川芎蛋白（Ligusticum chuanxiong protein，LCP）为伞形科植物川芎的干燥根茎的分离蛋白。前期研究表明，LCP 提取率较高，且具有较好的抗氧化能力，但其溶解度较差，限制了其作为天然抗氧化剂在食品行业的应用[1]，所以有必要对LCP 进行有效地改性处理。相比物理法（高压加工、高压均质化和高强度超声）和酶法（谷氨酰胺转胺酶、氧化酶和酶修饰）的改性方式，糖基化改性被称为“绿色工艺”，是自发进行的反应，无需添加化学物质，具有绿色、安全的优势。反应实质是蛋白质氨基与还原糖羰基的共价结合[2]，使得糖基化共聚物同时具有蛋白质的大分子特性和多糖的亲水特性，从而改善蛋白质溶解度，提高蛋白质的抗氧化性。
葡聚糖（dextran，Dex）是一种中性多糖，具有还原性，是糖基化反应的必要条件之一，并且中性电荷可抑制蛋白质与多糖之间静电络合的形成[3]。其葡萄糖残基由α-1，6 键连接成线性链，具有很高的灵活性，可与蛋白质紧密缠绕，为糖基化下的分子间聚集提供强大的空间位阻[4]，是制备蛋白质-多糖共聚物的理想材料。本研究以接枝度（degree of grafting，DG）为评价指标，通过Box-Behnken 响应面法优化川芎蛋白-葡聚糖共聚物（glycosylated Ligusticum chuanxiong protein，GLCP）制备条件，并对在最优条件下所得的GLCP 进行抗氧化性研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
川芎：四川千方中药股份有限公司；葡聚糖、考马斯亮蓝R250、四硼酸钠、邻苯二甲醛、溴酚蓝：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸钠：北京酷来搏科技有限公司；羟自由基清除能力试剂盒、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]自由基清除能力试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
MINIB-100I 金属浴：杭州米欧仪器有限公司；Mini PROTEAN Tetra Cell 电泳仪：美国BIO-RAD 公司；UV-6000PC 紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Quanta 450 FEG 扫描电镜：美国FEI 公司；Nicolet Is50 傅里叶变换红外光谱：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 LCP 的提取
采用饱和酚法[5]提取LCP。称取脱脂后川芎药材粉末0.5 g，加入预冷丙酮3 mL，置于-20 ℃冰箱浸提30 min。3 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，分别加入80%丙酮、0.1 mol/L 乙酸铵的80%甲醇液洗涤。沉淀中加入细胞裂解液2.5 mL 重悬，再加入Tris-饱和酚溶液2.5 mL，充分摇匀，静置1 h。3 000 r/min 离心5 min，收集上清液，加入3 倍量0.1 mol/L 乙酸铵的80%甲醇液，置于-20 ℃冰箱，放置过夜。3 000 r/min 离心5 min，收集沉淀，分别用甲醇、80%丙酮洗涤沉淀，-80 ℃冷冻干燥即得LCP。
1.3.2 DG 测定
采用邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）法[6]，称取OPA 80 mg 溶解于2 mL 的甲醇中，依次加入20%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液5 mL、0.1 mol/L 硼砂溶液50 mL，β-巯基乙醇200 μL，定容至100 mL。取配制的OPA 试剂4 mL 加入GLCP 溶液200 μL，混匀，于35 ℃水浴锅中反应2 min，340 nm 测其吸光值A1，相同条件下加入200 μL LCP 溶液为空白，测定吸光值A0，二者之差为自由氨基的净吸光值，通过以下公式计算接枝度（D，%）。
1.3.3 GLCP 的单因素考察
