果蔬汁富含维生素、膳食纤维等营养物质，其清爽的口感深受人们喜爱。许多果汁在维持一氧化氮水平、抑制血小板聚集[1]以及预防心血管疾病等方面至关重要。益生菌是指活的微生物，当摄取足够数量时，对宿主健康有益[2]。近年来，利用乳酸菌发酵新鲜果蔬汁成为食品行业的研究热点之一。果蔬汁可为乳酸菌发酵提供适宜的生长环境。乳酸菌发酵能够使果蔬及其衍生食品的贮藏和食用特性得到更好地维持和改善，对活性物质的降低以及抗氧化活性的维持也有辅助作用[3]。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）来源于果蔬和自然发酵果蔬食品，能够利用葡萄糖、麦芽糖、果糖和木糖等碳源产酸而不产气，应用在发酵乳制品和植物源食品中，能够促进肠道菌群平衡和人体胃肠道健康[4-7]。王红梅等[8]的研究发现，在两种水果汁基质中，植物乳杆菌的生长代谢有所不同。崔树茂等[9]的研究表明植物乳杆菌CCFM8661 发酵苹果汁具有排铅功能。胡萝卜汁、大蒜汁、生姜汁等经植物乳杆菌581发酵，其营养价值、感官品质、食用和贮藏性能均得到改善[10]。发酵果汁能够改善人体益生菌的生长，对病原体微生物存在抑制作用[11]。
豆薯[Pachyrhizus erosus（Linn.）Urb.]又名凉薯、地瓜、土瓜等，属于豆薯属草质缠绕藤本植物[12]。原产亚热带，在我国长江以南普遍栽培，是我国华南和西南地区主要根菜之一。豆薯块根肥大呈圆形，外皮浅黄，肉白脆甜，水分多，富含糖分、蛋白质和维生素C，可以生食，在我国南方地区常作为蔬菜食用[12]。豆薯具有生津止渴、抗氧化[13]和抗癌等功效[14]。与木薯等其他类似的根茎作物相比，豆薯蛋白质含量高出数倍[15]。目前对豆薯深加工产品的研究较少，已有的产品包括豆薯酸奶、果酒和罐头等。康红艳等[16]以凉薯为原料研制凉薯酸奶，丰富了凉薯的用途和酸奶产品的种类。豆薯块根雪白清甜多汁，张华玲等[17]认为它是一种果酒发酵的好原料。谭沙等[18]利用酶法制备的豆薯饮料呈淡黄色，口感清爽酸甜，保留了凉薯的独特风味。本研究以豆薯为原料，利用植物乳杆菌FZU122 发酵新鲜豆薯汁，测定不同发酵阶段豆薯汁的基本理化指标、游离单糖、游离氨基酸、有机酸，以及挥发性成分以阐明植物乳杆菌发酵过程中豆薯汁的营养成分变化规律。本研究旨在为开发益生菌发酵豆薯汁产品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜豆薯：市售。植物乳杆菌FZU122：福州大学生物科学与工程学院。MRS 培养基：广东环凯微生物科技有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；单糖标品（岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和果糖）：上海麦克林生化科技有限公司；2-辛醇：德国Dr.Ehrensorfer 公司；42 种游离氨基酸混合标准品：德国曼默博尔公司；8 种有机酸混合标准物质（酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸、丙酸）：北京北方伟业计量技术研究院。所有化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
LDZF-50L-III 立式高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；ST3100 pH 计：奥豪斯仪器（常州）有限公司；A300氨基酸自动分析仪：德国曼默博尔公司；5977A 气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；PDMS 固相微萃取头、57330-U SPME 手动进样柄：美国Supelco 公司；反相C18 柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）：美国Phenomenex 公司；Dionex-6000 离子交换色谱仪：美国戴安公司；LC-20A 高效液相色谱仪：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵豆薯汁的制备操作要点
