两种乙醇/盐双水相纯化蓝莓花青素的比较

蓝莓为杜鹃花科越橘属植物，果实中含有丰富的活性物质，如花青素、糖类、多酚等，其中每100 g 蓝莓鲜果中花青素含量高达387～487mg[1]。截至2020 年底，我国蓝莓总产量34.72 万t，蓝莓鲜果价格昂贵，除了鲜食，蓝莓还应用于制作蓝莓果汁、果酱等蓝莓的衍生品，但生产过程中产生了大量废弃皮渣。目前蓝莓皮渣多用于肥料、饲料以及直接垃圾处理[2]。皮渣中富含花青素，花青素是一种天然色素，具有抗氧化[3]、保护视力[4]、降血糖[5]、抗肿瘤[6-7]、保护心脑血管[8-9]等多种功效。在食品添加剂及膳食补充剂方面得到了广泛的应用[10]。蓝莓花青素市场价格昂贵，从蓝莓皮渣中提取花青素可以变废为宝，提高蓝莓产品的附加值。

目前花青素的主要提取方式是溶剂提取法，但提取液中含有大量的糖类杂质，需要进一步地分离纯化。分离纯化方法中的树脂吸附法纯化操作周期长[11]，膜分离法无法将分子量接近的色素与糖类物质分开[12]，层析法处理量少，不适合工业化生产[13-14]，而双水相法操作简单、处理周期短、分离条件温和并且容易实现规模化[15]。文献报道较多的双水相体系是采用聚乙二醇/无机盐体系[16-17]，得到的花青素上相中含有大量聚乙二醇，难以与花青素分离，并且聚乙二醇价格高、黏度大、回收困难、工业操作难度大，它还具有毒性，不能应用于食品中。因此，本文分别选择乙醇/硫酸铵和乙醇/磷酸二氢钠两种双水相体系进行蓝莓花青素的纯化，花青素上相中的乙醇可以通过蒸馏法与花青素分离并回收利用，相比于聚乙二醇/无机盐体系更加安全、节能、环保，以期为后续蓝莓皮渣中花青素的工业纯化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓皮渣：福建康之味食品工业有限公司；无水乙醇（分析纯）：西陇科学股份有限公司；硫酸铵（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；浓硫酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；苯酚（优级纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（UVmini-1285）：岛津仪器（苏州）有限公司；电子天平（YP6002）：上海佑科仪器仪表有限公司；pH 计（S210）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；涡旋振荡器（HY-4A）：常州普天仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓皮渣花青素粗提液的制备

取蓝莓皮渣和60%乙醇水溶液按1∶6（g/mL）的料液比浸提6 h，100 目滤布过滤去除粗渣，离心机3 000 r/min 离心15 min，去除沉淀，上清液真空旋转蒸发浓缩，浓缩液浓度为1 166.67 mg/L，浓缩液4 ℃储存备用，使用前调节pH 值。

1.3.2 单因素试验设计

1.3.2.1 无机盐质量分数对选择性系数和色素保留率的影响

乙醇/硫酸铵体系：在50 mL 离心管中分别添加质量分数为18%、19%、20%、21%、22%的硫酸铵，无水乙醇质量分数24%，色素添加量10%，调节pH 值为3.0，加水补足体系至30.0 g。置于漩涡振荡器振荡10 min，静置20 min，待体系稳定后，测定上下相溶液中的花青素含量和总糖含量，计算选择性系数β 及色素保留率。

乙醇/磷酸二氢钠体系：分别加入质量分数为18%、20%、22%、24%、25%的磷酸二氢钠，各管中加入无水乙醇的质量分数为30%，色素添加量10%，调节pH 值为3.0，其余操作条件同上。

1.3.2.2 乙醇质量分数对选择性系数和色素保留率的影响

乙醇/硫酸铵体系：分别加入质量分数为20%、21%、22%、23%、24%的无水乙醇，各管中加入硫酸铵质量分数22%，色素添加量10%，调节pH 值为3.0，其余操作条件同1.3.2.1。

乙醇/磷酸二氢钠体系：分别加入质量分数为22%、24%、26%、28%、30%的无水乙醇，各管中加入磷酸二氢钠质量分数24%，色素添加量10%，调节pH 值为3.0，其余操作条件同1.3.2.1。

1.3.2.3 pH 值对选择性系数和色素保留率的影响

乙醇/硫酸铵体系：加入硫酸铵质量分数22%，无水乙醇质量分数24%，色素添加量10%，分别调节pH值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，其余操作条件同1.3.2.1。