采用湿热法[7]，将提取的LCP 与Dex 配制成一定比例的溶液，磁力搅拌1 h，调pH 值，置于水浴中反应，反应后迅速冷却，得到GLCP。
1.3.3.1 不同底物质量比对DG 的影响
按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 的底物质量比准确称取Dex 与LCP，加入去离子水4 mL 溶解，磁力搅拌1 h，用0.1 mol/L 的氢氧化钠调节溶液的pH 值至9.0。将调好pH 值的溶液放入水浴加热反应，设定反应温度为70 ℃、反应时间为150 min，反应结束后立即用冷水停止其反应，得糖基化产物，对其接枝度进行测定。单因素试验均重复3 次。
1.3.3.2 不同pH 值对DG 的影响
参照1.3.3.1 方法，分别选取反应pH 值为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，其他条件固定为底物质量比2∶1，反应温度70 ℃、反应时间150 min。
1.3.3.3 不同反应时间对DG 的影响
参照1.3.3.1 方法，分别选取反应时间为90、120、150、180、210 min，其他条件固定为底物质量比2∶1、pH9.0、反应温度70 ℃。
1.3.3.4 不同反应温度对DG 的影响
参照1.3.3.1 方法，分别选取反应温度为30、50、70、90、110 ℃，其他条件固定为底物质量比2∶1、pH9.0、反应时间150 min。
1.3.4 糖基化川芎蛋白响应面优化试验建立
根据单因素试验结果分析，以A 底物质量比、B pH 值、C 反应时间、D 反应温度为自变量，DG 为响应值，采用Design Export 8.0.6 软件分析，通过四因素三水平优化制备过程。每组平行试验3 次，响应面优化试验因素和水平见表1。
表1 响应面优化试验因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface optimization
水平因素A 底物质量比B pH 值C 反应时间/min D 反应温度/℃-13∶18.012050 0 2∶19.015070 1 1∶110.018090
1.3.5 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的测定
配制12%分离胶，5%浓缩胶，进行垂直电泳。样品和3 倍量溴酚蓝缓冲液涡旋混合，置于100 ℃金属浴加热反应10 min，待冷却后，取样品10 μL，标准蛋白（Maker）5 μL 上样。初始电压为80 V，待指示剂进入分离胶后电压调为120 V，距离电泳板底部0.5 cm 时，停止电泳。电泳完毕，取出胶片，置于考马斯亮蓝R-250中染色，凝胶背景透明为止，于脱色液（冰醋酸∶甲醇∶水=1∶4∶10，体积比）中进行脱色处理，直至条带清晰，观察分子量。
1.3.6 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察
取少量LCP 和GLCP 样品固定于双面导电胶上，进行喷金处理，厚度约为10 nm 的电镀层，在20 kV 电压下进行电子扫描，拍摄具有代表性样品图。
1.3.7 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）的测定
分别取适量LCP、GLCP 干燥冻干粉末，按照1∶100（质量比）加入溴化钾进行压片，用傅里叶变换红外光谱仪做全波段扫描（4 000～400 cm-1），扫描次数32 次。
1.3.8 抗氧化性的测定
1.3.8.1 羟自由基清除能力的测定
取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的样品溶液各125 μL，分别加入试剂盒中试剂一、试剂二、试剂三各125 μL 和蒸馏水500 μL 作为测定组。样品溶液125 μL，试剂一、试剂二各125 μL 和蒸馏水625 μL 作为对照组。试剂一、试剂二、试剂三各125 μL 和蒸馏水625 μL 作为空白组。以VC 为阳性对照。混匀后，37 ℃水浴反应20 min，510 nm 下测吸光值。
式中：X 为羟自由基清除率，%；A0 为空白组吸光值；A1 为测定组吸光值；A2 为对照组吸光值。
1.3.8.2 ABTS+自由基清除能力的测定
