玉米淀粉生产工艺包括湿法工艺和干法工艺，干法工艺中的脂肪和蛋白质含量高，但淀粉纯度较低，所以大部分工厂普遍采用湿法工艺制备玉米淀粉[1]。湿法工艺又分为静止浸泡法和逆流浸泡法，静止浸泡法操作简单，但随着浸泡时间的延长，浸泡液中的渗透作用逐渐达到平衡，玉米粒中的可溶性物质不再析出，导致玉米淀粉提取率较低，所以此方法不适用于工厂。逆流浸泡法又称扩散法，由若干个浸泡罐、管道和泵组成，多个浸泡罐利用管道串联在一起，形成浸泡罐装置，通过装置的连接作用，使浸泡液沿着装玉米相反的方向流动[2]。逆流浸泡法可以使新鲜的玉米籽粒中所包含的可溶性物质与浸泡液溶液的浓度差始终保持在一个恒定的状态，充分提取玉米中的可溶性物质[3]，相比于静止浸泡法，逆流浸泡法能提高玉米淀粉的提取率。因此，逆流浸泡法被大多数工厂采用[4]。
玉米浸泡液是玉米粒在玉米淀粉生产过程中，通过湿法工艺得到的玉米加工副产物[5]。在浸泡过程中玉米浸泡液会产生大量微生物，特定的浸泡环境会使微生物大量繁殖，主要包括乳杆菌、短粗杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等。其中乳酸菌在玉米淀粉提取阶段起主要作用，乳酸菌产生的乳酸，在浸泡过程中也起着重要的作用。玉米颗粒中的蛋白质，在维持浸泡过程中的Ca 和Mg 金属离子浓度的同时，还能促进乳酸引起的玉米粒的膨胀和转换，减少不溶性物质沉淀[6]。刘庆艾等[7]从玉米浸泡液筛选乳酸菌再加入到玉米浸泡液中，使得玉米淀粉提取率从59.22%提高到63.23%，浸泡周期从传统的20 h 减少为10 h。丛泽峰等[8]的研究表明人为添加乳酸菌到玉米浸泡液中，既会提高玉米浸泡液的质量，同时也会缩短浸泡周期。可见玉米浸泡液中的微生物多样性和菌群结构对于改善玉米淀粉提取工艺帮助较大。
本研究利用Illumina MiSeq 高通量测序技术对玉米浸泡副产物中的新、老酸玉米浸泡液进行细菌16S rRNA V3～V4 测序，获得玉米浸泡液新酸、老酸中细菌菌群结构的组成及微生物多样性，为玉米逆流浸泡阶段的研究和提取玉米淀粉工艺改进和优化提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
随机采集市售的不同批次老酸玉米浸泡液和新酸玉米浸泡液，新酸的SO2 含量为1 300～1 500 mg/L，固形物少，老酸中SO2 含量为80～120 mg/L，固形物多，浸泡温度均为49～52 ℃。X 代表老酸，L 代表新酸，每个样品取3 个生物学重复，样品信息见表1。
表1 样品名称及分组信息
Table 1 Sample names and group assignment
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E.Z.N.A.® Soil DNA Kit 试剂盒：美国Omega Bio-tek 公司；琼脂糖：西班牙biowest 公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒：美国Axygen 公司；建库试剂盒：美国Bioo Scientific 公司；MiSeq Reagent Kit 测序试剂盒：美国Illumina 公司。
1.2 仪器与设备
5430 R 小型离心机、5424R 高速台式冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；NanoDrop2000 超微量分光光度计：美国Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-6C 电泳仪：北京市六一仪器厂；BioTek ELx800 酶标仪：美国Biotek 公司；ABI GeneAmp ® 9700 型聚合酶链反应核酸扩增仪：美国ABI 公司；Illumina Miseq 测序仪：美国Illumina 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品前处理
将玉米浸泡液灌装至500 mL 无菌蓝盖瓶中，低温条件下运送至实验室，于-80 ℃冰箱保存，备用。
