中国美味蘑菇又称红柳菇[1]、地层菇、沙菇等，属担子菌纲（Homobasidiomycetidae）伞菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇属（Agaricus）[2-3]，其生长地区较为狭窄，高适生区位于我国西北部及中亚地区。国内主要分布在新疆天山山脉南北两侧区域、西藏西南部、青海海西州、甘肃西北部和内蒙古西部地区[4]。中国美味蘑菇是一种抗旱性强和耐低温的珍贵野生菌，生长环境具有诸多特殊性，如昼夜温差大、光照时间较长、多生长在荒漠盐碱草原等[5]。Wang 等[6]于2015年通过形态学和系统遗传学的比较鉴定后，将采集于中国新疆维吾尔自治区艾比湖附近的样本命名为中国美味蘑菇。据调查，位于新疆的博斯腾湖曾是美味蘑菇的主产区，但在2016 年后，由于湖水上涨、适生区域狭窄等自然原因使其数量日趋减少，菌种濒临灭绝[4]。
中国美味蘑菇子实体肥大，菌肉肥厚，味道鲜美，是一种高蛋白、高矿物质、低脂肪的食用菌，含有大量对人体有益的矿质元素（钙、铁、镁、钠、钾、硫、磷）以及维生素B2、维生素B3，子实体中的8 种必需氨基酸含量占其氨基酸总量的40.5%，对调节人体生理机能具有重要作用[7-9]。研究表明，美味蘑菇对Hela 细胞的增殖有显著的抑制作用，其中的活性成分有可能发展成为抗宫颈癌治疗的化疗药物[10]。中国美味蘑菇在亲缘关系上与世界广泛栽培的双孢蘑菇较为接近[11]，是一个在生产上很有潜力的食用菌新品种。近年来，在野生食用菌资源开发力度不断加大和生态环境的双重压力下，越来越多的野生菌种濒临灭绝。为了避免这一情况的发生，野生菌的人工驯化栽培工作迫在眉睫。中华美味蘑菇作为狭域种，野生资源十分有限，虽已实现人工实验室驯化，但大面积栽培的技术尚不成熟，总体产量较低，生长周期较长，并且不能进行商业化栽培[12]。野生食用菌的鉴定和分类是人们认识、开发和掌握野生食用菌的重要手段。对于野生食用菌的鉴定是学者了解研究和开发利用它们的前提。如有毒的野生菌被误食会给人们的健康带来巨大伤害。同时，由于食用菌引种频繁现象的出现，再加上其无性繁殖导致的外观形态的分化不明确，严重影响了我国食用菌资源的管理和开发利用[13]。本研究以采自青海1 株野生口蘑菌株为研究对象，进行真菌种属（internally transcribed spacer，ITS）鉴定测序及同源序列比对，鉴定其种属，确定分类学地位，进而对其生物学特性进行研究，旨在为其后续商业化栽培提供参考依据。同时，对野生食用菌驯化栽培工作及后续的开发利用也具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 菌株、材料与试剂
1.1.1 供试菌株与培养基配方设计
野生口蘑子实体采自青海牧民区，采集于废弃的羊圈内，由河北工程大学食用菌实验室进行菌种分离和保藏，菌株编号为ZX。
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）综合培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g，水1 000 mL。
培养基Ⅰ：马铃薯（去皮）200 g，羊粪100 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g，水1 000 mL。
培养基Ⅱ：马铃薯（去皮）200 g，酵母粉5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g，水1 000 mL。
培养基Ⅲ：羊粪200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g，水1 000 mL。
1.1.2 材料与试剂
马铃薯（去皮）：市售；琼脂、酵母浸粉（均为分析纯）：北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸镁（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；麦芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、蛋白胨、硝酸钾、尿素、硫酸铵、氯化钾、氯化钠、无水碳酸钙、无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钾、0.25%溴酚蓝（均为分析纯）、50×三羟甲基氨基甲烷、乙酸-乙二胺四乙酸（tris acetate-EDTA，TAE）缓冲液：生工生物工程（上海）股份有限公司；VB1、VB2、VB6、VC：华中药业股份有限公司；脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：天根生化科技北京有限公司。