取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的样品溶液各50 μL，加入试剂盒中工作液950 μL 作为测定组。样品溶液50 μL，无水乙醇950 μL 作为对照组。无水乙醇50 μL 和工作液950 μL 作为空白组。以VC 为阳性对照。混匀后，25 ℃避光反应6 min，734 nm 下测吸光值。
式中：Y 为ABTS+自由基清除率，%；A0 为空白组吸光值；A1 为测定组吸光值；A2 为对照组吸光值。
1.4 数据处理
所有试验均重复3 次，数据以平均值±标准差表示，使用Excel 2019 进行处理；Design Expert 8.0.6 进行响应面优化；Origin 2018 绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
糖基化反应是蛋白质游离氨基和还原糖羰基之间的共价结合，接枝度表示反应前后的游离氨基酸含量的变化，以此判断糖基化反应程度，接枝度越大，说明反应越完全[8]。单因素试验结果见图1。
图1 各单因素对接枝度的影响
Fig.1 Effects of single factors on the degree of grafting
A.底物质量比；B.pH 值；C.反应时间D.反应温度。
由图1A 可知，随LCP 添加量的增大，接枝度呈现先增加后降低的趋势，在底物质量比为2∶1 时，接枝度达到最大值为（35.40±0.56）%。可能是体系中糖比例较高时，活性位点接触机率较大，有利于糖基化进程。当蛋白质比例较大时，由于蛋白质的空间位阻影响，活性位点接触机率降低，糖基化反应受到影响，从而接枝度降低[9]。综合考虑选择底物质量比为3∶1、2∶1、1∶1进行响应面优化试验。
由图1B 可知，随着pH 值的增大，接枝度呈现先增加后降低的趋势，当pH 值为9.0 时，接枝度达到最大值（34.94±0.32）%。可能是随着pH 值的增大，偏离等电点，溶解度增大，从而使游离氨基增加，羰氨结合，利于糖基化反应。但强碱条件下，LCP 易发生变性，蛋白质分子内部疏水基团暴露于分子表面[10]，而亲水基团相对较少，不与水相相溶，集聚成团，溶解度降低[11]，从而接枝度下降。综合考虑选择pH 值为8.0、9.0、10.0进行响应面优化试验。
由图1C 可知，随着反应时间的增长，接枝度呈现先增加后降低的趋势，在反应时间为150 min 时，接枝度达到最大值（34.78±0.39）%。可能是随着反应进行，LCP 中游离氨基逐渐暴露，与Dex 中羰基结合，进行糖基化反应，接枝度随着反应时间延长而增大。反应150 min 后，达到美拉德反应后期，生成类黑素、还原酮，与蛋白质发生交联作用，从而阻碍糖基化改性[12]。综合考虑选择反应时间120、150、180 min 进行响应面优化试验。
由图1D 可知，随着反应温度的升高，接枝度呈现先增加后降低的趋势，在反应温度为70 ℃时，接枝度达到最大值（35.07±0.63）%。可能是由于葡聚糖分子含有多个羟基，引入亲水羟基与蛋白质分子结合，一定程度上保护了蛋白质，使其不易聚集，增大了溶解度，从而体系中自由氨基增加，接枝度随之增大。随着温度的升高，蛋白质在高温条件下，容易发生变性，空间结构遭受破坏，链与链之间分子间氢键易团聚[13]，导致溶解度降低，自由氨基的减少，从而使接枝度降低。综合考虑选择加热温度50、70、90 ℃进行响应面优化试验。
2.2 响应面优化糖基化川芎蛋白制备工艺
2.2.1 响应面优化试验设计及结果
每组样品平行测定3 次，取平均值，进行统计分析。Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计及结果分析，如表2 所示。
表2 响应面试验方案与结果
Table 2 Scheme and results of response surface test