1.3.2 DNA 提取
玉米浸泡液中微生物总DNA 的提取按照E.Z.N.A.® SoilDNAKit 试剂盒操作指导书进行。吸取3μL DNA利用超微量分光光度计测定样品OD 值，计算DNA纯度，以电泳仪检测核酸样本的完整性，将检测合格的DNA 提取物置于-20 ℃备用。
1.3.3 聚合酶链反应核酸扩增
参考邓高文等[9]的方法进行样品细菌16S rRNA聚合酶链式反应扩增及高通量测序Illumina MiSeq，使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）通用引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。将PCR 产物合格的样品送至上海美吉生物技术有限公司进行高通量测序。
1.4 数据分析
采用Illumina Miseq 的Miseq PE300 平台测序，将测序得到的序列进行拼接和过滤，按照97%的相似度进行操作分类，使用OTU 分类单位（operational taxonomic units，OTU）[10]。
2 结果与分析
2.1 玉米浸泡液菌群α 多样性分析
玉米浸泡液细菌α 多样性指数测定结果见表2。
表2 玉米浸泡液细菌α 多样性指数测定结果
Table 2 Bacterial α-diversity indexes in corn soaking solution
样品 有效序列/条覆盖率X-2 42 102 386 446.33 367.131.240.980.99 X-3 41 679 888 395.95 377.641.870.990.99 X-4 39 779 346 290.44 269.441.350.990.99 L-2 39 922 4869.35 60.000.050.560.99 L-3 39 800 1729.07 26.000.010.260.99 L-4 38 896 3381.51 54.330.020.480.99 OTU数/个ACE指数Chao指数Shannon指数Simpson指数
由表2 可知，在不同的玉米浸泡液样本中进行测序，得到的有效序列242 178 条，其中覆盖率均达到了0.99，试验数据表明覆盖率高，测序深度可靠，所测序结果能够真实反映玉米浸泡液中新酸、老酸样品的细菌群落组成。
α 多样性通常用以下指数来评估[11]，一是样品物种的丰度（包括Chao 指数和ACE 指数），二是物种的多样性（包括Shannon 指数和Simpson 指数），老酸中的Chao 指数比新酸更高，可能是因为随着浸泡时间的延长，浸泡液中的pH 值不断升高，浸泡环境呈酸性，导致不耐受酸性的细菌逐渐消失，所以新酸样品中细菌的群落丰度和多样性降低。
另外Shannon 指数和Simpson 指数反映了样本物种的多样性，Shannon 指数逐渐增大，代表样本指数多样性越高。由测序结果可见，玉米浸泡液老酸中的Shannon 指数高于新酸，可见玉米浸泡液样品老酸中的菌群多样性大于新酸。
2.2 菌群结构分析
2.2.1 基于门水平玉米浸泡液中群落结构分析
在门水平上，图1 显示了根据丰度水平排名前10的物种，其他物种均被合并为其他。
图1 基于门水平玉米浸泡液的细菌群落结构
Fig.1 Bacterial community structure in corn soaking solution at the phylum level
从图1 可以看出，优势菌门有厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）。在样品中均检测出厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度均大于50%，表明在玉米浸泡液的浸泡过程中，厚壁菌门占主导地位，这也是因为厚壁菌门的部分厌氧菌可以在低氧、酸性和高酒精的环境中可以生存[12]，其中属于厚壁菌门中的乳酸菌也可以在低氧、低酸的环境下生长，由此可见，厚壁菌门在玉米浸泡的第一阶段起着重要作用。
2.2.2 基于目水平玉米浸泡液中群落结构分析
基于目水平玉米浸泡液的细菌群落结构见图2。