将新鲜豆薯用自来水洗净、沥干水分后切成大小均匀的小块，放入榨汁机中榨汁。用200 目滤袋将滤浆过滤得到新鲜豆薯汁后，将豆薯汁倒入发酵罐中进行灭菌处理。冷却至室温，按照1×108 CFU/mL 接种量接入植物乳杆菌FZU122 生理盐水菌悬液（OD600nm 为0.4～0.5），在37 ℃条件下恒温静置发酵。每隔24 h 取样1次，测定pH 值，同时保存于-20 ℃冰箱中用于后续分析。
1.3.2 指标测定
采用pH 计测定pH 值；以牛血清蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[19]；采用3，5-二硝基水杨酸法测定总还原糖含量。
1.3.3 游离单糖组成测定
采用Dionex-6000 离子交换色谱仪进行单糖组成测定[20-21]。样品经15 000 r/min 离心10 min 后，收集上清液，过0.22 μm 滤膜；取适量上清液经超纯水稀释1 000 倍后，采用离子交换色谱系统，并使用脉冲安培检测器进行分析。柱温：30 ℃。进样体积设为25 μL；仪器部件温度：25 ℃。流动相：A 相（20 mmol/L NaOH 溶液）；B 相（H2O）。采用A 相进行等浓度洗脱，流动相流速为0.5 mL/min。
1.3.4 游离氨基酸含量的测定
先将样品在10 000 r/min 离心10 min，取上清液与10%磺基水杨酸以4∶1（体积比）混合均匀，过0.45 μm滤膜，于2～8 ℃冷藏24 h；取出，15 000 r/min 离心15 min，取上层清液再以15 000 r/min 转速离心5 min。取上清液与样品稀释液按1∶9（体积比）混合，过0.22 μm滤膜后，收集于2 mL 自动进样瓶。
1.3.5 挥发性组分的测定
采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用技术对植物乳杆菌发酵豆薯汁的香气组分进行分析。色谱条件[22-23]：柱型采用DB-Wax 色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃；升温程序：初始温度40 ℃保留8 min，以4 ℃/min 的速率升至150 ℃，再以20 ℃/min 的速率升至250 ℃，保持5 min；载气（He）流速1 mL/min，手动不分流进样。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z 30～500。
样品处理：取5 mL 发酵豆薯汁样品于20 mL 样品瓶中，分别加入1 g 氯化钠和10 μL 2-辛醇内标溶液，浓度为10 mg/L。加入转子，样品瓶先在水浴磁力搅拌器40 ℃、600 r/min 条件下温育20 min 后插入固相微萃取针，压出萃取纤维，使其固定在距离液面0.5～1.0 cm处，吸附萃取30 min 后收回萃取纤维，拔出萃取针并插入气相色谱-质谱联用仪中进样分析。将气相色谱-质谱联用仪中美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）11 和NIST 17 质谱数据库、匹配度和保留时间与标准谱图对照，再对各物质进行检索。选择相似度指数大于80 的物质作为有效的香气成分。每次检测时加入相同量的内标物2-辛醇进行定量分析，选择匹配度等于或者大于80，同时对其进行定性分析，根据面积归一化法对香气成分对应峰进行定量。根据下列公式计算挥发性物质含量。
M=V1×C/V2
式中：M 为挥发性成分含量，mg/L；V1 为挥发性物质峰面积；C 为内标物浓度，mg/L；V2 为内标物峰面积。
1.3.6 有机酸浓度的测定
参考Tu 等[24]的方法测定样品有机酸浓度，将样品15 000 r/min 离心5 min，过0.22 μm 滤膜，将样品经超纯水稀释10 倍后，使用LC-20A 高效液相色谱仪进行检测。色谱条件：流动相为磷酸二氢钠溶液（0.01 mol/L，pH2.7）过0.22 μm 滤膜，超声处理20 min 后备用；色谱柱为反相C18 柱（250 mm×4.60 mm，5 μm），柱温25 ℃；使用紫外检测器，检测波长为210 nm；进样量为20 μL，流动相流速为0.8 mL/min。