试验号 A 底物质量比B pH 值C 反应时间D 反应温度接枝度/%11-10031.51 2-1-10027.33 3110027.17 4-110032.98 500-1-125.87 6001-125.50 700-1126.80 8001128.85 9100-126.61 10-100-127.54 11100128.85 12-100131.83 130-1-1026.47 1401-1026.53 150-11027.36 16011028.85 1710-1026.99 18-10-1027.75 19101028.48 20-101029.43 210-10-126.61 22010-128.10 230-10128.29 24010130.15 25000035.92 26000034.43 27000034.62 28000035.55 29000034.99
由表2 得拟合方程为Y=35.10-0.60A+0.52B+0.67C+1.21D-2.50AB-0.047AC-0.51AD+0.36BC+0.092BD+0.61CD-2.40A2-3.04B2-4.60C2-3.84D2。
2.2.2 方差分析结果
响应面试验方差分析见表3。
表3 响应面试验方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface test
注：**表示具有极显著影响，P<0.01。
方差来源平方和 自由度 均方F 值P 值 显著性模型279.921419.99 58.34 <0.000 1 **A 底物质量比4.3814.3812.75 0.003 0**B pH 值3.2113.219.38 0.008 4**C 反应时间5.4115.4115.80 0.001 4**D 反应温度17.62117.62 51.40 <0.000 1 **AB24.95124.95 72.80 <0.000 1 **AC9.025×10-3 19.025×10-3 0.026 0.873 4 AD1.0511.053.07 0.101 8 BC0.5110.511.49 0.242 1 BD0.03410.0340.10 0.756 7 CD1.4611.464.27 0.057 8 A237.45137.45 109.26 <0.000 1 **B260.05160.06 175.21 <0.000 1 **C2137.341137.34 400.72 <0.000 1 **D295.47195.47 278.56 <0.000 1 **残差4.80140.34失拟项3.23100.320.83 0.635 1纯误差1.5740.39总和284.7228
如表3 所示，由模型F 检验值可知，F=58.34，P<0.01，表明此回归模型极显著。方程失拟项F=0.83，P=0.635 1>0.05，失拟项不显著，表明回归模型与试验实测值拟合度较好，误差较小，可以使用该回归方程预测糖基化川芎蛋白的接枝度。根据各因素F 值的比较可知，各因素对响应值影响大小为反应温度>反应时间>底物质量比>pH 值。通过对回归方程系数的显著性分析，可知一次项A、B、C、D 的P 值均小于0.01，表明反应温度、反应时间、底物质量比、pH 值对接枝度的影响极显著；二次项A2、B2、C2、D2 影响极显著（P<0.01）；交互项AB 影响极显著（P<0.01），AC、AD、BC、BD、CD影响不显著（P>0.05）。R2=0.983 1，R2Adj=0.966 3，表示所建立的模型置信度较高，能够很好地反映自变量与响应值之间的关系。
2.2.3 因素交互作用
利用Design Expert 8.0.6，分析底物质量比、pH 值、反应时间、反应温度交互作用对接枝度的影响，结果见图2～图7。
图2 底物质量比与pH 值相互作用的等高线图与响应面图
Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and pH
图3 底物质量比与反应时间相互作用的等高线图与响应面图
Fig.3 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and time
图4 底物质量比与反应温度相互作用的等高线图与响应面图
Fig.4 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and temperature
图5 pH 值与反应时间相互作用的等高线图与响应面图
Fig.5 Contour diagram and response surface diagram of interaction between pH and time
