粉浓度1.5%。根据验证试验，得出最优发酵条件下粗酶液酶活达到18.2 U/mL。在摇瓶水平发酵试验的基础上进行5 L 发酵罐放大试验，优化后以接种量10%、诱导温度30 ℃、流加甲醇作为最终工艺条件。最终得到的细胞湿重244 g/L，最高酶活为25.1 U/mL，相较于初期未优化酶活提升了91.6%。将AaeUPO 用于实际样品的H2O2 检测，结果表明，AaeUPO对于H2O2 具有较好的检测性能，检测限达到5 μmol/L，抗干扰性能强。
[1] DUONG H D,RHEE J I.Development of ratiometric fluorescence sensors based on CdSe/ZnS quantum dots for the detection of hydrogen peroxide[J].Sensors,2019,19(22):4977.
[2] LIU T,ZHANG S X,LIU W,et al.Smartphone based platform for ratiometric fluorometric and colorimetric determination H2O2 and glucose[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2020,305:127524.
[3] LU C F,WANG Y,XU B Y,et al.A colorimetric and fluorescence dual-signal determination for iron(II)and H2O2 in food based on sulfur quantum dots[J].Food Chemistry,2022,366:130613.
[4] LUO S,KAN X W.Specifically triggered dissociation based ratiometric electrochemical sensor for H2O2 measurement in food samples[J].Food Chemistry,2022,387:132922.
[5] DANG W J,SUN Y M,JIAO H,et al.AuNPs-NH2/Cu-MOF modified glassy carbon electrode as enzyme-free electrochemical sensor detecting H2O2[J].Journal of Electroanalytical Chemistry,2020,856:113592.
[6] DING X,WANG F X,HU H,et al.Tea-polyphenol green fabricating catkin-like CuAg for electrochemical H2O2 detection[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2022,219:112827.
[7] ZENG X D,JIANG C,ZHANG Q,et al.A novel simple fluorescent probe for the detection of hydrogen peroxide in vivo with high selectivity[J].Journal of Luminescence,2021,240:118422.
[8] LIU Y,YAN J H,HUANG Y,et al.Single-atom Fe-anchored nanodiamond with enhanced dual-enzyme mimicking performance for H2O2 and glutathione detection[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2022,9:790849.
[9] LU J T,ZHANG H W,LI S,et al.Oxygen-vacancy-enhanced peroxidase-like activity of reduced Co3O4 nanocomposites for the colorimetric detection of H2O2 and glucose[J].Inorganic Chemistry,2020,59(5):3152-3159.
[10] YE H Z,DING Y L,LIU T T,et al.Colorimetric assay based on NiCo2S4@N,S-rGO nanozyme for sensitive detection of H2O2 and glucose in serum and urine samples[J].RSC Advances,2022,12(32):20838-20849.
[11] SONG Y,WANG C T,SHA J C,et al.Photoelectrochemical sensor based on the sensitive interface of photosensitive electrode for the detection of hydrogen peroxide in dried bean curds[J].Journal of Food Composition and Analysis,2023,119:105237.
[12] TANG J Y,LI F L,LIU C,et al.Attractive benzothiazole-based fluorescence probe for the highly efficient detection of hydrogen peroxide[J].Analytica Chimica Acta,2022,1214:339939.
[13] GELEN S S,MUNKHBAT T,REXHEPI Z,et al.Catalase-conjugated surfaces:H2O2 detection based on quenching of tryptophan fluorescence on conducting polymers[J].European Polymer Journal,2021,142:110130.
[14] TIAN T,ZHANG H,YANG F Q.Ascorbate oxidase enabling glucometer readout for portable detection of hydrogen peroxide[J].Enzyme and Microbial Technology,2022,160:110096.
[15] BELTRÁN-NOGAL A,SÁNCHEZ-MORENO I,MÉNDEZ-SÁNCHEZ D,et al.Surfing the wave of oxyfunctionalization chemistry by engineering fungal unspecific peroxygenases[J].Current Opinion in Structural Biology,2022,73:102342.
[16] ULLRICH R,NUÜSKE J,SCHEIBNER K,et al.Novel haloperoxidase from the agaric basidiomycete Agrocybe aegerita oxidizes aryl alcohols and aldehydes[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(8):4575-4581.
[17] JACOB S,BORMANN S,BECKER M,et al.Magnaporthe oryzae as an expression host for the production of the unspecific peroxygenase AaeUPO from the basidiomycete Agrocybe aegerita[J].MicrobiologyOpen,2021,10(6):e1229.
[18] FAIZA M,LAN D M,HUANG S F,et al.UPObase:An online database of unspecific peroxygenases[J].Database: the Journal of Biological Databases and Curation,2019,2019:baz122.
[19] JIA L Q,LI T,YANG Z Q,et al.Enhancing monellin production in Pichia pastoris fed-batch fermentation through an efficient on-line methanol/sorbitol co-feeding strategy[J].Journal of Cleaner Production,2022,369:133350.
[20] JAHIC M,WALLBERG F,BOLLOK M,et al.Temperature limited fed-batch technique for control of proteolysis in Pichia pastoris bioreactor cultures[J].Microbial Cell Factories,2003,2(1):6.