1.2 仪器与设备
TGL-22 台式高速冷冻离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）循环扩增仪：伯乐生命医学产品有限公司；DYC2-24EN 型双垂直电泳仪：北京市六一仪器厂；JY04-3E 凝胶成像分析系统：北京君意东方电泳设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种分离
在超净工作台内，使用酒精棉球擦拭供试菌株子实体表面进行消毒；将子实体纵向掰开，用无菌的镊子在菌盖与菌柄相连接的部分取下约4 mm 的子实体块，并将其接种到PDA 综合培养基试管斜面中央，于25 ℃黑暗条件下培养14 d 后，使用灭菌的接种针挑取菌丝生长状况良好的菌丝进行转接纯化，将新的平板置于25 ℃恒温培养箱黑暗条件培养后，放到4 ℃冰箱内保存备用[14]。
1.3.2 形态学鉴定
观察子实体的菌盖、菌褶、菌柄、菌环等主要部分，菌落的形状和颜色，以及菌丝的形态，参照比对《中国食用菌百科》、《中国真菌志》[15]中对口蘑的描述进行形态学鉴定。
1.3.3 ITS 鉴定
将供试菌种活化后，采用PDA 固体培养基平板，铺玻璃纸隔膜培养菌丝体，菌丝长满平板后刮取菌丝，采用DNA 试剂盒提取菌丝体DNA，并利用ITS 通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATTGATATGC-3'）对其进行聚合酶链式反应扩增，扩增体系：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸50 s，共33 个循环；72 ℃10 min；终止温度为4 ℃。之后将扩增产物进行测序，将得到的序列在NCBI 库中进行BLAST 比对，之后采用MEGA 6.0 软件对该序列以Neighbor-joining法构建系统发育树，进行同源关系比较后作图[16-17]。
1.3.4 适宜母种培养基配方确定
用打孔器取活化好的平板边缘菌丝，分别接种1.1.1 中4 种设计好的培养基中，以PDA 培养基为对照（CK），25 ℃恒温黑暗条件下培养，各处理重复3 次，十字划线法测量菌丝长速[18]。
1.3.5 最适碳源确定
以PDA 综合培养基为基础，分别添加麦芽糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖代替葡萄糖，添加量为20 g/L，以不添加碳源的处理为空白对照（CK），各处理重复3 次。定期观察菌丝长势，并使用十字划线法测量菌丝长速。
1.3.6 最适氮源确定
以PDA 培养基为基础，分别添加酵母浸粉、尿素、硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨，添加量为2 g/L，以不添加氮源的处理为空白对照（CK），各处理重复3 次。定期观察菌丝长势，并使用十字划线法测量菌丝长速。
1.3.7 最适无机盐确定
以PDA 培养基为基础，分别添加硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸钙、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾6 种无机盐，添加量为2 g/L，以不添加无机盐的处理为空白对照（CK），各处理重复3 次。定期观察菌丝长势，并使用十字划线法测量菌丝长速。
1.3.8 最适生长因子确定
以PDA 培养基为基础，分别添加50 mg/L 的VB1、VB2、VB6、VC，以不添加生长因子的处理为空白对照（CK），各处理重复3 次。定期观察菌丝长势，并使用十字划线法测量菌丝长速。
1.3.9 最适温度确定
将菌种活化后接种于PDA 综合培养基平板上，分别设置21、23、25、27、29 ℃5 个温度处理，各处理重复3 次。定期观察菌丝长势，并使用十字划线法测量菌丝长速。
1.3.10 最适pH 值确定
将PDA 综合培养基pH 值分别设置为5、6、7、8、9，25 ℃恒温黑暗条件下培养，各处理重复3 次。定期观察菌丝长势，并使用十字划线法测量菌丝长速。
2 结果与分析
2.1 形态学鉴定结果
野生口蘑子实体、菌落形态及菌丝体显微形态见图1。
图1 菌株形态特征
Fig.1 Morphological characteristics of the strain
a.野生子实体；b.菌丝体形态（使用PDA 综合培养基，培养时间为14 d）；c.菌丝显微形态（放大倍数为400×）。
由图1 可知，子实体菌盖光滑，边缘内卷；菌肉呈白色，质地较为紧密；菌柄中生粗壮；菌褶稠密，黑色，不等长；菌环双层，生于菌柄中部。菌丝呈纯白色，气生菌丝较发达。镜检可见其菌丝不具有明显的锁状联合。
2.2 ITS 鉴定结果
ITS-PCR 扩增后测序获得该菌株的ITS 序列，结果如图2 所示。