图6 pH 值与反应温度相互作用的等高线图与响应面图
Fig.6 Contour diagram and response surface diagram of interaction between pH and temperature
图7 反应时间与反应温度相互作用的等高线图与响应面图
Fig.7 Contour diagram and response surface diagram of interaction between time and temperature
由图2～图7 可知，底物质量比、pH 值、反应时间、反应温度4 个因素在所选范围内存在极值，即等高线中最小椭圆的中心点。结果表明，AB 交互作用显著，与F 值结果一致。
2.2.4 验证试验
经Design Expert 8.0.6 分析，该模型得到糖基化川芎蛋白制备最优条件为底物质量比1.75∶1、pH9.19、反应时间152.83 min、反应温度73.67 ℃，预测接枝度为35.37%。因考虑实际操作可行性，将验证条件修改为底物配质量比1.8∶1、pH9、反应时间153 min、反应温度74 ℃，平行试验3 次。经过验证试验，平均接枝度为（35.21±0.12）%，接近理论值，表明该模型可用于优化糖基化川芎蛋白的制备过程。
2.3 SDS-PAGE 结果
SDS-PAGE 是对蛋白质的亚基及分子质量分析的重要手段，并且可用于对蛋白质糖基化后是否生成共聚物作定性鉴别[14]。图8 是对LCP 及其糖基化产物进行考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE 图谱。
图8 Maker、LCP、GLCP SDS-PAGE 电泳图
Fig.8 SDS-PAGE of Maker，LCP and GLCP
M 为Maker；1、2 为LCP；3、4 为GLCP；P1 为浓缩胶顶端处；P2 为浓缩胶与分离胶接缝处。
由图8 可知，泳道3、4 亚基谱带颜色与泳道1、2相比，颜色变浅，可能是LCP 与Dex 经过湿热法糖基化后，生成了共聚物，LCP 中活性基团减少，从而蛋白质分子与考马斯亮蓝结合减少，出现亚基谱带颜色变浅[15]。另一方面，小分子的蛋白质与糖共价结合后，生成大分子的共聚物向上集聚，因此出现亚基谱带颜色变浅。浓缩胶顶端P1 以及浓缩胶与分离胶接缝处P2均出现新的条带，分析可能是LCP 与Dex 糖基化反应后，生成的共聚物分子量较大[16]，电泳时，这些共聚物无法通过凝胶，只能聚集在P1 和P2 处。通过亚基谱带颜色变浅，以及出现新的条带，可以说明LCP 与Dex糖基化后生成了共聚物。
2.4 SEM 观察
SEM 结果见图9。
图9 样品扫描电镜图
Fig.9 Scanning electron microscopy of samples
A 为LCP（10 000×）；B 为LCP 与Dex 混合物（10 000×）；C 为GLCP（8 000×）。
由图9 所示，LCP 糖基化前后，结构明显不同。图9A 表明，糖基化前LCP 呈颗粒状，近圆球形，大小不一。图9B 为LCP 与Dex 简单物理混合后的扫描电镜图，两者的混合物具有LCP 相似的结构，表面可以看出LCP 所具备的近圆球形形态，可以推测两者之间并没有化学键缔合，而是物理混合。图9C 为糖基化后的LCP，原本的近圆球形态消失，表面结构变得疏松多孔，呈现蜂窝状，可能是LCP 与Dex 共价结合，糖基化过程引入糖链，LCP 肽链逐渐延展开，形成的这种结构特点[17]，可以更好地提高蛋白质的溶解性，从而提高其功能特性。Qu 等[18]研究发现，糖基化的菜籽分离蛋白结构变得疏松多孔，呈现蜂窝状，与此结果一致。
2.5 FTIR 结果分析
FTIR 结果见图10。
图10 LCP、GLCP 傅里叶变换红外光谱图
Fig.10 Fourier transform infrared spectra of LCP and GLCP