图2 基于目水平玉米浸泡液的细菌群落结构
Fig.2 Bacterial community structure in corn soaking solution at the order level
如图2 所示，在目水平上，根据物种注释结果，采用最大值排序法，选取在目水平最大丰度排名前10 的物种，老酸中有乳酸杆菌目（Lactobacillales）、芽孢杆菌目（Bacillales）、棒状杆菌目（Corynebacteriales）、伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）、类芽孢杆菌目（Paenibacillales）、梭菌目（Clostridiales）等，新酸中主要以乳酸杆菌目（Lactobacillales）为主。可见在玉米逆流浸泡的过程，新酸、老酸中主要以乳酸杆菌目为主。研究表明，在逆流浸泡阶段，乳酸菌占主导地位，乳酸菌在生产过程中产乳酸，乳酸可以破坏玉米籽粒中的蛋白质结构，使得可溶性物质析出，从而提高玉米淀粉的产率[13]。在浸泡过程中，乳酸杆菌目这类菌种与亚硫酸共同作用，能改善浸泡周期过长的缺点，促进淀粉与蛋白质分离，提高玉米淀粉产量。此外，也有研究证明，破坏蛋白质与淀粉颗粒的结合，从而使蛋白能更好地溶出[14]。
2.2.3 基于属水平玉米浸泡液中群落结构分析
基于属水平玉米浸泡液的细菌群落结构见图3。
图3 基于属水平玉米浸泡液的细菌群落结构
Fig.3 Bacterial community structure in corn soaking solution at the genus level
从图3 可以看出，老酸样品中相对丰度最高的属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）。新酸中主要测到了乳酸杆菌属（Lactobacillus），可见玉米浸泡液主要优势菌为乳酸杆菌属。乳酸菌在玉米浸泡过程中发挥着重要作用，乳酸菌大多是厌氧菌或是部分厌氧的细菌[15]，在浸泡期间可以在厌氧条件下生长和繁殖，它在发酵过程中具有重要的生物结构调节功能[16]，随着玉米浸泡发酵期延长，在发酵体系中乙醇的浓度和酸度不断地上升，含氧量逐渐下降，几乎所有无法承受高酸度、高乙醇浓度和厌氧条件的微生物均逐渐减少，乳酸菌成为绝对优势菌。优势乳酸菌从糖类中产生乳酸和乙酸，造成浸泡液中的pH 值升高，高浓度的酸性环境会抑制其他细菌的生长繁殖，同时，乳酸菌可以产生细菌素等拮抗物质，通过与其他微生物竞争底物来影响其他微生物的生长[17-19]，乳酸菌还能降解其中的蛋白质，使浸泡液中的不可溶性物质转变为可溶物质，更利于后续的清洗工作[20]。因此，乳酸菌在浸泡过程中占有绝对优势。
3 结论
本试验利用Illumina MiSeq 高通量测序技术对玉米淀粉逆流浸泡阶段中的新酸、老酸玉米浸泡液样品中的微生物多样性进行分析，发现乳酸菌（Lactobacillus）在两种样品中均存在，说明在玉米浸泡这个重要阶段乳酸菌（Lactobacillus）占据主导地位。研究表明，乳酸菌（Lactobacillus）影响玉米浸泡液的质量从而影响玉米淀粉的提取质量。本研究为玉米淀粉生产工艺优化提供了参考，同时为筛选玉米浸泡液中的优势菌群奠定基础。
试验结果表明，老酸浸泡液的细菌含量比新酸更丰富。原因可能为老酸浸泡液中营养物质丰富，细菌在此条件下不断生长繁殖；随着浸泡时间的延长，浸泡环境逐渐呈酸性，酸性条件会抑制杂菌的生长，细菌丰度降低。因此，与老酸相比，新酸中的细菌群落降低。
SO2 浓度随着浸泡时间的延长而增加，亚硫酸浓度增加，首先通过胚芽作用于玉米皮，使胚芽变钝，表皮由半渗透膜变为渗透膜，便于谷物中可溶性物质浸出到玉米浸泡液中。添加亚硫酸被用来作为减少玉米浸泡中的可溶性物质的手段，其作用是将玉米粒中的一些不溶性蛋白质转化为可溶性蛋白质，从而提高玉米淀粉的提取率。同时浸泡玉米的最佳温度为50 ℃左右，一些细菌不能在高温下生长，因此可以通过减少在50 ℃环境下不能生长的致病和有害细菌，提高玉米淀粉的质量。
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