乙醇/磷酸二氢钠体系：加入磷酸二氢钠质量分数24%，无水乙醇质量分数30%，色素添加量10%，分别调节pH 值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，其余操作条件同1.3.2.1。

1.3.2.4 色素添加量对选择性系数和色素保留率的影响

乙醇/硫酸铵体系：调节色素添加量为8%、10%、12%、14%、16%，加入硫酸铵质量分数22%，无水乙醇质量分数24%，调节pH 值为4.0，其余操作条件同1.3.2.1。

乙醇/磷酸二氢钠体系：调节色素添加量为8%、10%、12%、14%、16%，加入磷酸二氢钠质量分数24%，无水乙醇质量分数30%，调节pH 值为3.0，其余操作条件同1.3.2.1。

1.3.3 正交试验设计

在单因素试验的基础上，进行四因素三水平的正交试验，以选择性系数为响应值，因素设计水平见表1、表2。

1.4 指标测定

1.4.1 花青素含量的测定

按照文献[18]的方法测定花青素含量。分别用pH 1.0 的氯化钾缓冲液和pH4.5 的乙酸钠缓冲液将待测样稀释，于520 nm 和700 nm 处测吸光度，按以下公式计算花青素含量（CTa、CBa，mg/L）。

式中：CTa 为上相花青素含量，mg/L；CBa 为下相花青素含量，mg/L；M 为矢车菊-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g/mol；D 为待测液的稀释倍数；l 为光路长，1 cm；ε 为矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26 900 L/（mol·cm）；1 000 为g 换算成mg 的转换系数；A520nm、A700nm 分别为待测液在520 nm 和700 nm 处的吸光度。

1.4.2 总糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[19]。

1.4.2.1 标准曲线的绘制

分别吸取0（空白）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 标准葡萄糖溶液，用去离子水补充至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL 浓硫酸，摇匀冷却至室温。在480 nm处测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线方程。

1.4.2.2 总糖含量的测定

取1.0 mL 待测液，加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL浓硫酸，摇匀冷却至室温。480 nm 测吸光度并代入标准曲线，计算总糖含量。

1.4.3 选择性系数β 的计算

选择性系数β、Ka、Ks 的计算公式如下。

式中：Ka 为花青素在双水相体系中的分配系数；Ks为糖类物质在双水相体系中的分配系数；CTa 为上相花青素含量，mg/L；CBa 为下相花青素含量，mg/L；CTs 为上相总糖含量，mg/mL；CBs 为下相总糖含量，mg/mL。

1.4.4 色素保留率η 的计算

色素保留率（η，%）的计算公式如下。

式中：VT 为上相体积，mL；VB 为下相体积，mL。

1.5 数据处理

采用Excel 2021 及SPSS 22.0 软件对试验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同无机盐质量分数对色素保留率η 和选择性系数β 的影响

两种双水相体系无机盐的质量分数对色素保留率η 和选择性系数β 的影响如图1 所示。

由图1（a）可知，随着硫酸铵质量分数的增加，选择性系数β 和色素保留率均呈上升趋势。在硫酸铵质量分数为22%时，β 达到最高值22.97，色素保留率最高为92.36%，因此选择硫酸铵质量分数21.5%、22.0%、22.5%进行正交试验。由图1（b）可知，随着磷酸二氢钠质量分数的增加，选择性系数β 在磷酸二氢钠质量分数为24%时达到最高值138.73，色素保留率随磷酸二氢钠质量分数升高的变化不大。因此选择磷酸二氢钠质量分数24%为较优水平，选择其质量分数为23%、24%、25%进行正交试验。无机盐质量分数的增加均有利于色素的分离纯化，但硫酸铵和磷酸二氢钠在体系中的溶解度限制了无机盐的持续增加，无机盐质量分数过高会出现析出沉淀现象。

2.1.2 不同乙醇质量分数对色素保留率η 和选择性系数β 的影响

不同乙醇质量分数对色素保留率η 和选择性系数β 的影响结果如图2 所示。

由图2 可知，随着体系中乙醇质量分数的增加，两个体系中选择性系数β 均呈现上升趋势。乙醇质量分数分别为24%和30%时β 达到最高，分别为19.72 和100.79，色素保留率也达到最高，分别为91.23%和99.52%。由图2（a）可知，色素保留率随乙醇质量分数的增加而增加。由图2（b）可知，色素保留率随乙醇质量分数的增加变化不大。乙醇质量分数的增加均有利于色素的分离纯化，但乙醇质量分数过高会出现析出沉淀现象。因此两体系分别选择乙醇的质量分数为24.0%和30%为较优水平进行后续试验。