图2 ITS 序列电泳图
Fig.2 Electrophoresis of ITS sequences
泳道1 为Marker；泳道2 和3 为供试菌株的PCR 扩增条带。
由图2 可知，扩增片段约为744 bp，条带清晰，特异性较强。将该序列在NCBI 的Genbank 数据库中进行BLAST 比对。当菌株的rDNA-ITS 序列相似性达到99% 时，即可认为它们是相同种；当相似性为95%～99%，即可认为是相同属；当相似性小于95%时，即可认为它们是相同科[19]。该菌株与中国美味蘑菇（MG-551853.1）的相似性大于99%，同时参考《中国大型菌物资源图鉴》[20]比对后，确定该野生菌株为中国美味蘑菇（Agaricus sinodeliciosus）。利用MEGA 6.0 软件进行同源关系比较后构建Neighbor-joining 系统发育树，如图3 所示。
图3 菌株基于r-DNA ITS 序列构建的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of the strain based on r-DNA ITS sequences
2.3 适宜母种培养基配方
不同母种培养基对菌丝生长的影响如表1 和图4所示。
表1 不同母种培养基对菌丝生长的影响
Table 1 Effect of different parent culture media on mycelial growth
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；+的多少表示菌丝长势强弱。
?培养基菌丝长速/（mm/d）菌丝长势PDA 综合培养基2.605 6±0.144 2a＋＋＋培养基Ⅰ2.220 8±0.066 0b＋＋培养基Ⅲ1.905 6±0.115 8c＋培养基Ⅱ1.558 4±0.167 3d＋＋＋＋
图4 不同母种培养基对菌丝生长的影响
Fig.4 Mycelial growth in different parent cultures media
由表1 和图4 可知，PDA 综合培养基长速和长势均显著优于其他几种配方。
2.4 最适碳源
不同碳源对菌丝生长的影响如表2 和图5 所示。
表2 不同碳源对菌丝生长的影响
Table 2 Effect of different carbon sources on mycelial growth
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；+的多少表示菌丝长势强弱。
?碳源菌丝长速/（mm/d）菌丝长势麦芽糖2.754 4±0.107 4a＋＋＋＋葡萄糖2.675 9±0.049 7a＋＋＋可溶性淀粉2.571 4±0.090 2b＋＋＋蔗糖2.602 7±0.078 2b＋甘露醇2.517 0±0.134 4b＋＋＋＋CK2.366 1±0.133 9b＋乳糖0.797 6±0.103 4c＋＋
图5 不同碳源对菌丝生长的影响
Fig.5 Effects of different carbon sources on mycelial growth
由表2 和图5 可知，麦芽糖与葡萄糖长速无显著差异，二者均显著优于其他碳源。可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇和对照长速无显著差异，甘露醇长势更佳，乳糖长速最差。因此，最适碳源为麦芽糖和葡萄糖。
2.5 最适氮源
不同氮源对菌丝生长的影响如表3 和图6 所示。
表3 不同氮源对菌丝生长的影响
Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；+的多少表示菌丝长势强弱；-表示未生长。
氮源菌丝长速/（mm/d）菌丝长势CK2.360 6±0.000 6a＋＋＋＋硝酸钾1.983 8±0.086 6b＋＋蛋白胨1.659 7±0.084 6c＋＋＋＋酵母浸粉1.219 9±0.018 4d＋＋＋硫酸铵0.368 1±0.019 2e＋尿素--
图6 不同氮源对菌丝生长的影响
Fig.6 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth
由表3 和图6 可知，不添加氮源的对照培养基长速和长势均显著优于其他5 种添加氮源的培养基。因此，不添加氮源更利于其生长。
2.6 最适无机盐
不同无机盐对菌丝生长的影响如表4 和图7 所示。
表4 不同无机盐对菌丝生长的影响
Table 4 Effect of different inorganic salts on mycelial growth
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；+的多少表示菌丝长势强弱。
?