1.4 数据处理
数据采用GraghPad prism 9、OriginPro 2018 作图。采用Excel 2010，SPSS Statistics 对数据进行分析，不同字母表示差异显著（P<0.05）。
2 结果与分析
2.1 发酵豆薯汁理化指标测定结果
采用植物乳杆菌对豆薯汁进行发酵，观察其pH值、总还原糖和游离蛋白质含量变化，其结果见表1。
表1 不同发酵时间豆薯汁pH 值、总还原糖含量和总游离蛋白质含量变化
Table 1 Changes in pH，reducing sugar，and free protein of jicama juice fermented for different time periods
注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05）。
总游离蛋白质含量/（mg/mL）0 5.86±0.00a10.96±0.17a0.137±0.001a 243.94±0.00b10.24±0.20b0.125±0.002b 483.60±0.00c6.01±0.44d0.134±0.001a 723.53±0.00d7.64±0.15c0.132±0.004ab发酵时间/hpH 值总还原糖含量/（mg/mL）
由表1 可以得出，随着发酵时间的延长，相较于未发酵的豆薯汁，发酵豆薯汁的pH 值在发酵24 h 后下降明显，24～72 h 时，pH 值逐渐下降，表明植物乳杆菌能够在豆薯汁中代谢产酸。豆薯汁中的总还原糖含量显著变化（P<0.05）。这可能是因为在发酵过程中，植物乳杆菌能够利用豆薯汁中与能量代谢相关的碳源物质来促进细胞生长、合成碳骨架以及能量补给，因此总还原糖含量明显下降。发酵72 h 的豆薯汁总还原糖含量明显上升，可能是植物乳杆菌在代谢过程中产生了少量还原糖。发酵后，豆薯汁中的总游离蛋白质含量先减少后增加并趋于平缓。总游离蛋白质含量先下降可能是由于部分游离蛋白质降解为小分子肽形式，而后略微增加可能是菌体蛋白所导致。因此，植物乳杆菌FZU122 对发酵豆薯汁的蛋白质含量整体无明显影响。
2.2 发酵豆薯汁游离单糖组成变化
采用离子交换色谱仪测定发酵豆薯汁中游离单糖组成，结果如图1 所示。
图1 不同发酵时间豆薯汁中游离单糖组成
Fig.1 Changes in content of free monosaccharides in jicama juice fermented for different time periods
不同发酵时间相同单糖字母相同表示差异不显著（P>0.05）。
发酵豆薯汁中主要有葡萄糖和果糖两种游离单糖。由图1 可知，随着发酵时间的延长，在0～48 h 内，总游离单糖含量呈现先增加后减少的趋势，出现这种现象的原因在于发酵初期，植物乳杆菌将更多的多糖转化为还原糖[25]。在24～48 h 时，总游离单糖含量下降。产生这种现象可能是由于豆薯汁能为发酵体系中的微生物提供充足的能量，使植物乳杆菌利用碳源的速度加快，导致发酵体系中总体游离单糖含量呈现下降趋势。在整个发酵过程中，葡萄糖与果糖的比例整体呈现下降趋势，依次为1.78±0.16、1.48±0.07、1.45±0.04和1.44±0.03。这可能是因为在碳源充足的情况下，植物乳杆菌优先利用葡萄糖，使得葡萄糖含量在发酵48 h 时呈现下降趋势。而葡萄糖与果糖的比例下降表明植物乳杆菌会利用果糖等碳源物质。而植物乳杆菌在发酵后期不再大量利用碳源物质，发酵后期pH 值较低，也会抑制发酵中其他菌落生长[26]，因此两种还原糖含量趋于平缓。
2.3 发酵豆薯汁游离氨基酸组成变化
为了确定不同发酵时间游离氨基酸组成差别，对发酵豆薯汁的游离氨基酸进行聚类分析，结果见图2。
图2 不同发酵时间豆薯汁中游离氨基酸含量聚类热图
Fig.2 Heat map of free amino acid content in jicama juice fermented for different time periods