2.1.3 不同pH 值对色素保留率η 和选择性系数β 的影响

pH 值对色素保留率η 和选择性系数β 的影响结果如图3 所示。

由图3（a）可知，乙醇/硫酸铵体系的选择性系数在pH4.0 时最高，为24.78；由图3（b）可知，色素保留率随pH 值影响不大，选择性系数在pH3.0 时最高，为115.81。可能由于pH4.0 时乙醇/硫酸铵体系和pH3.0时乙醇/磷酸二氢钠体系中的蓝莓花青素大多呈分子状态存在[20]，极性相对较低，更容易被分离到上相乙醇溶液中，使得β 达到最大。因此乙醇/硫酸铵体系选择pH4.0 为较优水平，选择pH3.5、4.0、4.5 进行正交试验；乙醇/磷酸二氢钠体系在pH3.0 条件下的纯化效果优于其他条件，所以此体系选择pH3.0 为较优水平，选择pH2.5、3.0、3.5 进行正交试验。

2.1.4 不同色素添加量对色素保留率η 和选择性系数β 的影响

不同色素添加量对色素保留率η 和选择性系数β的影响结果如图4 所示。

由图4 可知，两个体系中色素添加量对色素保留率的影响均不明显，但对选择性系数有明显影响，最高点均出现在添加量为14%时，选择性系数最大值分别为26.59 和104.56。β 整体呈先升高后下降的原因可能是随着色素添加量的增加，上相中花青素含量逐渐增加，Ka 升高，而糖类物质在上下两相中分布差异不大，即Ks 变化不大，从而使β 升高，但当色素添加量超过14%时，下相中花青素含量也增加，Ka 下降，上相中糖类物质含量增加，Ks 升高，因此导致β 下降。所以两体系都选择色素添加量14%为较优水平，选择色素添加量13%、14%、15%进行正交试验。

2.2 正交试验结果及分析

在单因素试验的基础上，设计表1、表2 的正交试验，由于不同因素对色素保留率的影响不大，所以仅考虑处理对选择性系数β 的影响。

使用Excel 2021 软件对乙醇/硫酸铵体系正交试验结果进行极差分析，见表3。

如表3 所示，乙醇/硫酸铵体系中4 个因素对选择性系数β 的影响次序为乙醇质量分数＞硫酸铵质量分数＞pH 值＞色素添加量，最佳试验条件为硫酸铵质量分数22.5%、乙醇质量分数24.0%、pH4.5、色素添加量15%，此条件未出现在正交试验中，将最优组合进行验证试验，最终计算得到选择性系数β 为27.10，为此体系试验最高值。

对乙醇/磷酸二氢钠体系的正交试验结果进行极差分析，结果见表4。

如表4 所示，乙醇/磷酸二氢钠体系中4 个因素对选择性系数β 的影响次序为磷酸二氢钠质量分数＞乙醇质量分数＞pH 值＞色素添加量，最佳试验条件为磷酸二氢钠质量分数25%、乙醇质量分数29%、pH2.5、色素添加量14%，此条件也未出现在正交试验中，将最优组合进行验证试验，最终计算得到选择性系数β 为140.05，为此体系试验最高值。

使用SPSS 22.0 对乙醇/硫酸铵体系的正交试验结果进行方差分析，见表5。

如表5 所示，乙醇质量分数对选择性系数β 有极显著影响（P＜0.01）。硫酸铵质量分数对选择性系数β有显著影响（P＜0.05）。pH 值、色素添加量对选择性系数β 无显著影响（P＞0.05），但是不宜再提高色素添加量和体系pH 值，继续增加色素添加量可能会导致分相失败，而且蓝莓皮渣色素作为花青素的一种，在酸性条件下稳定，有研究表明，在相同条件下，pH 值越大，花青素降解速率越快[20-22]。由表5 可知，影响选择性系数的因素的主次顺序为乙醇质量分数＞硫酸铵质量分数＞pH 值＞色素添加量，与表3 中的极差分析结果一致。

对乙醇/磷酸二氢钠体系的正交试验结果进行方差分析，见表6。

如表6 所示，磷酸二氢钠质量分数、乙醇质量分数对选择性系数β 均有极显著影响（P＜0.01），pH 值、色素添加量对选择性系数β 均有显著影响（P＜0.05）。方差分析结果表明，影响选择性系数的因素的主次顺序为磷酸二氢钠质量分数＞乙醇质量分数＞pH 值＞色素添加量，与表4 中的极差分析结果一致。