图7 不同无机盐对菌丝生长的影响
Fig.7 Effect of different inorganic salts on mycelial growth
由表4 和图7 可知，添加硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸钙和氯化钠与不添加无机盐对照组相比无显著差异，添加氯化钾长速和长势最差。综合考虑，最适添加无机盐为硫酸镁。
2.7 最适生长因子
不同生长因子对菌丝生长的影响如表5 和图8所示。
表5 不同生长因子对菌丝生长的影响Table 5 Effect of different growth factors on mycelial growth
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；+的多少表示菌丝长势强弱。
生长因子菌丝长速/（mm/d）菌丝长势CK2.676 0±0.115 5a＋＋＋＋VB2 2.629 5±0.076 1ab＋VC2.535 7±0.232 2ab＋VB1 2.522 3±0.190 8ab＋＋＋VB6 2.303 6±0.193 6b＋＋
图8 不同生长因子对菌丝生长的影响
Fig.8 Effect of different growth factors on mycelial growth
由表5 和图8 可知，添加VB2、VC、VB1与不添加生长因子对照组长速无显著差异，长势对照组更佳，添加VB6长速和长势最差。因此，添加微生素未显著促进菌丝的生长。
2.8 最适温度
不同温度对菌丝生长的影响如表6 和图9 所示。
表6 不同温度对菌丝生长的影响
Table 6 Effect of different temperatures on mycelial growth
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；+的多少表示菌丝长势强弱。
温度/℃菌丝长速/（mm/d）菌丝长势211.537 6±0.034 4d＋＋＋231.633 5±0.051 3c＋＋＋252.133 2±0.085 9a＋＋＋＋272.043 1±0.037 5b＋＋＋＋290.595 6±0.016 4e＋
图9 不同温度对菌丝生长的影响
Fig.9 Effect of different temperatures on mycelial growth
由表6 和图9 可知，25 ℃长速和长势均显著优于其他几种温度。
2.9 最适pH 值
不同pH 值对菌丝生长的影响如表7 和图10 所示。
表7 不同pH 值对菌丝生长的影响
Table 7 Effect of different pH values on mycelial growth
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；+的多少表示菌丝长势强弱。
pH 值菌丝长速/（mm/d）菌丝长势5 1.890 6±0.246 1c＋6 1.765 6±0.178 6bc＋7 2.489 6±0.147 1a＋＋＋＋8 2.239 6±0.096 6ab＋＋9 2.130 2±0.139 9ab＋＋＋
图10 不同pH 值对菌丝生长的影响
Fig.10 Effect of different pH values on mycelial growth
由表7 和图10 可知，pH7 与pH8、pH9 的生长速度无显著差异，但菌丝长势更佳，三者长速和长势均明显优于pH5 和pH6 条件下的菌株。
3 讨论与结论
食用菌鉴定作为食用菌研究中的一个重要组成部分，主要用于区分和确定其种属。食用菌的鉴定方法主要有两种，包括形态学鉴定方法和分子水平鉴定方法[21]。传统食用菌鉴定通常采用形态观察法，但由于其受环境等因素影响较大且仅凭子实体形态并不能准确有效地认定其种属，因而，稳定性更强的分子鉴定技术被越发广泛地应用到食用菌鉴定中。形态观察法和分子鉴定法的结合大大地提高了野生食用菌鉴定的效率，同时也为今后的菌种鉴定工作奠定了基础[22]。
本研究一方面通过形态学观察，即对子实体形态、菌丝形态、菌丝的显微观察等；一方面运用分子水平鉴定方法进行DNA 提取，PCR 扩增，将扩增产物测序，再通过BLAST 系统比对，使用MEGA 6.0 软件构建系统发育树，根据同源关系进行作图，最终确定这株采自青海的野生菌株为中国美味蘑菇（Agaricus sinodeliciosus），属担子菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属。它与大肥蘑菇、姬松茸等蘑菇的同源关系较近。
对不同配方上菌丝生长情况进行观察记录后得出最佳母种培养基配方为PDA 综合培养基配方，即马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g，水1 000 mL。通过对美味蘑菇的生物学特性研究分析得出：最适合其菌丝生长的温度为25 ℃，10 ℃以下和30 ℃以上均不生长；最适pH7；最佳碳源为葡萄糖和麦芽糖；在PDA 培养基中添加不同无机盐和生长因子对菌丝长速影响均不大，综合考虑最佳无机盐为硫酸镁，不另添加生长因子；添加不同氮源对于菌丝生长速度的影响差异较大，不添加时菌丝长速最快且长势最好，因此认为中国美味蘑菇是一种高碳低氮需求的食用菌，这与梁倩倩等[23]对絮缘蘑菇的生物学特性报道相似。同时，在美味蘑菇菌丝培养过程中添加氮源可能会抑制其生长。
中国美味蘑菇肉质肥厚、味道鲜美。但其生长大多以野生为主，菌丝生长较慢，栽培周期过长，尚不能大规模驯化栽培。提高中国美味蘑菇菌丝长速，加快栽培周期将为后期研究的重点。
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