由图2 可知，在4 组豆薯汁中共检测出20 种氨基酸。游离氨基酸组成被分为3 组，其中0 h 为第1 组，24 h 和48 h 为第2 组，72 h 为第3 组。结果表明，在整个发酵过程中，豆薯汁中的总游离氨基酸含量依次为1.84、1.19、1.48 mg/mL 和1.25 mg/mL。与总游离蛋白质含量变化趋势不同，豆薯汁中的游离氨基酸组成经植物乳杆菌发酵会发生明显的变化。发酵72 h 前，图2中大部分游离氨基酸的含量呈下降趋势[27]。根据所测定数据，在20 种氨基酸中天冬酰胺含量最高，并由图2 可知，其含量呈现先明显下降后逐渐上升然后趋于稳定的变化趋势。在发酵24 h 后存在于原豆薯汁中的丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸均未被检测出，孙承锋等[28]的研究表明，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸具有苦味。随着发酵时间的延长，天冬氨酸、牛磺酸、甘氨酸、丙氨酸含量显著增加。而其中天冬氨酸是具有鲜味的氨基酸，甘氨酸、丙氨酸具有甜味[28]。这些变化对于豆薯汁的风味有明显改善，可促进甜味氨基酸的释放以及减少苦味氨基酸。
2.4 发酵豆薯汁挥发性成分分析
不同发酵时间豆薯汁挥发性成分含量变化见表2。
表2 不同发酵时间豆薯汁挥发性成分含量变化
Table 2 Changes in content of volatile components of jicama juice fermented for different time periods
编号香气成分CAS 号分子量/（g/mol）分子式保留时间/min含量/（mg/L）0 h24 h48 h72 h醛类1己醛66-25-1100.16C6H12O5.026+---2反式-2-己烯醛6728-26-398.14C6H10O7.517+---醇类31-辛烯-3-醇3391-86-4128.21C8H16O11.666+++++++++4 1-辛醇111-87-5130.23C8H18O13.756-+--5芳樟醇78-70-6154.25C10H18O13.623++++6 1-壬醇143-08-8144.25C9H20O15.508--+-7顺-2-壬烯-1-醇31502-14-4142.24C9H18O16.400--++
续表2 不同发酵时间豆薯汁挥发性成分变化
Continue table 2 Changes in content of volatile components of jicama juice fermented for different time periods
注：+表示挥发性成分浓度为0～<0.5 mg/L；++表示浓度0.5～<1.0 mg/L；+++表示浓度1.0～1.5 mg/L；-表示未检出。
编号香气成分CAS 号分子量/（g/mol）分子式保留时间/min含量/（mg/L）0 h24 h48 h72 h 8 α-松油醇98-55-5154.25C10H18O16.143--+-9反式-2-己烯-1-醇928-95-0100.16C6H12O10.988--++酸类10正己酸142-62-1116.16C6H12O218.849-+++其他类112-正戊基呋喃3777-69-3138.21C9H14O7.667++--124，7-二甲基茚满6682-71-9146.23C11H1414.662+---13萘91-20-3128.17C10H816.903++++142，3-二甲基萘581-40-8156.22C12H1223.090+---152，7-二甲基萘582-16-1156.22C12H1222.792--++16β-甲基萘91-57-6142.20C11H1019.009-+++17五甲基苯700-12-9148.24C11H1615.308-+++