FTIR 是分析蛋白质与多糖共价结合后，分子水平上相互作用和结构变化的有效手段[19]。由图10 所示，与LCP 比较，GLCP 在波数为3 600～3 200 cm-1范围内出现了明显增强的吸收峰，可能是由于Dex 的引入，体系中-OH 增多，伸缩振动引起的变化[20]。Zhao 等[21]利用大豆寡糖糖基化改性大豆分离蛋白，红外光谱也显示在3 600～3 200cm-1 处吸收峰增强，与本文结果相似。在波数1 630、1 530、1 240 cm-1 处，吸收峰表现出了不同程度的变化，这3 个波数分别在酰胺I 带（1 700～1 600 cm-1）、酰胺II（1 580～1 480 cm-1）、酰胺III（1 300～1 200cm-1）范围内，分别是由于C=O 伸缩振动、N—H弯曲振动、C—N 拉伸和N—H 变形振动引起的[22]。波数为1 020 cm-1 时，GLCP 吸收峰强度与形状变化明显，可能是糖基化反应中新形成的C—N 共价键伸缩振动引起[23]。通过上述吸收峰的变化，可以表明LCP 与Dex 以共价键的方式结合，从而引起蛋白质二级结构的变化。
2.6 抗氧化性结果分析
抗氧化性试验结果见图11。
图11 LCP、GLCP 对羟自由基和ABTS+自由基的清除能力
Fig.11 Scavenging abilities of LCP and GLCP on hydroxyl radical and ABTS+radical
A.羟自由基清除能力；B.ABTS+自由基清除能力。
羟自由基清除率是评价自由基清除能力的重要指标，有效清除自由基是针对自由基诱导的氧化应激引起的各种疾病的保护方法之一[24-25]。由图11A 所示，随着样品浓度的增大，LCP、GLCP 对羟自由基的清除率均呈现上升趋势，并且GLCP 在浓度为0.8 mg/mL 后，上升速度较快，在浓度为1.0 mg/mL 时，清除率为（65.91±1.93）%。在相同的浓度范围内，羟自由基清除能力强弱依次为VC＞GLCP＞LCP，其中阳性对照VC 的IC50 值为0.67 mg/mL，GLCP 的IC50 值为0.88 mg/mL，LCP 的IC50 值为2.20 mg/mL。由此可以看出GLCP 的清除效果虽不及VC，但强于LCP。杨志伟等[26]研究β-葡聚糖糖基化对裸燕麦蛋白抗氧化活性时，发现糖基化裸燕麦蛋白羟自由基清除率是原蛋白的2.13 倍，可以证实经过糖基化反应，清除羟自由基能力可以得到提高。
由图11B 所示，随着样品浓度的增大，LCP、GLCP对ABTS+自由基的清除率均呈现逐渐上升趋势，其中GLCP 趋势较陡，有明显的量效关系。当其浓度达到1.0 mg/mL 时，GLCP 对ABTS+自由基的清除率为（81.80±2.18）%，LCP 为（41.63±2.18）%。VC 组IC50 值为0.16 mg/mL，GLCP 的IC50 值为0.45 mg/mL，LCP 的IC50值为1.5 mg/mL，可以推测出GLCP 具有良好的清除ABTS+自由基能力。有关乳清蛋白研究也表明，糖基化后乳清蛋白清除ABTS+自由基能力有明显提高[27]。
通过抗氧化试验结果，可以得出GLCP 对羟自由基、ABTS+自由基的清除能力虽弱于VC，但均强于LCP，表现出良好的抗氧化活性。分析可能是经过糖基化后，其结构性质的改变，使其溶解度的增加，在相同浓度下，GLCP 更易溶于水，可向自由基提供质子[28]。另一方面，美拉德反应会产生一些类黑素物质，而这些物质是自由基清除能力的贡献者[29]。并且糖基化的蛋白质有较好的供氢能力，更易与自由基反应[30]。
3 结论
利用单因素及响应面法优化LCP 糖基化最佳工艺条件为底物质量比（Dex∶LCP）1.8∶1、溶液pH9、反应时间153 min、反应温度74 ℃。在此条件下糖基化的平均接枝度为（35.21±0.12）%。SDS-PAGE 分析可知，LCP 与Dex 生成共聚物，并且分子量较大，电泳时，滞留在浓缩胶顶端以及浓缩胶与分离胶接缝处；SEM 分析可知，生成的共聚物表面结构呈现疏松多孔，蜂窝状；通过特征吸收峰不同程度的变化可知，LCP 二级结构有所改变。通过对自由基清除能力的测定，GLCP 相比原蛋白其抗氧化能力均有提升。综上所述，采用湿热法糖基化改性LCP，LCP 溶解度得到改善，从而抗氧化性提高，可能是该过程引入了糖分子。本研究结果显示，GLCP 具有良好的抗氧化能力，并且为天然植物蛋白，具有安全、无刺激、无毒副作用的优势，本研究可为其在抗氧化研究方面提供参考。
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