3 结论

试验得到乙醇/硫酸铵体系最佳试验条件为硫酸铵质量分数22.5%、乙醇质量分数24.0%、pH4.5、色素添加量15%，选择性系数β 最高为27.10。4 个因素对选择性系数β 的影响顺序为乙醇质量分数＞硫酸铵质量分数＞pH 值＞色素添加量。乙醇/磷酸二氢钠体系最佳试验条件为磷酸二氢钠质量分数25%、乙醇质量分数29%、pH2.5、色素添加量14%，4 个因素对选择性系数β 的影响顺序为磷酸二氢钠质量分数＞乙醇质量分数＞pH 值＞色素添加量，选择性系数β 最高为140.05，约为乙醇/硫酸铵体系选择性系数的5 倍，因此相较于乙醇/硫酸铵体系，乙醇/磷酸二氢钠体系对蓝莓花青素的选择性更高。且乙醇/磷酸二氢钠体系的色素保留率均98%以上，所以此体系更有利于蓝莓花青素的纯化。同时磷酸二氢钠在水中的溶解度对于温度的变化比硫酸铵更为敏感，使得磷酸二氢钠比硫酸铵更容易通过浓缩降温析出的方法进行回收，从而循环利用、节约能源。含有色素的上相乙醇可以通过蒸发法进行回收，实现乙醇的循环利用，达到节约能耗和资源的目的。

利用溶剂提取法得到的花青素粗提液中常含有大量糖类杂质，影响产品的稳定性，而且很难利用喷雾干燥法得到粉末状产品，因此提取液需要进一步纯化，双水相纯化法相对于其他纯化方法成本较低、回收产品容易，综合考虑选择性系数、色素保留率、色素回收和无机盐的回收利用，选择乙醇/磷酸二氢钠双水相体系纯化蓝莓花青素对实际生产更有指导意义。

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Comparison of Two Ethanol/Salt Aqueous Two-Phase Systems for Purifying Blueberry Anthocyanins

SHANG Yanwen1，WANG Yunying1，YANG Xiaoxue1，ZHANG Xiao1，CHENG Long1，WANG Shaofeng2，CHANG Xiulian1*
（1.School of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China；2.Zhangzhou Gold Saga Biotechnology Co.，Ltd.，Zhangzhou 363000，Fujian，China）

Abstract：Ethanol/ammonium sulfate and ethanol/sodium dihydrogen phosphate aqueous two-phase systems were compared in the purification of anthocyanins from blueberry peel residues.The single factor and orthogonal tests were conducted to optimize thepurification conditions.The ethanol/ammonium sulfate system was optimized as ammonium sulfate of 22.5%，ethanol of 24.0%，pH4.5，and pigment addition of 15%，under which the selectivity coefficient β was 27.10.The ethanol/sodium dihydrogen phosphate system was optimized as sodium dihydrogen phosphate of 25%，ethanol of 29%，pH2.5，pigment addition of 14%，under which the selectivity coefficient β was 140.05.The selectivity coefficient of the ethanol/sodium dihydrogen phosphate system was 5 times that of the ethanol/ammonium sulfate system.The anthocyanins purified by the ethanol/sodium dihydrogen phosphate system had a high retention rate.Moreover，sodium dihydrogen phosphate in the system had low solubility and was easy to be recovered.Therefore，this system demonstrated a promosing prospect of industrial application.

Key words：blueberry peel residues；anthocyanin；aqueous two-phase；pigment retention ratio；selectivity coefficient

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.17.018

基金项目：“玫瑰茄色素的分离提取研究”横向课题项目（SK19H21）

作者简介：尚彦文（1997—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物的分离提取。

*通信作者：常秀莲（1965—），女（汉），教授，博士，研究方向：天然产物的分离提取。

引文格式：

尚彦文，王云颖，杨晓雪，等.两种乙醇/盐双水相纯化蓝莓花青素的比较[J].食品研究与开发，2023，44（17）：126-132.

SHANG Yanwen，WANG Yunying，YANG Xiaoxue，et al.Comparison of Two Ethanol/Salt Aqueous Two-Phase Systems for Purifying Blueberry Anthocyanins[J].Food Research and Development，2023，44（17）：126-132.

加工编辑：刘艳美

收稿日期：2022-05-25