由表2 可知，共检测出17 种匹配度大于80 的香气组分，其中包括醛类2 种、醇类7 种、酸类1 种以及其他类7 种。醛类物质主要存在于未发酵的豆薯汁，其中己醛和反式-2-己烯醛含量在未发酵豆薯汁中含量较高，而经过发酵后其不再被检出。己醛具有草腥味，被认为是产生豆腥味的主要原因[29]。醇类挥发性物质为发酵豆薯汁的主要香气组分，其中包括1-辛烯-3-醇、1-辛醇、芳樟醇、1-壬醇、顺-2-壬烯-1-醇、α-松油醇和反式-2-己烯-1-醇。在醇类物质中，1-辛烯-3-醇和芳樟醇在未发酵及不同发酵进程豆薯汁中均被检出。在未发酵豆薯汁中1-辛烯-3-醇的含量比发酵后含量高。陈红丽等[29]的研究表明，1-辛烯-3-醇具有蘑菇的味道，也是产生豆腥味的物质之一。而其中的芳樟醇既有紫丁香、铃兰香和玫瑰花香，又有木香、果香。发酵后，己醛、1-辛烯-3-醇等含量有所降低。而1-壬醇、顺-2-壬烯-1-醇、α-松油醇和反式-2-己烯-1-醇4 种挥发性成分均在发酵48 h 后被检出。这些新产生的物质中，1-壬醇具有强烈的玫瑰味和橙花香气[30]，α-松油醇具有丁香味，反式-2-己烯-1-醇具有未成熟果实气味，这也有利于改善发酵豆薯汁的风味。正己酸在未发酵豆薯汁中未检测到，而在随后的发酵进程中均存在。正己酸天然存在于椰子油、草莓，具有椰子油脂气味。作为食用香料，常应用于水果香精和奶油等，表明植物乳杆菌发酵进一步丰富了豆薯汁的风味。
2.5 有机酸浓度变化分析
以8 种有机酸为标品，采用高效液相色谱法测定植物乳杆菌发酵豆薯汁中有机酸浓度变化，结果见图3。
图3 不同发酵时间豆薯汁有机酸浓度
Fig.3 Concentrations of organic acids in jicama juice fermented for different time periods
不同发酵时间相同有机酸字母不同表示差异显著（P<0.05）。
由图3 可以看出，在整个发酵过程所检测的7 种有机酸中，未发酵豆薯汁中的有机酸仅有4 种，为酒石酸、乙酸、丁二酸和丙酸，其中酒石酸的浓度最高。但在发酵48 h 后，苹果酸、乳酸、柠檬酸浓度较未发酵豆薯汁中的酸浓度均有明显增加，而酒石酸浓度随着发酵进程出现显著下降（P<0.05）。分析原因可能是酒石酸能够被乳酸菌降解生成乳酸或乙酸，使挥发酸含量降低[31]。
发酵前，酒石酸是豆薯中的主要代谢产物。而发酵24 h 后，苹果酸和乳酸为主要的有机酸成分。苹果酸的浓度随着发酵进程呈现上升趋势，在所有有机酸中浓度最高，发酵72 h 后可达到5.458 mg/mL。在发酵24 h 后，苹果酸含量明显增加，苹果酸广泛存在于植物果实中，酸度较强。根据理化指标结果中测定的豆薯汁在发酵24 h 后pH 值明显下降，与有机酸分析结果一致。发酵期间，苹果酸可能会在苹果酸-乳酸酶的催化下发生脱羧反应生成乳酸[32-33]，其含量随参与的生化反应进行动态变化。乳酸具有抑制肠道杂菌生长繁殖、调节正常菌群的功能。柠檬酸可以被乳酸菌利用生成乳酸、乙酸和双乙酰等产物。在发酵48 h 后，柠檬酸浓度在原料中降低，使发酵后的产品口感更加柔和，刺激性小。
3 结论
本研究以豆薯汁为发酵基质，以植物乳杆菌在液体培养基的生长为参考，研究发酵时间（0、24、48、72 h）对豆薯汁基本理化指标、游离单糖、游离氨基酸、有机酸和挥发性成分的影响。研究发现，经过植物乳杆菌发酵后，豆薯汁的pH 值显著下降。植物乳杆菌会利用豆薯汁中的还原糖作为碳源物质，使得发酵48 h 时，总还原糖含量显著下降，两种主要单糖葡萄糖和果糖的比例逐渐降低，游离单糖比例降低。发酵豆薯汁中具有苦味的氨基酸，如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸等含量下降，而具有鲜味和甜味的氨基酸如天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸含量呈上升趋势。天冬酰胺在发酵过程中含量较高。挥发性成分分析发现，醇类物质为发酵豆薯汁的主要香气组分，醛类物质发酵后未被检出。主要产生豆腥味的己醛和1-辛烯-3-醇两种挥发性组分含量降低，而芳樟醇、1-壬醇、α-松油醇、正己酸等有益物质含量增加。发酵72 h后，苹果酸浓度显著增加，在所有有机酸中浓度最高。综上，植物乳杆菌发酵在一定程度上赋予了豆薯汁更加丰富的品质，并且产生了更多的营养物质。游离氨基酸含量、香气组分以及有机酸浓度显著增加，减少了豆薯本身具有的一些不良气味，保留了豆薯的独特风味。本研究结果可为开发益生菌发酵豆薯汁产品提供参考。
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